一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法，取7～10日齡SD大鼠分離的大腦皮質，經(jīng)Ⅱ型分散酶消化、兩次加入15％葡聚糖溶液三次離心后獲得大鼠腦微血管段，用膠原酶/分散酶消化后，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進行原代細胞培養(yǎng)。本發(fā)明的體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法，簡易可行、獲得細胞純度較高，成功分離培養(yǎng)了大鼠腦微血管內皮細胞，倒置顯微鏡下單個細胞呈短梭形或多角形，匯合后呈鋪路石樣，單層貼壁生長；經(jīng)免疫熒光檢測第Ⅷ因子相關抗原呈陽性。
【專利說明】一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)【技術領域】，尤其是涉及一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法。
【背景技術】
[0002]腦微血管內皮細胞(BrainMicrovascular Endothelial Cells, BMECs)是構成血腦屏障的主要成分，是各種生理、病理因素作用的靶細胞。BMECs能通過選擇性雙向跨細胞膜轉運系統(tǒng)以及細胞間的緊密連接將腦組織與血液分開，限制大多數(shù)極性分子和蛋白質進入腦組織，只有少部分蛋白質和多肽能通過轉胞吞作用通過血腦屏障進入血液。BMECs具有不同于外周內皮細胞的特性:細胞間連接緊密，跨膜電阻高，延遲細胞旁的通量；細胞缺乏孔窗結構，胞飲作用弱，毒素不易通過血腦屏障；細胞具有不對稱定位酶和載體介導轉運系統(tǒng)，產生“兩極分化”的表現(xiàn)型。為了更好地在體外研究血腦屏障和腦微血管內皮細胞，原代培養(yǎng)的腦微血管內皮細胞越來越重要。由于目前現(xiàn)有報道的體外培養(yǎng)方法雖然能夠培養(yǎng)出腦微血管內皮細胞，但都有一定的缺陷，本發(fā)明通過反復試驗和改進，成功摸索出相對簡單，純度較高的大鼠腦微血管內皮細胞RBMECs的方法。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明 解決的一個技術問題就是，提供一種簡易可行、獲得細胞純度較高的體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法。
[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明的技術方案是:
[0005]—種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法，取7~10日齡SD大鼠分離的大腦皮質，經(jīng)II型分散酶消化、兩次加入15%葡聚糖溶液三次離心后獲得大鼠腦微血管段，用膠原酶/分散酶消化后，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進行原代細胞培養(yǎng)。
[0006]所述方法還包括對得到的原代細胞進行純化并傳代培養(yǎng)的步驟。
[0007]所述方法還包括對純化并傳代培養(yǎng)得到的大鼠腦微血管內皮細胞進行鑒定的方法，所述鑒定方法是利用第珊因子相關抗原免疫熒光檢測法結合細胞形態(tài)學觀察對培養(yǎng)的細胞進行鑒定。所述第珊因子相關抗原免疫熒光檢測法的步驟包括:將細胞傳代至共聚焦細胞培養(yǎng)板中，至細胞生長至80%~90%匯合狀態(tài)時，吸棄培養(yǎng)基，用37°C預熱的PBS輕輕清洗3次，加入預冷的95%乙醇；于-20°C固定20min，吸去乙醇，用PBS連續(xù)漂洗3次，每次3min ;向培養(yǎng)孔中滴加ImL兔抗人第珊因子相關抗原抗血清，陰性對照不加，37°C孵育4h ;用PBS漂洗3次，每次3min ;滴加FITC標記的羊抗兔IgGlmL, 37°C孵育1.5h ;用PBS液漂洗3次，每次3min ;用去離子水沖洗，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。
