本發(fā)明涉及生物細胞研究領域，具體是一種羅格列酮抑制大鼠肝星狀細胞活化的研究方法。

背景技術：

最近研究發(fā)現(xiàn)PPARγ的表達參與HSC靜態(tài)表型的維持，在肝星狀細胞的活化調控中發(fā)揮重要作用，與肝纖維化的形成有非常密切的關系。采用慢病毒載體介導轉染法研究PPARγ對鼠肝纖維化模型的作用機制發(fā)現(xiàn)，在體外實驗中PPARγ能夠抑制活化的HSC表達α-SMA、Ⅰ型膠原，抑制HSC的增殖；在體內實驗中也發(fā)現(xiàn)PPARγ基因轉染組羥脯氨酸、PPARγ及α-SMA、I型膠原蛋白水平與肝纖維化組對比有顯著差異。Lee等在研究從狹葉柴胡中提取的一種木酚素(Kaerophyllin)對硫代乙酰胺引起的大鼠肝損傷和纖維化形成的阻斷作用機制中發(fā)現(xiàn)，其抗炎、抑制HSC活化的作用與上調PPAR-γ表達有關。噻唑烷二酮類藥物(thiazolidinediones，TZDs)是臨床上抗糖尿病藥，常用包括羅格列酮、環(huán)格列酮、吡格列酮，該類藥物是體內PPARγ高選擇性、強效激動劑，能夠激活PPARγ從而改善機體糖脂代謝。近期有研究提示PPARγ配體羅格列酮能夠通過抑制HSC增殖，使細胞周期靜止,促進HSC凋亡從而逆轉甲硫氨酸膽堿缺乏飲食誘導的小鼠纖維性脂肪肝。Lee等報道PPARγ配體環(huán)格列酮對HSC增殖的抑制效應與逆轉ERK活性有關，并且能夠抑制由瘦素或血小板衍生因子引起的HSC增殖。趙彩彥等研究提示環(huán)格列酮的抗肝纖維化的活性可能與它對TGFβ1-TGFβR1信號抑制和阻斷Smad3依賴性的PAI-1和膠原表達有關。Nan等通過研究羅格列酮對緩解營養(yǎng)性纖維性脂肪肝的形態(tài)學和分子生物學依據中發(fā)現(xiàn)羅格列酮減輕肝纖維化通過激活PPAR-γ，而PPAR-γ能抑制HSC活化，抑制TGFβ、CTGF表達。Ramani K等在研究肝星狀細胞蛋氨酸腺苷轉移酶2A(MAT2A)轉錄調控的分子機制中發(fā)現(xiàn)羅格列酮處理的HSC引起的MAT2A表達能降低PPARγ表達，PPARγ是靜止的HSCMAT2A的負調控因子。

肝纖維化是肝臟對各種急慢性損傷的修復反應，而肝星狀細胞的活化是肝纖維化過程的核心環(huán)節(jié)，羅格列酮作為核轉錄因子PPARγ的激動劑，對于肝星狀細胞的抑制已得到證實。HSC細胞的激活和表型變化并非單獨孤立由某個細胞因子引起，而是涉及到眾多細胞因子、不同信號通路的協(xié)同作用，其中研究熱點的是MAPK途徑，而研究表明其中ERK1/2在HSC增殖和膠原蛋白的異常表達中發(fā)揮著重要作用。

本發(fā)明選取研究最廣泛的PDGF作為肝星狀細胞的刺激因素，選取最經典的ERK1/2通路為研究對象，用Westemblot檢測羅格列酮處理后肝星狀細胞ERK1/2蛋白磷酸化的表達情況，進一步揭示其抑制肝星狀細胞I、Ⅲ型膠原mRNA表達的信號通路調節(jié)機制。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種羅格列酮抑制大鼠肝星狀細胞活化的研究方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種羅格列酮抑制大鼠肝星狀細胞活化的研究方法，步驟如下：

