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通過(guò)質(zhì)譜法直接檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌群的δ-溶血素的方法

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通過(guò)質(zhì)譜法直接檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌群的δ-溶血素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及采用特定質(zhì)譜技術(shù)研究含有金黃色葡萄球菌菌群的樣品的方法,該方法能夠特異性地檢測(cè)在獲得的質(zhì)譜上存在或不存在m/z值為3005±5Th或3035±5Th的峰,并依據(jù)該結(jié)果作出相應(yīng)的決定。
【專利說(shuō)明】通過(guò)質(zhì)譜法直接檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌群的S-溶血素的方法
[0001]本發(fā)明涉及分析金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的【技術(shù)領(lǐng)域】。金黃色葡萄球菌是造成定殖和感染的細(xì)菌(Wertheim,Melles等人,2005),由占人口的20至30%的帶菌者攜帶。感染可以被分為兩大類型:涉及粘著因子“識(shí)別粘著基質(zhì)分子的微生物表面組分”或MSCRAMM(血纖蛋白原的結(jié)合蛋白(FnBP)、蛋白A、凝固酶等)的化膿性感染;和需要分泌外毒素的毒素性感染,其中最出名的外菌素是溶血素、Panton-Valentine殺白細(xì)胞素(PVL)、葡萄球菌腸毒素和剝脫性毒素(0tto2010)。所有的金黃色葡萄球菌菌株都不具有全部的毒力因子,并且這些因子在細(xì)菌生長(zhǎng)期間不會(huì)被同時(shí)表達(dá)。在指數(shù)生長(zhǎng)期,存在粘著因子的表達(dá),這是定殖和侵入宿主所需要的。相反,在指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)且在穩(wěn)定期過(guò)程中,大多數(shù)細(xì)菌表達(dá)破壞宿主細(xì)胞(其生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源)所需的毒素。金黃色葡萄球菌具有許多控制這些進(jìn)程的調(diào)節(jié)因子(Dufour, Jarraud等人,2002)。其中,“附屬基因調(diào)節(jié)子”(agr)系統(tǒng)是最重要的系統(tǒng)之一。
[0002]金黃色葡萄球菌的agr系統(tǒng)調(diào)節(jié)大量毒力基因和細(xì)菌的新陳代謝。其由基因座中分配在兩種趨異轉(zhuǎn)錄物RNA II和RNA III中的5個(gè)基因(agrBDCA和hid)組成。RNA II是操縱子P2的信使,其含有agrBDCA基因;RNA III含有hld,其為溶血素δ的基因。agrC編碼 組氨酸激酶,agrA是雙組分系統(tǒng)的受體。agrD編碼通過(guò)agrB加工成熟并分泌的肽。所產(chǎn)生的肽是一種自誘導(dǎo)肽,其激活刺激agrA的agrC。一旦其被激活,agrA受體通過(guò)各自的啟動(dòng)子P2和P3誘導(dǎo)RNA II和RNA III的轉(zhuǎn)錄。RNA III含有hid(—種編碼溶血素δ的基因),但首先是一種RNA調(diào)節(jié)子,該agr系統(tǒng)的真正的效應(yīng)子。因此,這種RNA III在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上都調(diào)節(jié)大量基因(Verdon, Girardin等人,2009 ;Felden, Vandenesch等人,2011)。誘導(dǎo)該agr系統(tǒng)功能失常的突變導(dǎo)致自溶素和溶血素的表達(dá)改變;以及對(duì)細(xì)菌表型的作用,尤其是在致病潛力中所涉及到的細(xì)菌表型(Schweizer, Furuno等人,2011)。
[0003]金黃色葡萄球菌的溶血素δ,也稱為δ -毒素或δ -溶素,由屬于agr系統(tǒng)的hid基因編碼。其定位在RNA III(agr系統(tǒng)的效應(yīng)子)內(nèi)。RNA III翻譯成溶血素δ被延遲(^ I小時(shí)),并在指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)發(fā)生(Balaban和Novickl995 ;Somerville, Cockayne等人,2003)。溶血素δ由此反映了 RNA III的轉(zhuǎn)錄,因此反映了 agr系統(tǒng)的功能性(Felden, Vandenesch等人,2011)。其屬于金黃色葡萄球菌的溶血毒素家族,并在細(xì)胞膜中產(chǎn)生孔。尤其是,其通過(guò)破壞細(xì)胞膜的磷脂造成人、兔、羊、馬、貓、雞的紅細(xì)胞等等的細(xì)胞裂解(Kreger, Kim等人,1971)。其還參與阻止生物膜的形成并參與在人嗜中性粒細(xì)胞中引發(fā)氧化應(yīng)激(Somerville, Cockayne等人,2003)。其由圖1中顯示的26種氨基酸組成并具有
2.9kDa的質(zhì)量(Fitton,Dell等人,1980)。其表現(xiàn)為兩種形式:1)在蛋氨酸殘基上的N-末端甲酰化形式,其為天然的并且為主要形式,在本文件中被命名為溶血素S jPii)脫甲酰化形式(Verdon, Girardin等人,2009)。通過(guò)酶鐵依賴性脫甲?;鸽拇_保脫甲?;?。在指數(shù)期和后指數(shù)期早期過(guò)程中,溶血素S被脫甲?;垣@得弱趨化實(shí)體(chemoattractingentity) (Somerville, Cockayne等人,2003)。在細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中,鐵濃度逐漸降低,導(dǎo)致脫甲?;富钚灾饾u降低。從而存在溶血素δ的累積,提供嗜中性粒細(xì)胞的趨化性;并誘發(fā)炎癥反應(yīng),其為將來(lái)細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物來(lái)源(Somerville, Cockayne等人,2003)。最后,已經(jīng)描述了多態(tài)性:在犬來(lái)源的菌株中發(fā)現(xiàn)了一種變體。其存在氨基酸的變化;在胰蛋白酶作用下消化降低;對(duì)羊紅血細(xì)胞的溶血潛力降低以及在低于25°C的溫度下溶血活性降低(Turnerl978)。在人來(lái)源的菌株中,在 Genebank?(Figueiredo, Jarraud 等人,2000)中描述了將位置10處的甘氨酸替換為絲氨酸(GlOS)的多態(tài)性類型,但是該突變的流行率是未知的。
[0004]根據(jù)研究,金黃色葡萄球菌的agr系統(tǒng)缺陷型菌株的出現(xiàn)頻率估計(jì)為15%至22%(Traber, Lee 等人,2008 ;Schweizer, Furuno 等人,2011 ;Tsuji, Maclean 等人,2011)。與社區(qū)MRSA相比,這些菌株在耐甲氧西林的醫(yī)院金黃色葡萄球菌(MRSA)中是更常見(jiàn)的(Tsuji, Maclean等人,2011)。但是,已經(jīng)在所有的agr基因池1、I1、III和IV中發(fā)現(xiàn)了agr缺陷型菌株,不支持克隆假設(shè)(Rose, Rybak等人,2007)。