[0008]本發(fā)明的方法，其中體外分離并原代培養(yǎng)階段具體包括以下步驟:無菌取5只7~10日齡SD大鼠的大腦，D-Hank’s清洗3次，將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動去除軟腦膜及大血管,剝離大腦皮質；將分離得到的大腦皮質在D-Hank’s中清洗3次，100rpm離心2min棄上清液；加入15% II型分散酶，用5mL移液槍吹打，吹成勻漿狀；37°C水浴消化lOmin，每隔3min用移液槍吹打數(shù)次，800g4°C離心5min，棄上清；加入15%葡聚糖溶液，渦旋2min充分混勻，4500g4°C離心10min，將上層神經(jīng)及大血管移入另一離心管，加入15%葡聚糖溶液，潤旋2min,4500g4°C離心8min ;合并兩次離心得到的紅色沉淀物,4500g4°C再次離心6min,棄去上層神經(jīng)組織和大血管,保留底部紅色沉淀；用D_Hank’ s重懸沉淀,800g4°C離心5min,棄上清；加入ImL膠原酶/分散酶,37°C水浴消化20min,每隔5min吹打數(shù)次,取1yL消化液于載玻片在顯微鏡下觀察，可見串珠狀微血管段；加入等量的完全培養(yǎng)基終止消化，800g4°C離心5min，加入完全培養(yǎng)基重懸，接種在細胞培養(yǎng)板中；在37°C、5% CO2恒濕恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h更換完全培養(yǎng)基，得到原代細胞。對得到的原代細胞可再進行純化并傳代培養(yǎng)。并通過第珊因子相關抗原免疫熒光檢測法結合細胞形態(tài)學觀察進行鑒定。
[0009]所述純化并傳代培養(yǎng)的步驟包括:原代培養(yǎng)細胞，用37°C預熱的D-Hank’ s清洗3次，然后加入含0.005% EDT A的0.05%胰蛋白酶，37°C消化2~3min，待大部分細胞收縮變圓時，棄去胰蛋白酶，加入完全培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打使細胞脫壁，吸取細胞懸液，添加等量的完全培養(yǎng)基，混勻，按照1: 2接種于細胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)箱靜置孵育2h更換完全培養(yǎng)基。
[0010]上述步驟中提及的完全培養(yǎng)基優(yōu)選為:20% FBS、1% L-谷氨酰胺、青霉素I X 14U.mr1、鏈霉素 I X 14U.πm1、ECGS15 μ g.mL'
[0011]本發(fā)明的體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法，成功分離培養(yǎng)了大鼠腦微血管內皮細胞，倒置顯微鏡下單個細胞呈短梭形或多角形，匯合后呈鋪路石樣，單層貼壁生長；經(jīng)免疫熒光檢測第VDI因子相關抗原呈陽性。 [0012]本發(fā)明的體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法，采用15%葡聚糖三次離心，簡便易行且能獲得較高純度BMECs ;培養(yǎng)大鼠BMECs的重要步驟之一是分離出較純的大腦皮質微血管段。常規(guī)方法采用組織勻漿和過篩的方式，該方法能有效除去雜細胞，獲得純度較高的微血管段，但這種方法大大降低了微血管段的活性，細胞生長速度慢，一次需要消耗大量大鼠；也有試驗表明percoll梯度離心能夠純化微血管段，但經(jīng)過多次嘗試發(fā)現(xiàn)，percoll離心過后得到的微血管段活性比離心前大大降低，不利于細胞的生長，且會損耗一部分微血管段，舍去此步驟能夠減少純化微血管段的時間和離心次數(shù)，對微血管段的活性損傷小，并且對其純度影響不大。本發(fā)明采用15%葡聚糖4°C三次離心的方法能獲得較大量的較純的微血管段，此前發(fā)現(xiàn)采用葡聚糖離心時間均為15min，試驗發(fā)現(xiàn)此方法很容易使神經(jīng)組織和大血管混入微血管段，所得腦微血管段純度不高，本發(fā)明最后確定的最優(yōu)條件是:三次離心時間分別為10min、8min、6min,每次離心前都潤旋使其充分混合。采用水平轉子離心，能避免上層神經(jīng)組織和大血管混入微血管中，縮短離心時間也有利于保護微血管的活性，方法簡單易行，對試驗條件要求不高。大鼠BMECs相對其他微血管內皮細胞分裂能力較弱，生長條件要求較高，第2~4代細胞活性都比較高，形態(tài)也比較穩(wěn)定，可選用此階段的細胞進行試驗。