(1)采用RT-PCR法檢測PDGF mRNA的表達

11)樣品處理：收獲HSC-T6細胞，移入離心管中，加入Trizol，混勻，室溫靜置4～6min；加入氯仿，振蕩12～18s，靜置23min，4℃下離心，12000g×15min，取上清，加入異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置8～12min；4℃下離心，12000g×10min，棄上清；加入體積分數(shù)為75％的乙醇，輕輕洗滌沉淀；4℃下離心，7500g×5min，棄上清；晾干，加入55℃的DEPC水溶解10～15min；

12)擴增PCR：反應體系為50μL，5×buffer10μL，0.5μL的20μmol/L的α-SMA引物，TAKARA Ex Taq HS酶0.25μL，用水補至40μL加入第一步反應后液體10μL；用PCR儀擴增，PCR反應條件：PPARγ及β-actin為：94℃5min，94℃預變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35個循環(huán)；72℃延伸5min；Adiponectin為：94℃5min，94℃預變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，32個循環(huán)；72℃延伸5min；

13)PDGF表達半定量分析：將PCR反應產物分別在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳，得到PPARγmRNA及Adiponectin mRNA的擴增產物，用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行光密度掃描，以PDGF/β-actin的比值為PDGFmRNA的相對表達水平，實驗重復5次；

其中，設置β-actin為參照；

(2)采用Western blot方法檢測MEK1/2、ERK1/2的蛋白表達情況

21)細胞中總蛋白的提取

a)溶解Western及IP細胞裂解液，混勻，在使用前加入PMSF，使PMSF的最終濃度為0.9～1.1mM；

b)對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍，按照6孔板每孔加入100～200μL裂解液的比例加入裂解液，用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸，裂解液接觸細胞1～2s后，細胞就會被裂解；

c)充分裂解后，以10000～14000轉/min的轉速離心3～5min，取上清；

22)Western blot方法操作

a)聚丙烯酰胺凝膠的配制，根據MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相應濃度的分離膠和積層膠；

b)樣品處理：將樣品加入等量的4×SDS上樣緩沖液，100℃加熱3～5min，離心12000g×1min，每組取等量的總蛋白上樣，10％SDS-PAGE分離蛋白質；

c)加樣：依次加入待分析樣品，每孔15～25μL；

d)電泳：加樣完畢，選擇50～70V的電壓進行電泳3.5～4.5h，直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳；

e)轉膜：蛋白質經SDS-PAGE分離后，從凝膠中轉移到固相支持物上PVDF膜，電泳槽加滿預冷電轉印液，插入電轉印夾，4℃，100V，200mA，2h；

f)膜的封閉：漂洗轉印膜，室溫，3次×15min，以盡量洗去轉印膜上的SDS，放入質量分數(shù)為5％脫脂奶封閉液內，搖床震動，室溫封閉1h；

g)抗體雜交：(1)封閉后pvdf膜放入雜交袋中，加入適當稀釋的一抗，4℃孵育過夜1xTBS-T，pH7.6洗液洗膜3次×10min；(2)過氧化物酶標記山羊大鼠二抗孵育4h，1xTBS-T洗膜3次×15min；

h)顯色、顯影、定影：ECM顯色劑后曝光，將曝光后的X感光膠片放入顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止，再放入定影液中定影，膠片長期保存；用Umax2100XL掃描儀以及凝膠分析軟件Bandscan5.0分析目標帶的分子量和灰度值，以MEK1/2、ERK1/2與對應的內參β-actin蛋白灰度值相比，計算二者灰度比值。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟(1)中，HSC-T6細胞的培養(yǎng)，

(a)細胞復蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入36-37℃水中，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成，凍存管用70％酒精擦拭消毒，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，緩慢滴加等量培養(yǎng)液，以500～1000r/min的轉速離心4～6min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次，用培養(yǎng)液適當稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃，5％CO₂濃度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞貼壁后換液；

(b)細胞培養(yǎng)：采取含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5％CO₂及飽和濕度下培養(yǎng)，隔天換液，待細胞生長至80～90％密度時，開始傳代；

(c)細胞傳代：倒去長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液，加入0.25％胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10培養(yǎng)液終止消化，用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，按1：3傳代，置37℃，5％CO₂及飽和濕度下培養(yǎng)；