[0005]這些菌株具有實(shí)際臨床相關(guān)性,因?yàn)樗鼈兪窃谝褜?duì)其施以最少操作的生物樣品中分離出來(lái)的,并且不是由于連續(xù)再植過(guò)程中發(fā)生的突變的結(jié)果(Traber,Lee等人,2008)。在agr系統(tǒng)功能異常與不存在溶血素δ之間已經(jīng)建立了不同的臨床聯(lián)系。
[0006]例如,在2011年,在2003年至2007年間進(jìn)行的處理814例金黃色葡萄球菌菌血癥的回顧性研究再次發(fā)現(xiàn)22%的菌株具有agr系統(tǒng)的功能異常。在18%的病例中,感染這些菌株的患者在30天內(nèi)死亡,而對(duì)于agr系統(tǒng)是功能性的菌株為12% (p = 0.03)。因此,對(duì)agr缺陷型金黃色葡萄球菌菌株感染能夠預(yù)測(cè)死亡率,靈敏度為30%、特異性為79%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為18%和陰性預(yù)測(cè)值為88% (Schweizer, Furuno等人,2011)。
[0007]此外,處理MRSA持續(xù)性菌血癥(BP)的回顧性臨床研究(即在超過(guò)7天的合適的抗生素療法下帶有MRSA的陽(yáng)性血培養(yǎng)物的存在率)表明,與消散型菌血癥(RB)相比,在持續(xù)性菌血癥(BP)的過(guò)程中更 頻繁地發(fā)現(xiàn)agr系統(tǒng)功能異常的MRSA菌株(通過(guò)在瓊脂糖上尋找溶血素S來(lái)體現(xiàn))(BP組中菌株為71.4%,RB組中菌株為38.9% ;p = 0.057)。因此,不產(chǎn)生溶血素δ (表明agr系統(tǒng)功能異常)可能是持續(xù)性菌血癥的標(biāo)志,需要加強(qiáng)管理(即最佳抗生素療法)(Fowler, Sakoulas等人,2004)。
[0008]還建立了與細(xì)菌自溶的聯(lián)系。agr系統(tǒng)控制許多基因尤其是IytS與IytR的表達(dá)。因此,agr系統(tǒng)的功能異常與在液體介質(zhì)中聚集體的形成;細(xì)胞表面的改變,變得粗糙和擴(kuò)散;以及自溶的傾向性有關(guān)(Brunskill和Baylesl996)。
[0009]Vuong等人,依他們的看法,已經(jīng)表明在對(duì)聚苯乙烯的粘附模型中,78%的agr-缺陷型菌株形成生物膜,而僅有6%的菌株表達(dá)agr。這一現(xiàn)象還通過(guò)加入agr抑制劑得以證實(shí)并似乎是由于溶血素δ的表面活性劑性能引起的(Vuong, Saenz等人,2000)。但是,由于生成生物膜要求agr系統(tǒng)功能異常,而生物膜的擴(kuò)散似乎依賴于agr系統(tǒng),強(qiáng)調(diào)agr系統(tǒng)缺陷型菌株與功能型菌株在慢性感染過(guò)程中可能共存(Boles和HOrswill2008)。累積的這些結(jié)果支持在慢性感染過(guò)程中或在血管內(nèi)設(shè)備上尋找agr-缺陷型菌株。
[0010]還建立了與囊腫性纖維化的聯(lián)系。在2000年,Goerke等人研究了 RNA III在從患有囊腫性纖維化的患者呼吸道樣品中分離的金黃色葡萄球菌菌株中的表達(dá)。顯示了agr-缺陷型菌株的優(yōu)勢(shì)。因此在囊腫性纖維化過(guò)程中agr系統(tǒng)的功能性對(duì)于定殖與感染而言不是必需的(Sakoulas, El1poulos 等人,2005)。
[0011]最后,還已經(jīng)報(bào)道了與糖肽耐藥表型(即糖肽中間型金黃葡萄糖球菌(Glycopeptide Intermediate Staphylococcus aureus), GISA)的聯(lián)系。被具有功能性agr系統(tǒng)的MRSA菌株感染的患者長(zhǎng)期服用(即超過(guò)9個(gè)月)萬(wàn)古霉素誘導(dǎo)溶血素δ表達(dá)減少,但后者不是被完全消除。在停止治療后,測(cè)量到溶血素δ的表達(dá)的顯著增加(Sakoulas, Gold等人,2006)。此外,agr系統(tǒng)功能異常的菌株表現(xiàn)出降低的萬(wàn)古霉素敏感性,盡管后者的藥效動(dòng)力學(xué)并未發(fā)生改變(Tsuji,Maclean等人,2011)。在2002年,Sakoulas等人證明了包括在他們實(shí)驗(yàn)室的GISA收集物中包括的所有菌株具有功能異常的agr系統(tǒng)(Sakoulas, El1poulos等人,2002)。在2005年,證實(shí)了異質(zhì)GISA表型的出現(xiàn)與agr系統(tǒng)缺陷型菌株長(zhǎng)期暴露于萬(wàn)古霉素之間的聯(lián)系。對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性的這種降低也與細(xì)菌裂解減少和對(duì)血小板抗微生物肽的敏感性較低相關(guān)(Sakoulas, El1poulos等人,2005)。這種關(guān)系也得到了 Rose等人的研究的證實(shí),Rose等人的研究表明agr-缺陷型菌株提高其對(duì)萬(wàn)古霉素的最低抑制濃度(MCI)的能力提高,并由此成為GISA。相反,用屬于另一類抗生素的另一種抗金黃色葡萄球菌抗生素達(dá)托霉素(daptomycin)并未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象(Rose, Rybak等人,2007)。由此證明溶血素δ的產(chǎn)生的缺乏可能是檢測(cè)趨向GISA表型或異質(zhì)性GISA表型的時(shí)間依賴性變化的早期標(biāo)志,特別是在用萬(wàn)古霉素治療期間(Fowler, Sakoulas 等人,2004)。
[0012]同樣,考慮到檢測(cè)溶血素δ的臨床益處,已經(jīng)描述了用于測(cè)量金黃色葡萄球菌的溶血素S的不同方法。可以提及溶血試驗(yàn)、在動(dòng)物模型上的生物測(cè)試、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、RNA 印跡(Northern blot)、測(cè)序和高效色譜法(HPLC)。
[0013]在溶血試驗(yàn)中,可以通過(guò)在抗溶血素α和β抗體的存在下測(cè)量在瓊脂糖上培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌株誘導(dǎo)的對(duì)血液的溶血作用,檢測(cè)溶血素S。還可以通過(guò)尋找溶血素δ與溶血素β之間的溶血協(xié)同作用來(lái)檢測(cè)溶血素δ (Verdon, Girardin等人,2009)。描述了不同的方法學(xué):Sakoulas等人使用由溶血素β誘導(dǎo)產(chǎn)生大面積溶血的RN4420金黃色葡萄球菌菌株來(lái)檢測(cè)溶血素δ。Schweitzer等人也已經(jīng)描述了一種派生方法學(xué)。這些方法容易進(jìn)行,但是需要進(jìn)行“專用”測(cè)試并具有主觀讀數(shù):尋找溶血協(xié)同作用,這有時(shí)難以觀察到。最后,與RNA印跡和與agr基因測(cè)序相比,這些測(cè)試可能受假陰性的影響(Traber,Lee等人,2008)。
[0014]以往,已經(jīng)使用了在動(dòng)物模型上的生物測(cè)試。在這種情況下,可以通過(guò)測(cè)量對(duì)小鼠或豚鼠的最小致死劑量(MLD)來(lái)檢測(cè)溶血素δ的活性。但是這需要大劑量(小鼠MLD =110mg/kg,豚鼠MLD = 30mg/kg)。另一方法學(xué)包括研究溶血素δ誘導(dǎo)兔皮膚壞死的能力。大約Img溶血素δ在24小時(shí)后誘導(dǎo)大的紅斑(直徑>28mm)和硬結(jié),在第3天(D+3)時(shí)形成壞死區(qū)。在較小劑量下還可以觀察到脫皮(Kreger, Kim等人,1971)。
