用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑及其制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能夠提高青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑及其制作方法。所述添加劑由第一菌種和第二菌種混合而成，其中第一菌種為植物乳桿菌LP，第二菌種為乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一種菌種，所述第一菌種與第二菌種的容積比例為1：（1～3）。在多花黑麥草進(jìn)行青貯時，將乳酸菌添加劑添加到黑麥草青貯料中，可以大大提高青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值，所述的乳酸菌添加劑制作方法是通過從多花黑麥草本身附著的乳酸菌中分離出產(chǎn)酸能力強(qiáng)、生長旺盛且能提高多花黑麥草青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值的乳酸菌菌株，更加適宜多花黑麥草的貯存。適合在青貯領(lǐng)域推廣運(yùn)用。
【專利說明】用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑及其制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于青貯領(lǐng)域，具體涉及一種用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑及其制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]青貯是通過乳酸菌的增殖，將原料中的發(fā)酵底物轉(zhuǎn)化成乳酸等酸性物質(zhì)，創(chuàng)造酸性環(huán)境，抑制有害微生物增殖，從而保存原料營養(yǎng)成分的過程。優(yōu)質(zhì)青貯飼料不僅保持了青綠飼料的鮮綠和大部分營養(yǎng)，而且增加了粗蛋白的含量；同時又具有芳香的酸味，柔軟多汁，適口性好等特點(diǎn)。在青忙飼料中含有多種乳酸菌，包括乳桿菌(lactobaciIlus)、腸球菌(Enterococcus)、明串珠菌(Leuconstoc)、乳球菌(Lactococcus)和片球菌(Pediococcus)等，為提高青貯品質(zhì)，分離飼料中優(yōu)質(zhì)乳酸菌顯得尤為重要。歐盟國家和美國的研究者對乳酸菌在青貯飼料中的應(yīng)用進(jìn)行了大量深入的研究，研究內(nèi)容包括優(yōu)良乳酸菌的篩選、其對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和二次發(fā)酵抑制作用的影響、以及青貯飼料添加乳酸菌在奶牛飼養(yǎng)中的應(yīng)用等。例如，有學(xué)者指出附著在新鮮牧草上的微生物，特別是乳酸菌，對青貯料的發(fā)酵過程和品質(zhì)起重要作用。乳酸菌和其它種類的微生物在青貯發(fā)酵過程中共同生長，且影響到青貯料的發(fā)酵特性。在發(fā)酵過程中，牧草中的乳酸菌將糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，最終pH值降低，而牧草得以保存。 [0003]目前市面上的乳酸菌添加劑多是針對玉米的菌劑，用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑還未見報道。南方地區(qū)常年陰雨天氣較多，干草調(diào)制受天氣條件影響不易成功，而青貯不受天氣條件影響，是保存牧草的有效方法，作為我國南方地區(qū)廣泛種植的牧草多花黑麥草來說，開發(fā)針對其青貯料的乳酸菌添加劑有重要的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠提高青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:該用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑，所述添加劑由第一菌種和第二菌種混合而成，其中第一菌種為植物乳桿菌LP，第二菌種為乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一種菌種，所述第一菌種與第二菌種的容積比例為1:(1~3)。
[0006]進(jìn)一步的是，所述第二菌種為魏斯氏菌WB。
[0007]進(jìn)一步的是，所述植物乳桿菌LP與魏斯氏菌WB的容積比例為1:3。
[0008]本發(fā)明還提供了一種制備上述用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑的制作方法，該制作方法包括以下步驟:
[0009]A、制備乳酸菌培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基各組分加入容器中，然后進(jìn)行加熱攪拌，待所有組分都充分溶解后，裝入培養(yǎng)皿中并將其密封，然后將其放置于高壓滅菌爐中進(jìn)行滅菌處理，滅菌處理結(jié)束后，取出培養(yǎng)皿，將其放置于無菌操作臺上，開啟紫外燈對其照射一段時間，照射結(jié)束后吹風(fēng)使培養(yǎng)基凝固；
[0010]B、制備多花黑麥草的綠汁發(fā)酵液，將多花黑麥草原料剪切成2~3cm長的碎段，將切碎后的原料加入高速組織勻漿機(jī)中，再加入無菌蒸餾水進(jìn)行攪碎，將攪碎的汁液用紗布過濾，用量筒稱量濾液容積，加入相應(yīng)重量的葡萄糖以使濾液中葡萄糖濃度達(dá)到20g/L，充分混勻后倒入容量瓶中，濾液要裝滿容量瓶且不留空氣，將容量瓶蓋子蓋好并用膠布纏繞密封；
[0011]C、從綠汁發(fā)酵液中分離、純化乳酸菌，將步驟B制得的綠汁發(fā)酵液置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中厭氧發(fā)酵48h，從綠汁發(fā)酵液放置在30°C恒溫培養(yǎng)箱中厭氧發(fā)酵開始，每隔4h在無菌操作臺上打開一瓶綠汁發(fā)酵液，用接種針蘸少許中層發(fā)酵液后在培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，每瓶綠汁發(fā)酵液用三個培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，直至第48h全部綠汁發(fā)酵液均進(jìn)行過劃線操作為止，將劃過線的培養(yǎng)基放置在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天在無菌操作臺上用接種針挑取培養(yǎng)基上的單個菌落得到純的乳酸菌菌株； [0012]D、對挑取的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，觀察各個菌株在顯微鏡下的形態(tài)特征從而確定菌株的陰性和陽性；
[0013]E、對純的乳酸菌菌株進(jìn)行生化鑒定，在無菌操作臺上用接種針挑取單菌落置于含不同糖類的生化鑒定管中，將生化鑒定管用蠟密封后置于35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，之后根據(jù)生化鑒定管中的顯色反應(yīng)并結(jié)合步驟D得出的結(jié)論對得到的菌株進(jìn)行初步分類；
[0014]F、對乳酸菌菌株進(jìn)行分子鑒定，具體步驟如下:首先，提取乳酸菌菌株的基因組DNA,其次，對提取的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到瓊脂糖凝膠，接著，從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段，得到PCR產(chǎn)物，最后，對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)步驟E得出的結(jié)論，將測得的序列與Genbank中的已知序列進(jìn)行比對,尋找同源性最高的菌種,從而確定菌株的類別；
[0015]G、混合菌劑的制備，根據(jù)步驟F得到的鑒定結(jié)果，將需要選用的植物乳桿菌LPjL酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB的菌株分離出來接種于MRS液體培養(yǎng)基中，然后在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后將各菌液稀釋至I X 106cfu/mL,將植物乳桿菌LP作為第一菌種，乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一種菌種作為第二菌種，按照第一菌種與第二菌種的容積比例為1:(1~3)混合制成乳酸菌添加劑。
[0016]進(jìn)一步的是，在步驟A中，所述培養(yǎng)基成分為冰100000份，蛋白胨1000份，牛肉膏1000份，酵母膏500份，葡萄糖2000份，吐溫80100份，K2HP04200份，乙酸鈉500份，檸檬酸銨 200 份，MgSO4.7H2058 份，MnSO4.4H2025 份，瓊脂 2000 份。