[0013]另外本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)板上不鋪布明膠、鼠尾膠等物質不影響B(tài)MECs貼壁及生長，在進行原代培養(yǎng)時加入適量的ECGS能促進細胞的生長，如不添加ECGS，采用含有25%~30% FBS的培養(yǎng)基也能促進大鼠BMECs的生長，但其效果較ECGS差?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0014]圖1為原代及傳代培養(yǎng)的RBMECs，其中:
[0015]A.分離的大鼠腦皮質微血管段(40 X) ；B.1d后從微血管段長出的RBMECs (40 X)；C.微血管段周圍生長的RBMECs (40 X) ;D.7d左右的RBMECs (40 X) ；E.生長至匯合狀態(tài)的RBMECs (40 X) ;F.2 代 RBMECs (40 X) ;G.2 代 RBMECs (100 X) ;Η.3 代 RBMECs (100 X) ;1.6 代衰老的 RBMECs (100Χ) J.7 代 RBMECs (200 X)；
[0016]圖2為RBMECs第VDI因子鑒定結果(400Χ)，其中:
[0017]A.RBMECs第VDI因子鑒定陽性；B.RBMECs第VDI因子鑒定對照組陰性。
【具體實施方式】
[0018]下文中將結合附圖對本發(fā)明的實施例進行詳細說明。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。
[0019]實施例:
[0020]I 方法
[0021]1.1 動物
[0022]7~10日齡SD大鼠，雌雄均可，購自中科院遺傳所實驗動物中心。
[0023]1.2主要儀器和器材
[0024]CO2 培養(yǎng)箱(SANYO，型號:MC0217AC)，倒置顯微鏡(OLYMPUS，型號:IX71_A21PH)，高速低溫離心機(SIGMA6-16K)，酸度計(賽多利斯，型號:UB_7)，細胞培養(yǎng)板(Costar公司)，激光共聚焦顯微鏡LEICA等。
[0025]1.3 試劑
[0026]HankcJ s(GIBC0,批號:H2387)，胎牛血清(FBS，PAA Laboratories Gmbh,批號:A04105-1121)，DMEM 高糖培養(yǎng)基(SIGMA，批號:1136551)，胰蛋白酶(1:250，GIBC0，批號:2750018), II 型膠原酶(SIGMA，批號:30H6812), L-谷氨酰胺(SIGMA，批號:G_3126)，兔抗人第VDI因子相關抗原抗血清(SIGMA，批號:30677904)，羊抗兔IgG-FITC(SIGMA，批號:58630)，膠原酶/分散酶(Roche，貨號:10269638001)，ECGS(內皮細胞生長添加劑)(Millipore，批號:02-102)。
[0027]1.4RBMECS的原代培養(yǎng)
[0028]取5只7~10日齡SD大鼠，脫頸椎處死，75 %酒精浸泡消毒，無菌取出大腦，D-Hank’s清洗3次，將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動去除軟腦膜及大血管，剝離大腦皮質。將大腦皮質在D-Hank’s中清洗3次，100rpm離心2min棄上清液。加入15% dispase II ,用5mL移液槍吹打，吹成勻漿狀。37°C水浴消化lOmin，每隔3min用移液槍吹打數(shù)次，800g4°C離心5min,棄上清。加入15% dextran溶液,潤旋2min充分混勻,4500g4°C離心1min,將上層神經(jīng)及大血管移入另一離心管，加入15% dextran溶液，禍旋2min,4500g4°C離心8min。合并兩次離心紅色沉淀物，4500g4°C離心6min，棄去上層神經(jīng)組織和大血管，保留底部紅色沉淀。用D-Hank’s重懸沉淀，800g4°C離心5min,棄上清。加入ImL膠原酶/分散酶,37°C水浴消化20min，每隔5min吹打數(shù)次，取10 μ L消化液于載玻片在顯微鏡下觀察，可見串珠狀微血管段。加入等量的完全培養(yǎng)基終止消化，800g4°C離心5min，加入完全培養(yǎng)基(20%FBSU % L-谷氨酰胺、青霉素 I X 14U^ml'鏈霉素 I X 14U.mr\ECGS15 μ g.ι?-1)重懸，接種在細胞培養(yǎng)板中。在37°C、5% CO2恒濕恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h更換完全培養(yǎng)基。第7~10天細胞匯合鋪滿后，消化傳代。