[0015]還可以通過(guò)靶向RNA III的RT-PCR評(píng)估溶血素δ的表達(dá)。從菌株中提取總RNA,并進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR。為了使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化,Goerke等人使用編碼促旋酶(gyr)的管家基因,其表達(dá)是恒定的,與生長(zhǎng)階段無(wú)關(guān)。RNA III RT-PCR代表一種靈敏、特異性和定量的技術(shù)。但是,由于高污染風(fēng)險(xiǎn),其應(yīng)用僅限于專業(yè)實(shí)驗(yàn)室(Goerke, Campana等人,2000)。
[0016]通過(guò)使用靶向RNA III的RNA印跡可以間接檢測(cè)溶血素δ的表達(dá)(Kornblum, Projan 等人,1988 ;Goerke, Campana 等人,2000 ;Traber 和 Novick2006)。
[0017] 某些作者還使用了 agr基因座的完整測(cè)序以便鑒定可以解釋其功能異常的點(diǎn)狀突變(Traber 和 Novick2006)。[0018]還已經(jīng)使用了幾種HPLC技術(shù)。在2000年,Otto和Gotz描述了一種通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)量溶血素δ的定性和定量方法。將在胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉湯中制作的細(xì)菌培養(yǎng)物的上清液以19000g離心5分鐘。隨后在ImL的PHE ( “苯基衍生化的”)柱上通過(guò)HPLC分析上清液,并隨后用10至90%的溶劑B梯度洗脫,溶劑A是0.1 %的三氟乙酸(TFA) /水混合物,溶劑B是0.1 %的TFA/乙腈混合物。用具有214或280nm 二極管線陣列的UV光譜儀實(shí)現(xiàn)檢測(cè)(Otto和Gotz2000)。在2002年,Somerville等人,依他們的看法,描述了一種與Otto和Gotz的方法類似的方法學(xué),使用HPLC檢測(cè)和測(cè)量溶血素δ但是與具有電噴霧源的質(zhì)譜法檢測(cè)聯(lián)用。他們由此獲得了溶血素δ的天然與脫甲?;问降膍/z 為 3007Th(Thomson)和 2972Th(Somerville, Cockayne 等人,2003)。
[0019]在這種背景下,發(fā)明人著眼于一種研究金黃色葡萄球菌菌落的新方法,其有可能根據(jù)是否存在溶血素δ作出診斷和/或與是否存在溶血素δ建立關(guān)聯(lián)。這種方法應(yīng)當(dāng)快速和容易使用,并且尤其不需要任何提取蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。
[0020]本發(fā)明涉及采用質(zhì)譜技術(shù)研究含有金黃色葡萄球菌菌群的樣品的方法,其包括以下步驟:
[0021]a)使樣品與介質(zhì)接觸,以通過(guò)激光束的作用使樣品中存在的分子離子化,
[0022]b)用激光束離子化樣品中存在的分子,
[0023]c)通過(guò)電勢(shì)差加速獲得的離子化的分子,
[0024]d)使加速的離 子化分子在至少一個(gè)減壓管中自由運(yùn)動(dòng),
[0025]e)檢測(cè)至少一部分已自由運(yùn)動(dòng)的加速的離子化分子,以便測(cè)量它們穿過(guò)至少一個(gè)減壓管所花費(fèi)的時(shí)間并獲得對(duì)應(yīng)于給定時(shí)刻下檢測(cè)到的離子化分子的數(shù)量的信號(hào),
[0026]f)計(jì)算所檢測(cè)的分子的質(zhì)荷比(m/z),以便根據(jù)所檢測(cè)的分子的m/z比獲得對(duì)應(yīng)于具有相同質(zhì)荷比(m/z)的離子化分子的數(shù)量的信號(hào),
[0027]g)直接或間接地確定在步驟b)中獲得的離子化分子中是否存在質(zhì)荷比(m/z)等于3005±5Th或等于3035±5Th的離子化分子,
[0028]h)根據(jù)步驟g)中獲得的結(jié)果作出相應(yīng)的判斷。
[0029]根據(jù)第一替代實(shí)施方案,步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與分析的金黃色葡萄球菌菌群不存在溶血素δ及其變體GlOS關(guān)聯(lián)在一起的步驟。
[0030]具有序列SEQ ID N0.1 的溶血素 δ:XaaAQDIISTI⑶LVKWIIDTVNKFTKK,其中 Xaa =在N-末端位置甲?;牡鞍彼?,具有3005,6Th的質(zhì)子化單一同位素質(zhì)量(MH+)。
[0031]其具有序列SEQ ID N0.2 的變體:XaaAQDIISTISDLVKWIIDTVNKFTKK,其中 Xaa =在N-末端位置甲基化的蛋氨酸,具有3035,6Th的質(zhì)子化單一同位素質(zhì)量(MH+)。
[0032]根據(jù)第二替代實(shí)施方案,步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與分析的金黃色葡萄球菌菌群的agr系統(tǒng)(“附屬基因調(diào)節(jié)子”)的功能異常關(guān)聯(lián)在一起的步驟。
[0033]根據(jù)第三替代實(shí)施方案,分析的金黃色葡萄球菌菌群來(lái)自于患者的生物樣品,并且步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與對(duì)所述患者作出已知與agr系統(tǒng)功能異常有關(guān)的臨床診斷關(guān)聯(lián)在一起的步驟。
[0034]根據(jù)第四替代實(shí)施方案,分析的金黃色葡萄球菌菌群來(lái)自于患者的生物樣品,并且步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005 ±5Th的離子化分子和m/z等于3035 ±5Th的離子化分子與患者患有慢性感染的診斷關(guān)聯(lián)在一起的步驟?;谂R床生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)定義慢性感染,其是指在多達(dá)6個(gè)月前分離出具有與研究過(guò)程中的分離菌株相同的抗菌譜的金黃色葡萄球菌菌株。作為此類慢性感染的實(shí)例,可以提及骨關(guān)節(jié)感染、慢性糖尿病足感染、可植入血管設(shè)備上的感染。
[0035]根據(jù)第五替代實(shí)施方案,步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與將分析的金黃色葡萄球菌菌群分類為具有表現(xiàn)出糖肽敏感性降低的風(fēng)險(xiǎn)(即GISA)關(guān)聯(lián)在一起的步驟。
[0036]可以應(yīng)用本發(fā)明的方法的樣品可以是生物來(lái)源的,特別是動(dòng)物或人類來(lái)源的。其可以對(duì)應(yīng)于生物流體樣品(例如全血、血清、血漿、尿液、腦脊髓液、有機(jī)分泌物),對(duì)應(yīng)于組織樣品或?qū)?yīng)于分離的細(xì)胞。該樣品可以原樣使用,或在研究前可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法施以富集或培養(yǎng)類型的制備。
[0037]在本發(fā)明的范圍內(nèi),待研究的樣品對(duì)應(yīng)于包含菌群的細(xì)胞培養(yǎng)基,不對(duì)應(yīng)于在提取或提純步驟后獲得的一種或多種蛋白質(zhì)。優(yōu)選地,研究的樣品含有菌群,即其含有至少10個(gè)細(xì)菌。