[0017]進(jìn)一步的是，在步驟D中，所述革蘭氏染色的具體步驟如下:將載玻片消毒滅菌后置于無菌操作臺上晾干，用移液管向載玻片中央滴一小滴無菌蒸餾水，用接種針挑取一部分乳酸菌單菌落置于載玻片上的無菌水中并攪拌混勻，手持載玻片一端，載有乳酸菌的液滴朝上，將載玻片中央在酒精燈火焰最外層處來回通過數(shù)次，使水分蒸發(fā)，載玻片冷卻后染色，向載玻片上樣品位置滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液I~2滴，染色I(xiàn)min后傾斜載玻片，用自來水沿一端緩慢沖洗，直至沖下的水為無色為止，接著向載玻片樣品位置滴加碘液I~2滴，染色I(xiàn)min后用自來水沖洗，至沖下的水為無色為止，再向載玻片樣品位置滴加復(fù)紅乙醇溶液，染色I(xiàn)min后用自來水沖洗至沖下的水為無色，用吸水紙吸干載玻片樣品四周水分，待樣品晾干后置于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察，視野中找到乳酸菌，向載玻片樣品位置滴加I滴香柏油，換用油鏡觀察乳酸菌的染色情況及形態(tài)。[0018]進(jìn)一步的是，在步驟F中，采用如下方法提取乳酸菌菌株的基因組DNA:首先，取過夜培養(yǎng)乳酸菌細(xì)胞加入離心管中，在lOOOOrpm室溫下離心lmin，收集菌體，并吸去上清液，然后加入180ul溶菌酶溶液，重懸菌液，在37°C的水中進(jìn)行水浴30~60min，接著加入20ul蛋白酶K溶液，在56°C的水中進(jìn)行水浴30min至細(xì)胞完全裂解，再加入200ul溶液BD，在70°C的水中水浴lOmin，再加入200ul無水乙醇，充分顛倒混勻，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，在12000rmp室溫下離心3min，倒掉濾液，然后向吸附柱中加入500ul溶液PW,在1000Ormp室溫下離心lmin,倒掉濾液,再向吸附柱中加入500ul漂洗液Wash buffer,在1000Ormp室溫下離心lmin,倒掉濾液,將吸附柱重新放入收集管中，在12000rmp室溫下離心2分鐘，除去殘留的漂洗液Wash buffer,取出吸附柱,放入另外一個離心管中，加入50ul預(yù)熱的洗脫液Elution buffer,靜置3min,在1000Ormp室溫離心lmin，收集DNA溶液，即得到提取的基因組DNA。
[0019]進(jìn)一步的是，在步驟F中，從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的具體步驟如下:首先，割取含需回收DNA的瓊脂塊，放入離心管中，稱量凝膠的重量，以Img=Iul換算凝膠的體積，按照凝膠濃度，加入相應(yīng)比例的Binding Buffer II,置于50~6(TC水浴中IOmin,使膠徹底融化，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置2min，在12000rpm室溫下離心lmin，取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一個收集管中，加入500ul Wash Solution,在12000rpm室溫下離心lmin，取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一個收集管中，在12000rpm室溫下離心2min，將吸附柱放入另一根離心管中，在柱子膜中央加40ulElution Buffer放置5min,在12000rpm室溫離心lmin,離心管中的液體即為回收的DNA片段。
[0020]進(jìn)一步的是，在步驟G中，根據(jù)步驟F得到的鑒定結(jié)果，需要選用的菌株為植物乳桿菌LP和魏斯氏菌WB。
[0021]進(jìn)一步的是，在步驟G中，將選取的植物乳桿菌LP、魏斯氏菌WB稀釋至I X IO6Cfu/mL，然后按照容積比例1:3混合制成乳酸菌添加劑。
[0022]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑由第一菌種和第二菌種混合而成，其中第一菌種為植物乳桿菌LP，第二菌種為乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一種菌種，所述第一菌種與第二菌種的容積比例為1:(1~3)，在多花黑麥草進(jìn)行青貯時，將乳酸菌添加劑添加到黑麥草青貯料中，可以大大提高青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值，本發(fā)明所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑制作方法是通過從多花黑麥草本身附著的乳酸菌中分離出產(chǎn)酸能力強(qiáng)、生長旺盛且能提高多花黑麥草青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值的乳酸菌菌株，更加適宜多花黑麥草的貯存，能夠有效提高青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值，在冬春季為家畜提供優(yōu)質(zhì)青綠飼料，解決飼草季節(jié)性供應(yīng)不均的 問題。