(d)細胞凍存：用0.25％胰酶溶液消化細胞，培養(yǎng)液重懸細胞，1000r/min，離心4～6min，棄去上清，凍存液重懸沉淀，加入凍存管中，標明細胞系的名稱和凍存日期，4℃1h，-20℃30min，-80℃過夜，次日將凍存管轉移至液氮中。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

通過本發(fā)明證實脂聯(lián)素具有抑制肝纖維化的作用，其機制與PPARγ的轉錄與調控有關，通過提高PPARγ與脂聯(lián)素的表達，從而減少I型膠原、MMP2的表達，提高TIMP2的表達，減少細胞外基質的生成及正常內皮下基質的降解，達到阻斷肝纖維化進展的目的。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

研究方案如下

1、細胞培養(yǎng)

1.1細胞復蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入36-37℃水中，不時搖動，使其急速融化，30s至1min內完成。凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，緩慢滴加等量培養(yǎng)液，低速離心(500-1000r/min)5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。用培養(yǎng)液適當稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃，5％CO₂濃度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞貼壁后換液。

1.2細胞培養(yǎng)：采取含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5％CO₂及飽和濕度下培養(yǎng)，隔天換液，待細胞生長至80％-90％密度時，開始傳代。

1.3細胞傳代：倒去長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液，加入1ML0.25％胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10ML培養(yǎng)液終止消化，用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，按1：3傳代，置37℃，5％CO₂及飽和濕度下培養(yǎng)。

1.4細胞凍存：用0.25％胰酶溶液消化細胞，5ml培養(yǎng)液重懸細胞，1000r/min，離心5min，棄去上清，1ml凍存液重懸沉淀，加入凍存管中，標明細胞系的名稱和凍存日期，4℃1h，-20℃30min，-80℃過夜，次日將凍存管轉移至液氮中。

1.5細胞計數(shù)：取細胞懸液0.1ml，加入PBS 0.9ml，混合后滴入細胞計數(shù)板內。低倍鏡下計數(shù)四個大方格內的細胞總數(shù)，按照下列公式計算細胞密度：細胞密度(細胞數(shù)/ml)＝(細胞計數(shù)總和/4)×10⁴×稀釋倍數(shù)。計數(shù)原則：壓線細胞應數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，計數(shù)時兩次重復算誤差率不應超過10％。

2、細胞分組及處理

采用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)，每日定時于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，隔天換液，待細胞生長至80％-90％密度時開始傳代。將對數(shù)生長期HSC-T6細胞，以0.25％胰蛋白酶消化，并接種至無菌6孔板內，調整細胞接種密度為1×10⁵/ml，待細胞生長至80％左右用低糖培養(yǎng)基使細胞同步化24h，細胞分4組：空白對照組，PDGF刺激組，羅格列酮干預組及羅格列酮對照組。

HSC-T6復蘇后以1×10⁵/ml接種于96孔板培養(yǎng)，其中羅格列酮使用濃度為10μmol/L，PDGF使用濃度為30μmol/L，每組設立6個復孔。每組設5個復孔，干預24h后分別收集各組的細胞和細胞培養(yǎng)上清液進行下面實驗。

3、四甲基偶氮唑鹽比色實驗(MTT比色法)

3.1.HSC-T6細胞生長融合成單層后，取對數(shù)生長期細胞，分別以0.25％胰蛋白酶消化，并接種至無菌96孔板內，調整細胞接種密度為5×10⁴/ml，每孔均加入細胞懸液200μL，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2.24h后，96孔板內細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，血清饑餓同步化處理24h后，吸棄培養(yǎng)液。板邊緣四周孔加PBS防止邊緣效應，按照實驗分組依次加入濃度為10μmol/L羅格列酮、1μmol/L GW9662、10μmol/L羅格列酮和1μmol/L GW9662的培養(yǎng)液，每孔200μL；對照組為0.4％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每組設5個復孔，培養(yǎng)24h。

3.3.到預定時間后，每孔加入無菌MTT溶液(5mg/ml)20μL，繼續(xù)在原條件下孵育4h，然后終止培養(yǎng)，吸去孔內培養(yǎng)液，每孔加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)，微型振蕩器振蕩10min。選擇490nm波長，在酶標儀上檢測各孔的吸光度(A值)，結果以均數(shù)±標準差表示，綜合分析10μmol/L羅格列酮、1μmol/L GW9662、10μmol/L羅格列酮和1μmol/L GW9662對HSC-T6細胞增殖的影響。