[0038]檢測(cè)尤其可以由來(lái)源于生物樣品的細(xì)菌培養(yǎng)物的肉湯或由血液培養(yǎng)物進(jìn)行。通常,質(zhì)譜獲自從瓊脂糖上的細(xì)菌培養(yǎng)物獲得的樣品。 [0039]細(xì)胞培養(yǎng)物直接懸浮在基質(zhì)中或懸浮在基質(zhì)上。此類技術(shù)被稱為對(duì)全細(xì)胞的質(zhì)譜法(WC-MS,“全細(xì)胞質(zhì)譜法”),并可以在沒(méi)有任何事先的、乏味的和耗時(shí)的提取程序的情況下進(jìn)行。該技術(shù)過(guò)去已經(jīng)被廣泛用于細(xì)菌鑒定,但是考慮到樣品的復(fù)雜性,其在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用極為有限。在大多數(shù)情況下,指定對(duì)應(yīng)于通過(guò)WC-MS獲得的表達(dá)譜(profile)的蛋白質(zhì)是未知或不明確的。僅通過(guò)比較蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行細(xì)菌鑒定,而不知道這些表達(dá)譜的蛋白質(zhì)組成(即峰與蛋白質(zhì)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系)(Welker和Moore2011)。但是,某些作者已經(jīng)提出使用這種方法學(xué)檢測(cè)生物標(biāo)志物和/或在細(xì)菌致病機(jī)制中所涉及的毒力因子(Bizzini和Greub2010)。對(duì)于金黃色葡萄球菌而言,某些作者已經(jīng)表示,有可能將MSSA與MRSA區(qū)分開(kāi)。但是,所用的菌株收集物有限(n= 10個(gè)菌株),并需要使用初步程序來(lái)制備樣品(即化學(xué)和機(jī)械提取)(Edwards-Jones, Claydon等人,2000)。其它作者已經(jīng)指出有可能檢測(cè)金黃色葡萄球菌的PVL(Bittar, Ouchenane等人,2009)。但是,這些結(jié)果證明是非特異性的,并可能反映屬于分析菌株收集物的相同克隆(Dauwalder, Carbonnelle等人,2010 ;Szabados, Becker 等人,2011)。
[0040]在本發(fā)明的范圍內(nèi),發(fā)明人由此以完全預(yù)料不到的方式證明,在獲得的質(zhì)譜上存在具有m/z值等于3005±5Th或3035±5Th的峰以及不存在位于3005±5Th和位于3035±5Th的峰可以分別與存在和不存在溶血素δ或其變體相關(guān)聯(lián),并因此有可能作出臨床診斷。
[0041 ] 優(yōu)選地,在本發(fā)明的方法的范圍內(nèi),不考慮應(yīng)用的替代方案,有利地是,對(duì)含有10至19個(gè)細(xì)菌、優(yōu)選15至16個(gè)細(xì)菌的細(xì)菌群的樣品實(shí)施質(zhì)譜法。如果將施以質(zhì)譜法的樣品沉積在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖培養(yǎng)基上以便在35±2°C下孵育18至48小時(shí)后生長(zhǎng)金黃色葡萄球菌,則細(xì)菌數(shù)量將與菌落形成單位(CFU)的計(jì)數(shù)同化。
[0042]以一般方式,在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以使用任何采用測(cè)量飛行時(shí)間的基質(zhì)輔助解吸-離子化質(zhì)譜法。
[0043]根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案,使用的質(zhì)譜法使基質(zhì)輔助解吸和離子化/飛行時(shí)間(MALD1-T0F)質(zhì)譜法(MS),其特別具有相對(duì)簡(jiǎn)單應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。
[0044]根據(jù)另一具體實(shí)施方案,使用的質(zhì)譜法是MALD1-T0F-T0F串聯(lián)MS,其根據(jù)飛行時(shí)間具有兩次連續(xù)的分離,并且特別具有特異性極佳的優(yōu)點(diǎn)。
[0045]在其離子化之前,樣品優(yōu)選與基質(zhì)接觸。
[0046]所用基質(zhì)有利地含有選自3,5_ 二甲氧基-4-羥基肉桂酸(即芥子酸或白芥子酸)氰基-4-羥基肉桂酸(即^-氰基、^-基質(zhì)或0?^),阿魏酸和2,5_二羥基苯甲酸(即DHB)中的化合物。
[0047]存在幾種可以在本發(fā)明范圍內(nèi)用于使樣品與基質(zhì)接觸的沉積技術(shù):在干基質(zhì)層上沉積,所謂“薄層”沉積;用基質(zhì)液滴沉積,所謂“干液滴”沉積;在基質(zhì)層上沉積,隨后添加基質(zhì)液滴,所謂“夾心(Sandwich) ”沉積。
[0048]通常,基質(zhì)是光敏性的并在樣品存在下結(jié)晶,同時(shí)保持分子的完整性。此類基質(zhì),尤其是適于MS MALD1-T0F的,是公知的,并選自:3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸;α-氰基-4-羥基肉桂酸,阿魏酸和2,5- 二羥基苯甲酸。許多其它化合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。甚至存在液體基質(zhì),其既不會(huì)在大氣壓下結(jié)晶,甚至也不會(huì)在真空中結(jié)晶(Tholey和Heinzle2006)o可以使用允許樣品分子在激光束作用下離子化的任何其它化合物。值得注意的是,靶標(biāo),即樣品沉積在其上的載體,可以直接起到基質(zhì)的作用,類似“納米輔助激光解吸/離子化” (NALD I)或“硅上解吸/離子化” (D1S)技術(shù)的情況。激光束可以具有促進(jìn)基質(zhì)升華或蒸發(fā)的任何類型的波長(zhǎng)。優(yōu)選使用紫外或甚至紅外波長(zhǎng)。
[0049]在基質(zhì)中,將此類化合物溶解,最通常使用水,優(yōu)選具有“超純”質(zhì)量的水,或溶于水/有機(jī)溶劑混合物中。作為常規(guī)使用的有機(jī)溶劑的實(shí)例,可以提及丙酮、乙腈、甲醇或乙醇,有時(shí)可以加入三氟乙酸(TFA)。基質(zhì)實(shí)例例如由含20mg/mL芥子酸的乙腈/水/TFA的50/50/0.1 (v/v)混合物組成。有機(jī)溶劑使樣品中存在的疏水性分子溶解在該溶液中,而水允許親水性分子溶解。諸如TFA的酸的存在通過(guò)捕獲質(zhì)子(H+)促進(jìn)樣品分子的離子化。
[0050]優(yōu)選地,將樣品沉積在稱為靶標(biāo)的載體上,最通常以斑點(diǎn)的形式。可以將基質(zhì)直接沉積在樣品上并隨后與樣品混合。
[0051]任選地,本發(fā)明的方法在步驟b)之前進(jìn)一步包括使樣品分子被吸附在其上或其中的基質(zhì)結(jié)晶的步驟。
[0052]通常,結(jié)晶基質(zhì)通過(guò)使其中或其上沉積有樣品分子的基質(zhì)干燥來(lái)獲得。
[0053]根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案,與樣品接觸的基質(zhì)相當(dāng)于沉積在靶標(biāo)上的適于MALDI MS的基質(zhì),并且該方法在步驟b)之前包括獲得樣品分子被吸附在其上或其中的基質(zhì)的結(jié)晶。在這種情況下,基質(zhì)優(yōu)選含有選自3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸、阿魏酸和2,5- 二羥基苯甲酸中的化合物。
[0054]可以預(yù)先將樣品在肉湯中或在瓊脂糖上培養(yǎng)以使其富含金黃色葡萄球菌細(xì)菌。此類培養(yǎng)基瓊脂糖或肉湯是本領(lǐng)域人員公知的。例如,可以提及含有(馬或羊)血的瓊脂糖;