[0029]1.5RBMECS的純化與傳代培養(yǎng)
[0030]選取生長至近完全匯合狀態(tài)的培養(yǎng)孔，吸棄原培養(yǎng)基，用37°C預熱的D-Hank’s清洗3次，然后加入的0.05%胰蛋白酶(含0.005% EDT A)，37°C消化2~3min，待大部分細胞收縮變圓時，棄去胰酶，加入的完全培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打使細胞脫壁，吸取細胞懸液，添加等量的完全培養(yǎng)基，混勻，按照1:2接種于細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱靜置孵育2h更換完
全培養(yǎng)基。
[0031]1.6RBMECS 的鑒定
[0032]1.6.1倒置顯微鏡下細胞形態(tài)觀察
[0033]將培養(yǎng)有原代和傳代細胞的培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁、生長情況及其形態(tài)，并拍照記錄。
[0034]1.6.2第VDI因子免疫熒光鑒定
[0035]將細胞傳代至共聚焦細胞培養(yǎng)板中，至細胞生長至80%~90%匯合狀態(tài)時，吸棄培養(yǎng)基，用37°C預熱的PBS輕輕清洗3次，加入預冷的95%乙醇；于_20°C固定20min，吸去乙醇，用PBS連續(xù)漂洗3次，每次3min ;向培養(yǎng)孔中滴加ImL兔抗人第VDI因子相關抗原抗血清(陰性對照不加)，37°C孵育4h ;用PBS漂洗3次，每次3min ;滴加FITC標記的羊抗兔IgGlmL，37°C孵育1. 5h ;用PBS液漂洗3次，每次3min ;用去離子水沖洗，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。
[0036]2 結果
[0037]2.1細胞形態(tài)學觀察結果
[0038]取10 μ L消化液于載玻片在倒置顯微鏡下觀察，可見大量微血管段，呈串珠樣，管壁較光滑、清晰、長度不等，呈單枝或多分枝狀，并散在許多微血管內皮細胞，呈小圓形，分布不規(guī)則。培養(yǎng)24h后，可見大量細胞從微血管段游出，呈短梭形或多角形。培養(yǎng)7~10天，可見細胞鋪滿培養(yǎng)孔，生長至匯合狀態(tài)，形成典型的鋪路石樣外觀。細胞經(jīng)傳代至2代、3代后形態(tài)沒有明顯變化，分裂活性高。細胞經(jīng)傳代至6~7代時細胞形態(tài)開始發(fā)生變化，分裂能力降低，折光性降低。(見圖1)
[0039]2.2第VDI因子相關抗原免疫熒光鑒定結果
[0040]細胞經(jīng)免疫熒光染色后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，細胞核周圍均出現(xiàn)黃綠色熒光，表明培養(yǎng)的腦微血管內皮細胞第珊因子相關抗原染色為陽性，顯微鏡下計數(shù)，陽性率達90%，胞質與胞核間界限明顯，而對照組細胞不染色(陰性)，表明培養(yǎng)的細胞為RBMECs (見圖 2)。
[0041]發(fā)明人曾多次嘗試貼塊法、非連續(xù)梯度的percoll分離微血管段法等方法對BMECs進行分離培養(yǎng)，效果不甚理想，經(jīng)過改良和總結，最后采用15%葡聚糖三次離心，摸索出了這種簡便易行且能獲得較高純度BMECs的培養(yǎng)方法。
[0042]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種體外分離并培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞的方法,其特征在于:取7~10日齡SD大鼠分離的大腦皮質，經(jīng)II型分散酶消化、兩次加入15%葡聚糖溶液三次離心后獲得大鼠腦微血管段，用膠原酶/分散酶消化后，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中進行原代細胞培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法還包括對得到的原代細胞進行純化并傳代培養(yǎng)的步驟。