4、采用RT-PCR法檢測PDGFmRNA的表達

4.1.樣品處理：收獲細胞1-5×10⁷，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。4℃離心，12000g×15min，取上清。加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃離心，12000g×10min，棄上清。加入1ml 75％乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。晾干，加入適量的DEPC H2O溶解(55℃促溶10-15min)。

4.2.引物見表一：

設置β-actin為參照；

4.3擴增PCR：反應體系為50μL，5×buffer10μL，α-SMA引物(20μmol/L)0.5μL，TAKARA Ex Taq HS酶0.25μL，用水補至40μL加入第一步反應后液體10μL。用PCR儀擴增。PCR反應條件：PPARγ及β-actin為：94℃5min，94℃預變性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。Adiponectin為：94℃5min，94℃預變性30s，，58℃退火30s，72℃延伸30s，32個循環(huán)；72℃延伸5min。

4.4.PDGF表達半定量分析：將PCR反應產物分別在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳，PPARγmRNA及Adiponectin mRNA的擴增產物大小見表一。用凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)對條帶進行光密度掃描，以PDGF/β-actin的比值為PDGFmRNA的相對表達水平。實驗重復5次。

5、Western blot方法檢測MEK1/2、ERK1/2的蛋白表達情況

5.1.細胞中總蛋白的提取

5.1.1.融解Western及IP細胞裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)min內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。

5.1.2.對于貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2s后，細胞就會被裂解。

5.1.3.充分裂解后，10000-14000轉/min離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western等操作。裂解液用量說明：通常6孔板每孔細胞加入100μL裂解液已經足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到150μL或200μL。

5.2.Western blot方法操作步驟

5.2.1.聚丙烯酰胺凝膠的配制，根據MEK1/2、ERK1/2蛋白分子的大小，配置相應濃度的分離膠和積層膠

5.2.2.樣品處理：將樣品加入等量的4×SDS上樣緩沖液，100℃加熱3-5min，離心12000g×1min，每組取等量的總蛋白上樣，10％SDS—PAGE分離蛋白質。

5.2.3加樣：依次加入待分析樣品，每孔20μL。

5.2.4.電泳：加樣完畢，選擇適當?shù)碾妷哼M行電泳可。一般采用60V，4h，也可電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳

5.2.5.轉膜：蛋白質經SDS-PAGE分離后，從凝膠中轉移到固相支持物上PVDF膜。電泳槽加滿預冷電轉印液，插入電轉印夾，4℃，100v，200mA，2h。

5.2.6.膜的封閉：漂洗轉印膜，室溫，3次x15min，以盡量洗去轉印膜上的SDS(以免影響抗體的結合)，放入5％脫脂奶封閉液內，搖床震動，室溫封閉1h

5.2.7.抗體雜交：(1)封閉后pvdf膜放入雜交袋中，加入適當稀釋的一抗，4℃孵育過夜1xTBS-T，PH7.6洗液洗膜3次x10min。(2)過氧化物酶標記山羊大鼠二抗孵育4h，1xTBS-T洗膜3X15min。

5.2.8.顯色(ECM)：ECM顯色劑后曝光

5.2.9.顯影、定影：將曝光后的X感光膠片放入顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止，再放入定影液中定影，膠片可長期保存。用Umax2100XL掃描儀以及凝膠分析軟件Bandscan5.0分析目標帶的分子量和灰度值，以MEK1/2、ERK1/2與對應的內參β-actin蛋白灰度值相比，計算二者灰度比值

研究結果：

1.MTT法檢測細胞增殖率：羅格列酮干預組細胞的增殖率較空白對照組，PDGF刺激組及羅格列酮對照組明顯下降(t值分別為21.975、16.331、19.5，P<0.01，見表1)。