哥倫比亞瓊脂糖;Polyvitex'K “巧克力”瓊脂糖;來(lái)自b1Merieux的用于尋找金黃色葡萄球菌的ChromID Staph顯色瓊脂糖等等。在瓊脂糖上的富集是特別有利的,因?yàn)橛锌赡塬@得可以沉積在靶標(biāo)上的金黃色葡萄球菌的純菌落。隨后例如通過(guò)將樣品留置在例如17至300C的溫度下、尤其是在室溫(22°C )下幾分鐘(例如5分鐘至2小時(shí)),從而將基質(zhì)中存在的溶劑蒸發(fā)。溶劑蒸發(fā)允許樣品分布于其中的基質(zhì)結(jié)晶。接著,對(duì)放置在結(jié)晶基質(zhì)內(nèi)的樣品施以溫和離子化。優(yōu)選用發(fā)射337.1nm的UV光束的氮激光器實(shí)現(xiàn)這種離子化。
[0055]在離子化過(guò)程中,通過(guò)激光對(duì)樣品施以激發(fā)?;|(zhì)晶體隨后吸收光子能量,該能量的釋放造成基質(zhì)升華、樣品解吸和出現(xiàn)處于被描述為等離子體的狀態(tài)的材料。在這種等離子體內(nèi),基質(zhì)與樣品分子之間發(fā)生電荷交換。例如,質(zhì)子可以從基質(zhì)中脫離并轉(zhuǎn)移至樣品的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)移至樣品的肽。該步驟允許溫和離子化生物分子,而不會(huì)增加它們的破壞程度。樣品由此釋放不同大小的離子。后者隨后通過(guò)電場(chǎng)加速并在減壓管(稱為飛行管)中自由飛行。在離子化過(guò)程中和在加速生成的離子的過(guò)程中施加的壓力通常為10_6至10_9毫巴(mbar)。最小的離子隨后將比較大的離子更快速地“行進(jìn)”,由此能夠?qū)⑺鼈兎蛛x。檢測(cè)器位于飛行管末端。使用離子所花費(fèi)的飛行時(shí)間(或T0F)來(lái)計(jì)算它們的質(zhì)量。由此,獲得質(zhì)譜,代表根據(jù)撞擊檢測(cè)器的分子的m/z比對(duì)應(yīng)于具有相同質(zhì)荷比(m/z)的離子化分子的數(shù)量的信號(hào)強(qiáng)度。質(zhì)荷比(m/z)以Th (Thomsons)表示。一旦被引入到質(zhì)譜儀中,非??焖俚孬@得樣品的質(zhì)譜,通常在不到一分鐘的時(shí)間內(nèi)。
[0056]可以在MALD1-TOF MS之前通過(guò)測(cè)試或同時(shí)借助于MALD1-TOF MS譜來(lái)確定分析的樣品實(shí)際含有金黃色葡萄球菌細(xì)菌的事實(shí)。在此情況下,將總MALD1-TOF MS譜(其通常包含70至200個(gè)峰)與光譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較,其提供確定分析的細(xì)菌群是否實(shí)際對(duì)應(yīng)于金黃色葡萄球菌的可能性。這種比較基于使用不同的算法(這取決于供應(yīng)商),并由此實(shí)現(xiàn)細(xì)菌鑒定(Cherkaoui, Hibbs 等人,2010 ;ffelker 和 Moore2011)。
[0057]上文詳細(xì)描述的所有實(shí)施方案均適用,而不考慮使用的質(zhì)譜技術(shù),特別是MALD1-TOF 或 MALD1-T0F-T0F 類型。 [0058]當(dāng)所用質(zhì)譜法是MALD1-TOF MS時(shí),步驟g)的確定優(yōu)選從獲得的質(zhì)譜上存在m/z值等于3005±5Th或3035±5Th的峰或不存在3005±5Th和3035 ±5Th的峰來(lái)直接推斷出。
[0059]當(dāng)所用的質(zhì)譜法是MALD1-T0F-T0F MS時(shí),在步驟d)中優(yōu)選使離子化分子)在第一減壓管中運(yùn)動(dòng),選擇具有m/z等于3005±5Th的質(zhì)量和/或具有m/z等于3035±5Th的質(zhì)量的離子,這些離子化分子在它們碎片化(例如通過(guò)碰撞)后再次被加速,使碎片化的或未碎片化的離子化分子在第二管中自由運(yùn)動(dòng)。
[0060]采用MALD1-TOF-TOF MS,步驟g)的確定優(yōu)選由下列y和b離子碎片中存在至少5種碎片、優(yōu)選至少10種碎片來(lái)間接地推斷:
[0061]-對(duì)于3005±5Th處的峰,具有以下質(zhì)量的y離子碎片:147.113,275.208、376.255,523.324,651.419,765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773、1492.852,1620.947,1720.016,1833.100,1948.127,2005.148,2118.232,2219.280、2306.312、2419.396、2532.480、2647.507、2775.565、2846.603 和 2976.635,公差為±1.5Th ;以及具有以下質(zhì)量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247、671.331,758.363,859.410,972.494,1029.516,1144.543,1257.627,1356.695,1484.790、1670.870,1783.954,1897.038,2012.065,2113.112,2212.181,2326.224,2454.319、2601.387,2702.435,2830.530 和 2958.625,公差為 ± 1.5Th,和 / 或
[0062]-對(duì)于3035±5Th處的峰,具有以下質(zhì)量的y離子碎片:147.113,275.208、376.255,523.324,651.419,765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773、1492.852,1620.947,1720.016,1833.100,1948.127,2035.159,2148.243,2249.290、2336.322、2449.406、2562.491、2677.517、2805.576、2876.613 和 3006.646,公差為±1.5Th ;以及具有以下質(zhì)量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247、671.331,758.363,859.410,972.494,1059.526,1174.553,1287.638,1386.706,1514.801、1700.880,1813.964,1927.048,2042.075,2143.123,2242.191,2356.234,2484.329、2631.398,2732.445,2860.540 和 2988.635,公差為 ± 1.5Th。
[0063]根據(jù)本發(fā)明可以使用的MALD1-TOF質(zhì)譜法可以特別包括下列連續(xù)步驟以獲得質(zhì)譜:
[0064]-將待研究的樣品放置在基質(zhì)表面或基質(zhì)中,所述基質(zhì)適合于根據(jù)飛行時(shí)間的基質(zhì)輔助解吸-離子化質(zhì)譜法,
[0065]-獲得其上或其中吸附有樣品分子的基質(zhì)的結(jié)晶,
[0066]-借助激光束將結(jié)晶的基質(zhì)/樣品混合物離子化,
[0067]-借助電勢(shì)差加速獲得的離子化分子,
[0068]-使加速的離子化分子在減壓管中自由運(yùn)動(dòng),
[0069]-在管出口處檢測(cè)離子化分子,以便測(cè)量它們通過(guò)減壓管所花費(fèi)的時(shí)間并獲得對(duì)應(yīng)于給定時(shí)刻下到達(dá)檢測(cè)器的離子化分子的數(shù)量的信號(hào),
[0070]-計(jì)算所檢測(cè)的分子的質(zhì)荷比(m/z),以便根據(jù)所檢測(cè)的分子的m/z比獲得對(duì)應(yīng)于具有相同質(zhì)荷比(m/z)的離子化分子的數(shù)量的信號(hào)。