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:所述方法還包括對純化并傳代培養(yǎng)得到的大鼠腦微血管內皮細胞進行鑒定的方法，所述鑒定方法是利用第珊因子相關抗原免疫熒光檢測法結合細胞形態(tài)學觀察對培養(yǎng)的細胞進行鑒定。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法具體包括以下步驟:無菌取5只7~10日齡SD大鼠的大腦，D-HankJ s清洗3次，將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動去除軟腦膜及大血管，剝離大腦皮質；將分離得到的大腦皮質在D-Hank’s中清洗3次，100rpm離心2min棄上清液；加入15% II型分散酶，用5mL移液槍吹打，吹成勻漿狀；37°C水浴消化lOmin，每隔3min用移液槍吹打數(shù)次，800g4°C離心5min，棄上清；加入15%葡聚糖溶液，渦旋2min充分混勻，4500g4°C離心10min，將上層神經(jīng)及大血管移入另一離心管，加入15%葡聚糖溶液，渦旋2min，4500g4°C離心8min ;合并兩次離心得到的紅色沉淀物，4500g4°C再次離心6min,棄去上層神經(jīng)組織和大血管,保留底部紅色沉淀；用D_Hank’ s重懸沉淀，800g4°C離心5min,棄上清；加入ImL膠原酶/分散酶,37°C水浴消化20min,每隔5min吹打數(shù)次，取10 μ L消化液于載玻片在顯微鏡下觀察，可見串珠狀微血管段；加入等量的完全培養(yǎng)基終止消化，800g4°C離心5min，加入完全培養(yǎng)基重懸，接種在細胞培養(yǎng)板中；在37°C、5% CO2恒濕恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h更換完全培養(yǎng)基，得到原代細胞。
5.根據(jù)權利要 求4所述的方法，其特征在于:所述方法還包括對得到的原代細胞進行純化并傳代培養(yǎng)的步驟。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:所述純化并傳代培養(yǎng)的步驟包括:原代培養(yǎng)細胞，用37°C預熱的D-Hank’s清洗3次，然后加入含0.005% EDT A的0.05%胰蛋白酶，37°C消化2~3min，待大部分細胞收縮變圓時，棄去胰蛋白酶，加入完全培養(yǎng)基，用移液器輕輕吹打使細胞脫壁，吸取細胞懸液，添加等量的完全培養(yǎng)基，混勻，按照1:2接種于細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱靜置孵育2h更換完全培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權利要求4-6中任一項所述的方法,其特征在于:所述完全培養(yǎng)基為:20%FBSU % L-谷氨酰胺、青霉素 IXlO4U.ml-1、鏈霉素 I X 14U.mr\ECGS15y g.mL'
8.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于:所述第珊因子相關抗原免疫熒光檢測法的步驟包括:將細胞傳代至共聚焦細胞培養(yǎng)板中，至細胞生長至80%~90%匯合狀態(tài)時，吸棄培養(yǎng)基，用37°C預熱的PBS輕輕清洗3次，加入預冷的95%乙醇；于_20°C固定20min，吸去乙醇，用PBS連續(xù)漂洗3次，每次3min ;向培養(yǎng)孔中滴加ImL兔抗人第VDI因子相關抗原抗血清，陰性對照不加，37°C孵育4h ;用PBS漂洗3次，每次3min ;滴加FITC標記的羊抗兔IgGlmL，37°C孵育1.5h ;用PBS液漂洗3次，每次3min ;用去離子水沖洗，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。
【文檔編號】C12N5/071GK104031879SQ201410214962
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月21日 優(yōu)先權日:2014年5月21日
【發(fā)明者】董虹, 胡格, 張濤, 姜代勛, 段慧琴, 穆祥, 張倩, 馮波, 王鑫 申請人:北京農學院