表1 各組HSC增殖情況

2.ELISA檢測HSC-T6細胞脂聯(lián)素、I型膠原、MMP2、TIMP2含量的變化

ELISA結果顯示：①羅格列酮組脂聯(lián)素的表達較GW9662組、GW9662+羅格列酮組及空白對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為10.256、11.049、18.419，P<0.01)。②羅格列酮組I型膠原的表達較GW9662組、GW9662+羅格列酮組及空白對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為11.823、9.657、14.240，P<0.01)。③羅格列酮組MMP2含量較GW9662組、GW9662+羅格列酮組、空白對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為25.744、20.333、19.030，P<0.01)。④羅格列酮組TIMP2的表達量較GW9662組、GW9662+羅格列酮組、空白對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為15.500、18.166、18.802，P<0.01)。⑤GW9662組、GW9662+羅格列酮組及空白對照組脂聯(lián)素、I型膠原、MMP2、TIMP2的表達量無明顯差異(P>0.05)。(見表2)

表2 ELISA檢測HSC-T6細胞脂聯(lián)素、Ⅰ型膠原、MMP2、TIMP2含量的變化(ng/ml)

3.RT-PCR檢測HSC-T6細胞脂聯(lián)素和PPARγ的mRNA表達的變化

RT-PCR結果顯示：①羅格列酮組脂聯(lián)素mRNA相對表達量為1.273±0.045，較GW9662組、GW9662加羅格列酮組、空白對照組(0.653±0.075、0.633±0.093、0.693±0.065)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為12.264、10.733、12.690，P<0.01)。②羅格列酮組PPARγmRNA相對表達量為1.633±0.015，較GW9662組、GW9662加羅格列酮組、空白對照組(0.403±0.015、0.450±0.026、0.457±0.015)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為8.619、7.089、4.343，P<0.01)。③其它各組脂聯(lián)素、PPARγmRNA相對表達量無明顯差異(P>0.05)。④GW9662阻斷羅格列酮對PPARγmRNA表達同時，也阻斷了羅格列酮對脂聯(lián)素mRNA的表達。⑤脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達存在顯著正相關關系(相關指數(shù)為0.970，P＝0.000，P<0.01)。(見表3)

表3 RT-PCR檢測HSC-T6細胞脂聯(lián)素、PPARγmRNA表達的變化

4.Western blot檢測HSC-T6細胞脂聯(lián)素和PPARγ蛋白表達的變化

Western印跡結果顯示：①羅格列酮組脂聯(lián)素蛋白相對表達量為1.124±0.007，較GW9662組、GW9662加羅格列酮組、空白對照組(0.744±0.082、0.744±0.064、0.734±0.043)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為7.969、10.240、15.274，P<0.01)。②羅格列酮組PPARγ蛋白相對表達量為1.036±0.028，較GW9662組、GW9662加羅格列酮組、空白對照組(0.655±0.006、0.648±0.004、0.649±0.005)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為23.450、24.208、23.990，P<0.01)。③其它各組脂聯(lián)素、PPARγ蛋白相對表達量無明顯差異(P>0.05)。④GW9662阻斷羅格列酮對PPARγ蛋白表達同時，也阻斷了羅格列酮對脂聯(lián)素蛋白的表達。⑤脂聯(lián)素和PPARγ蛋白表達存在顯著正相關關系(相關指數(shù)為0.966，P＝0.001，P<0.01)。(見表4)

表4Western blot檢測HSC-T6細胞脂聯(lián)素、PPARγ蛋白表達的變化

本實驗結果顯示，羅格列酮組脂聯(lián)素、PPARγmRNA及蛋白的表達量較其它組明顯升高(P<0.01)，其它各組脂聯(lián)素、PPARγmRNA及蛋白的表達量比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明羅格列酮激動PPARγ的表達，同時也上調脂聯(lián)素的表達，且這種激動作用可被特異性阻斷劑GW9662阻斷，說明羅格列酮的激動作用是通過PPARγ起作用的。通過相關性分析提示脂聯(lián)素和PPARγmRNA表達存在顯著相關關系(相關指數(shù)為0.970，P＝0.000，P<0.01)，脂聯(lián)素和PPARγ蛋白表達同樣存在顯著相關關系(相關指數(shù)為0.966，P＝0.001，P<0.01)。說明在HSC中脂聯(lián)素的表達調控與細胞核內轉錄因子PPARγ有一定相關，與以往報道脂聯(lián)素是PPARγ的靶基因相符。

對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。