[0071]通常,考慮到所用質(zhì)譜儀的初步校準(zhǔn),以關(guān)聯(lián)離子化分子的質(zhì)荷比(m/z)與減壓管中的飛行時(shí)間的方程式形式獲得m/z比的計(jì)算。
[0072]可以在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的MALD1-TOF MS是基于暴露于電場(chǎng)的具有不同電荷與不同質(zhì)量的離子由A點(diǎn)行進(jìn)至B點(diǎn)的時(shí)間的測(cè)量。該行進(jìn)時(shí)間的測(cè)量取決于離子的質(zhì)量和電荷,由此允許其分離(Welker和Moore2011)。
[0073]可以在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的MALD1-T0F-T0F方法可以特別包括下列步驟以便獲得質(zhì)譜:
[0074]-將待研究的樣品放置在適于MALD1-TOF-TOFMS的基質(zhì)表面或基質(zhì)中,
[0075]-使在其上或其中吸附有樣品分子的基質(zhì)結(jié)晶,
[0076]-借助激光束將結(jié)晶的基質(zhì)/樣品混合物離子化,
[0077]-借助電勢(shì)差加速獲得的離子化分子,
[0078]-使加速的離子化分子在第一減壓管中自由運(yùn)動(dòng),
[0079]-在通過(guò)第一管后,選擇具有待碎片化的分子離子的質(zhì)量的離子化分子,并除去所有其它離子,例如借助于靜電偏轉(zhuǎn)器,
[0080]-使離子化分子碎片化,任選借助于惰性氣體來(lái)進(jìn)行,
[0081]-例如借助電勢(shì)柵格再次提高電勢(shì)以便加速離子化分子,以便向碎片離子和向前體離子提供不同的動(dòng)能,
[0082]-使碎片化或未碎片化的離子化分子在第二減壓管中自由運(yùn)動(dòng),
[0083]- 在該管出口處檢測(cè)離子化分子,以便測(cè)量它們通過(guò)減壓管所花費(fèi)的時(shí)間并獲得對(duì)應(yīng)于給定時(shí)刻下到達(dá)檢測(cè)器的離子化分子的數(shù)量的信號(hào),[0084]-計(jì)算所檢測(cè)的分子的質(zhì)荷比(m/z),以便根據(jù)所檢測(cè)的分子的m/z比獲得對(duì)應(yīng)于具有相同質(zhì)荷比的離子化分子(m/z)的數(shù)量的信號(hào)。
[0085]通常,考慮到所用質(zhì)譜儀的初步校準(zhǔn),以關(guān)聯(lián)離子化分子的質(zhì)荷比(m/z)與減壓管中的飛行時(shí)間的方程式形式計(jì)算m/z比。前體離子的質(zhì)量可用于實(shí)現(xiàn)這種校準(zhǔn)。
[0086]任何類型的MALD1-TOF或MALD1-T0F/T0F質(zhì)譜儀可用于產(chǎn)生質(zhì)譜。此類光譜儀包括:
[0087]i)用于離子化樣品/基質(zhì)混合物的離子化源(通常為UV激光器);
[0088]ii)通過(guò)施加電勢(shì)差的使離子化分子加速的加速器,
[0089]iii)加速的離子化分子在其中運(yùn)動(dòng)的減壓管,
[0090]iv)用于根據(jù)它們的質(zhì)荷比(m/z)分離形成的分子離子的質(zhì)量分析儀;
[0091]V)用于測(cè)量由分子離子直接產(chǎn)生的信號(hào)的檢測(cè)器。
[0092]MALD1-TOF-TOF質(zhì)譜儀與MALD1-TOF質(zhì)譜儀相同,區(qū)別僅在于減壓管被分為位于彼此延伸部的兩個(gè)部分(在本文中也稱為第一減壓管和第二減壓管)。這種幾何形狀允許兩次連續(xù)地根據(jù)飛行時(shí)間分離分子離子:第一減壓管允許選擇將在該管的第二部分中分離為碎片的分子離子。碎片指的是通過(guò)破碎所選分子離子獲得的任何分子結(jié)構(gòu)。
[0093]可以在初始 離子化過(guò)程中或在位于管的上述兩部分之間的碰撞室中獲得離子的碎片化。在初始離子化過(guò)程中,可以直接由被分子吸收的激光束能量進(jìn)行碎片化,或者通過(guò)分子等離子體中的中性或離子化分子之間的碰撞進(jìn)行碎片化。如果在加速離子的階段之前發(fā)生碎片化,碎片根據(jù)它們各自的質(zhì)量移動(dòng)。如果碎片化發(fā)生在加速階段,所謂亞穩(wěn)離子的分離較差。如果碎片化在初始加速后發(fā)生,碎片離子及其離子化的母體分體(前體離子)具有相同的動(dòng)能并以相同的速度移動(dòng)。后一種類型的碎片化,稱之為源后碎片化,用于MALD1-TOF-TOF MS技術(shù)。該管的第一部分(或在本文中還被稱為第一減壓管)可能選擇包含感興趣的前體離子質(zhì)量并受到質(zhì)量差(mass delta, delta de masse)的限制的質(zhì)量窗。前體離子及其碎片隨后在減壓管的兩部分之間再次被加速。離子隨后根據(jù)其質(zhì)量獲得動(dòng)能。它們最終根據(jù)其各自的質(zhì)量移動(dòng)到減壓管的第二部分(或在本文中還被稱為第二減壓管)中。由此可能檢測(cè)給定的前體離子生成的全部碎片。
[0094]這種方法的一個(gè)替代方案包括在減壓管的兩部分之間的碰撞室中加入惰性氣體,如氬氣。離子化分子隨后在與惰性氣體碰撞時(shí)發(fā)生碎片化。它們隨后可以如前所述被加速和分離。
[0095]MALDI T0F/T0F MS優(yōu)選地在肽鍵附近使蛋白質(zhì)碎片化,根據(jù)通常命名法(Paizs和Suhai2005)其基本上生成類型b和類型y的離子。其它碎片也是可能的,亞銨離子、碎片a
坐坐寸寸ο
[0096]本領(lǐng)域技術(shù)人員習(xí)慣使用碎片峰生成關(guān)于蛋白質(zhì)的氨基酸序列的信息并試圖鑒定該蛋白質(zhì)序列。他/她為此特別使用諸如來(lái)自Matrix Science (倫敦,英國(guó))的Mascot的軟件包。
[0097]由此,SEQ ID N0.1的溶血素δ將主要導(dǎo)致:
[0098]?具有以下質(zhì)量的 y 離子碎片:147.113,275.208,376.255,523.324,651.419、765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773,1492.852,1620.947、1720.016,1833.100,1948.127,2005.148,2118.232,2219.280,2306.312,2419.396、2532.480,2647.507,2775.565,2846.603 和 2976.635 ;
[0099]?具有以下質(zhì)量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247、671.331,758.363,859.410,972.494,1029.516,1144.543,1257.627,1356.695,1484.790、1670.870,1783.954,1897.038,2012.065,2113.112,2212.181,2326.224,2454.319、2601.387,2702.435,2830.530 和 2958.625。
[0100]而且,SEQ ID N0.2的溶血素δ GlOS將主要導(dǎo)致:
[0101]?具有以下質(zhì)量的 y 離子碎片:147.113,275.208,376.255,523.324,651.419、765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773,1492.852,1620.947、1720.016,1833.100,1948.127,2035.159,2148.243,2249.290,2336.322,2449.406、2562.491,2677.517,2805.576,2876.613 和 3006.646 ;
[0102]?和具有以下質(zhì)量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247、671.331,758.363,859.410,972.494,1059.526,1174.553,1287.638,1386.706,1514.801、1700.880,1813.964,1927.048,2042.075,2143.123,2242.191,2356.234,2484.329、2631.398,2732.445,2860.540 和 2988.635。
[0103]結(jié)合附圖,該實(shí)施例在下文中闡述本發(fā)明,但是不具有限制性。
[0104]圖1描述了溶血素δ的一級(jí)序列(Fitton,Dell等人,1980)。 [0105]圖2顯示了采用MALDI TOF MS檢測(cè)來(lái)自金黃色葡萄球菌的同基因菌株的溶血素
δ ο
[0106]圖3研究了培養(yǎng)期(18至48小時(shí))對(duì)采用MALDI TOF MS檢測(cè)3種同基因菌株和2種臨床菌株的溶血素δ的作用。
[0107]圖4顯示了采用MALDI TOF MS檢測(cè)來(lái)自金黃色葡萄球菌的臨床菌株的溶血素δ及其變體GlOS。
實(shí)施例
[0108]1.設(shè)備
[0109]?基質(zhì)
[0110]使用即用型α -氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質(zhì)(代號(hào)411071,b1Merieux, Marcy I’ Etoile,法國(guó))。
[0111]?靶標(biāo)和內(nèi)部對(duì)照物
[0112]使用一次性祀標(biāo)Vitek MS DS'_ (代號(hào) 410893b1M6rieux, Marcy I’ Etoile,法國(guó))。在每次分析時(shí)使用ATCC8739大腸桿菌(Escherichia coli)菌株以便允許校準(zhǔn)并檢查質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)的有效性。
[0113]?沉積物類型
[0114]金黃色葡萄球菌菌株以菌落尖端(colony spike,pointe de colonie)的薄涂片形式(薄層形式的涂片)沉積。該涂片在室溫下干燥5至15分鐘。隨后沉積一微升CHCA基質(zhì)并隨后在室溫下干燥大約5至15分鐘。
[0115]MALDI TOF 質(zhì)譜儀
[0116]使用MALDI TOF類型質(zhì)譜儀,型號(hào) Axima Assurance?,來(lái)自 Shimadzu, Champs surMarne,法國(guó)。
[0117]?在MALDI TOF質(zhì)譜儀上分析過(guò)程中使用的參數(shù)設(shè)定
[0118]在分析金黃色葡萄球菌菌株的過(guò)程中,使用質(zhì)譜儀的下列調(diào)節(jié)參數(shù):
[0119]-質(zhì)量的檢測(cè)范圍:2000-20000Th
[0120]-激光功率:80伏
[0121]-激光頻率:50赫茲
[0122]-激光類型:N2
[0123]-質(zhì)譜儀模式:線性,正離子
[0124]-提取功率:8330Th
[0125]-激活的“自檢(self-quality,auto qualit6) ” 模式
[0126]-最小強(qiáng)度:1OmV
[0127]-最小信噪比:10
[0128]-最小可接受分辨 率:300
[0129]-擊中次數(shù):5擊中 / 峰(profiles, profils)
[0130]-每譜圖峰數(shù)量:100
[0131]?軟件包
[0132]借助Sirweb-Mald1- Tof? 版本 11 軟件包(I2A, Peyrols,法國(guó))或Target IVI an age 版本 1.12 軟件包(b1M6rieux, Marcy I’ Etoile,法國(guó))進(jìn)行板計(jì)劃
(plate plans, Ies plans de plaque)。質(zhì)譜儀通過(guò)LaunchPad?,版本 2.8.4.20081127 軟件
包(Shimadzu, Champs sur Marne,法國(guó))驅(qū)動(dòng)。
[0133]2.方法學(xué)
[0134]?分析前參數(shù)
[0135]在有氧氣氛、35±2 °C下在含有馬血的瓊脂糖(TSH,代號(hào)43061,b1Merieux, Marcy I’ Etoile,法國(guó))上傳代培養(yǎng)18至24小時(shí)后進(jìn)行菌株分析。
[0136]使用由聚乙二醇PEG(3000)組成的質(zhì)譜法校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品在2800至3200m/z范圍內(nèi)進(jìn)行質(zhì)譜儀的初始校準(zhǔn)(除了用于細(xì)菌鑒定的校準(zhǔn)之外)。
[0137]?分析參數(shù)
[0138]根據(jù)細(xì)菌鑒定過(guò)程中常規(guī)使用的“涂片技術(shù)”由菌落尖端在一次性靶標(biāo)上生成沉積物。
[0139]在室溫下干燥5-15分鐘。
[0140]在之前的沉積物上添加I μ L CHCA基質(zhì)。
[0141]干燥5-15分鐘。
[0142]通過(guò)Sirweb-Mald1- Tof 或 Target Manager'' 軟件包生成“板計(jì)劃”。
[0143]采用MALDI TOF MS 通過(guò)控制質(zhì)譜儀 Axima Assurance'1 的 Launchpad軟件包啟
動(dòng)分析。
[0144]3.結(jié)果
[0145]a.檢測(cè)的驗(yàn)證[0146]1.使用金黃色葡萄球菌的同基因菌株
[0147]對(duì)通過(guò)agr基因座的等位置換獲得的agr/rnalll/hld系統(tǒng)的等基因菌株的分析有可能證實(shí)具有功能性agr系統(tǒng)的菌株在3005±5Th處存在峰。相反,除突變的agr系統(tǒng)之外與先前的親本菌株相同的等基因菌株在3005±5Th處沒(méi)有任何峰。受試RN6390菌株具有功能性agr系統(tǒng),并且是溶血素δ的一個(gè)產(chǎn)生者;菌株LUG950衍生自RN6390菌株,其中編碼RNAIII的基因是無(wú)效的:該菌株對(duì)合成溶血素δ是缺陷型的;RN6911菌株是通過(guò)完全刪除RN6390菌株的agr基因座(RNA II和RNA III)獲得的菌株:該菌株對(duì)合成溶血素δ是缺陷型的。表1和圖2概括了獲得的結(jié)果。圖2顯示了用三種受試菌株獲得的包含2800至3200之間的m/z比的WC MALD1-TOF MS質(zhì)譜。
[0148]表1:采用WC-MALDI TOF MS以及通過(guò)對(duì)同基因菌株收集物研究在瓊脂糖培養(yǎng)基中的溶血來(lái)檢測(cè)溶血素δ
[0149]
【權(quán)利要求】
1.通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)研究含有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)菌群的樣品的方法,包括以下步驟: a)使樣品與介質(zhì)接觸,以通過(guò)激光束的作用使樣品中存在的分子離子化, b)用激光束離子化樣品中存在的分子, c)通過(guò)電勢(shì)差加速獲得的離子化分子, d)使加速的離子化分子在至少一個(gè)減壓管中自由運(yùn)動(dòng), e)檢測(cè)至少一部分已自由運(yùn)動(dòng)的加速的離子化分子,以便測(cè)量它們穿過(guò)至少一個(gè)減壓管所花費(fèi)的時(shí)間并獲得對(duì)應(yīng)于給定時(shí)刻下檢測(cè)到的離子化分子的數(shù)量的信號(hào), f)計(jì)算所檢測(cè)的分子的質(zhì)荷比(m/z),以便根據(jù)所檢測(cè)的分子的m/z比獲得對(duì)應(yīng)于具有相同質(zhì)荷比(m/z)的離子化分子的數(shù)量的信號(hào), g)直接或間接地確定在步驟b)中獲得的離子化分子中是否存在質(zhì)荷比(m/z)等于3005±5Th或等于3035±5Th的離子化分子, h)根據(jù)步驟g)中獲得的結(jié)果作出相應(yīng)的判斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005 ±5Th的離子化分子和m/z等于3035 ±5Th的離子化分子與分析的金黃色葡萄球菌菌群不存在溶血素S及其變體GlOS關(guān)聯(lián)在一起的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005 ±5Th的離子化分子和m/z等于3035 ±5Th的離子化分子與分析的金黃色葡萄球菌菌群的agr( “附屬基因調(diào)節(jié)子”)系統(tǒng)的功能異常關(guān)聯(lián)在一起的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:分析的金黃色葡萄球菌菌群來(lái)自于患者的生物樣品,以及步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與對(duì)所述患者作出已知與agr系統(tǒng)功能異常相關(guān)的臨床診斷關(guān)聯(lián)在一起的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法,其特征在于:分析的金黃色葡萄球菌菌落來(lái)自于患者的生物樣品,以及步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035±5Th的離子化分子與患者患有慢性感染的診斷關(guān)聯(lián)在一起的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法,其特征在于:步驟h)對(duì)應(yīng)于將不存在m/z等于3005±5Th的離子化分子和m/z等于3035 ±5Th的離子化分子與將分析的金黃色葡萄球菌菌群分類為具有表現(xiàn)出糖肽敏感性降低的風(fēng)險(xiǎn)(即GISA)關(guān)聯(lián)在一起的步驟。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法,其特征在于:對(duì)含有10至19個(gè)細(xì)菌、優(yōu)選15至16個(gè)細(xì)菌的細(xì)菌群的樣品實(shí)施質(zhì)譜法。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求之一所述的方法,其特征在于:所用質(zhì)譜法是采用基質(zhì)輔助解吸離子化并測(cè)量飛行時(shí)間(MALD1-T0F)的質(zhì)譜法(MS)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于:步驟g)的確定由在獲得的質(zhì)譜上存在m/z值等于3005±5Th或等于3035±5Th的峰或不存在3005±5Th和3035±5Th的峰直接推斷出。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至7之一所述的方法,其特征在于:所用的質(zhì)譜法是MALDIT0F/T0F質(zhì)譜法。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其特征在于:在步驟d)中,使離子化分子在第一減壓管中運(yùn)動(dòng),選擇m/z等于3005±5Th和/或m/z等于3035±5Th的離子,這些離子化分子在其碎片化后再次被加速,并且使碎片化的或未碎片化的離子化分子在第二管中自由運(yùn)動(dòng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法,其特征在于:步驟g)的確定由在下列y和b離子碎片中存在至少5種碎片間接推斷出: -對(duì)于3005±5Th處的峰,具有以下質(zhì)量的y離子碎片:147.113,275.208,376.255、523.324,651.419,765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773,1492.852、1620.947,1720.016,1833.100,1948.127,2005.148,2118.232,2219.280,2306.312、2419.396,2532.480,2647.507,2775.565,2846.603 和 2976.635 ;以及以下質(zhì)量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247,671.331,758.363,859.410,972.494、1029.516,1144.543,1257.627,1356.695,1484.790,1670.870,1783.954,1897.038、2012.065,2113.112,2212.181,2326.224,2454.319,2601.387,2702.435,2830.530 和2958.625,公差為 ± 1.5Th,和 / 或 -對(duì)于3035±5Th處的峰,具有以下質(zhì)量的y離子碎片:147.113,275.208,376.255、523.324,651.419,765.462,864.530,965.578,1080.605,1193.689,1306.773,1492.852、1620.947,1720.016,1833.100,1948.127,2035.159,2148.243,2249.290,2336.322、2449.406,2562.491,2677.517,2805.576,2876.613 和 3006.646 ;以及以下質(zhì)量的 b 離子碎片:131.040,202.077,330.136,445.163,558.247,671.331,758.363,859.410,972.494、1059.526,1174.553,1287.638,1386.706,1514.801,1700.880,1813.964,1927.048、2042.075,2143.123,2242.191,2356.234,2484.329,2631.398,2732.445,2860.540 和2988.635,公差為 ±1.5Th。
13.根據(jù)權(quán)利要 求1至12之一所述的方法,其特征在于:與樣品接觸的介質(zhì)相當(dāng)于沉積在祀標(biāo)上的適合于MALDI MS的基質(zhì),以及所述方法包括在步驟b)之前獲得其上或其中吸附有樣品分子的基質(zhì)的結(jié)晶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法,其特征在于:所述基質(zhì)含有選自3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸、α -氰基-4-羥基肉桂酸、阿魏酸和2,5- 二羥基苯甲酸中的化合物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104039975SQ201280066377
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月8日
【發(fā)明者】F·凡德恩奇, O·多瓦爾代, J-P·沙里耶, M·韋爾克 申請(qǐng)人:生物梅里埃公司, 里昂奧斯皮思民用公司, 克洛德·貝納爾-里昂第一大學(xué)
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