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑由第一菌種和第二菌種混合而成，其中第一菌種為植物乳桿菌LP，第二菌種為乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一種菌種，所述第一菌種與第二菌種的容積比例為1: (I~3)，在多花黑麥草進(jìn)行青貯時，將乳酸菌添加劑添加到黑麥草青貯料中，可以大大提高青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)價值，在冬春季為家畜提供優(yōu)質(zhì)青綠飼料，解決飼草季節(jié)性供應(yīng)不均的問題。其中植物乳桿菌LP為Lactobacillus pi ant arum的縮寫，乳酸乳球菌LL為LactococcusIactis的縮寫，融合魏斯氏菌WF為Weissella confuse的縮寫，魏斯氏菌WB為Weissellacibaria的縮寫。
[0024]將植物乳桿菌LP、乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB分別稀釋至I X 106cfu/mL，然后按照下表所述的組分和比例混合后添加到黑麥草青貯料中，添加水平為2mL/kgFM，其中FM表示鮮重，黑麥草青貯前的營養(yǎng)成分含量為對照I，添加相同量無菌水的黑麥草青貯料作為對照2，其青貯45天后，對青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，其
結(jié)果如下表所示:
[0025]
【權(quán)利要求】
1.用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑，其特征在于:所述添加劑由第一菌種和第二菌種混合而成，其中第一菌種為植物乳桿菌LP，第二菌種為乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一種菌種，所述第一菌種與第二菌種的容積比例為1:(I ~3)。
2.如權(quán)利要求1所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑，其特征在于:所述第二菌種為魏斯氏菌WB。
3.如權(quán)利要求2所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑，其特征在于:所述植物乳桿菌LP與魏斯氏菌WB的容積比例為1:3。
4.用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑制作方法，其特征在于包括以下步驟: A、制備乳酸菌培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基各組分加入容器中，然后進(jìn)行加熱攪拌，待所有組分都充分溶解后，裝入培養(yǎng)皿中并將其密封，然后將其放置于高壓滅菌爐中進(jìn)行滅菌處理，滅菌處理結(jié)束后，取出培養(yǎng)皿，將其放置于無菌操作臺上，開啟紫外燈對其照射一段時間，照射結(jié)束后吹風(fēng)使培養(yǎng)基凝固； B、制備多花黑麥草的綠汁發(fā)酵液，將多花黑麥草原料剪切成2~3cm長的碎段，將切碎后的原料加入高速組 織勻漿機(jī)中，再加入無菌蒸餾水進(jìn)行攪碎，將攪碎的汁液用紗布過濾，用量筒稱量濾液容積，加入相應(yīng)重量的葡萄糖以使濾液中葡萄糖濃度達(dá)到20g/L，充分混勻后倒入容量瓶中，濾液要裝滿容量瓶且不留空氣，將容量瓶蓋子蓋好并用膠布纏繞密封； C、從綠汁發(fā)酵液中分離、純化乳酸菌，將步驟B制得的綠汁發(fā)酵液置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中厭氧發(fā)酵48h，從綠汁發(fā)酵液放置在30°C恒溫培養(yǎng)箱中厭氧發(fā)酵開始，每隔4h在無菌操作臺上打開一瓶綠汁發(fā)酵液，用接種針蘸少許中層發(fā)酵液后在培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，每瓶綠汁發(fā)酵液用三個培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，直至第48h全部綠汁發(fā)酵液均進(jìn)行過劃線操作為止，將劃過線的培養(yǎng)基放置在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔兩天在無菌操作臺上用接種針挑取培養(yǎng)基上的單個菌落得到純的乳酸菌菌株； D、對挑取的單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，觀察各個菌株在顯微鏡下的形態(tài)特征從而確定菌株的陰性和陽性； E、對純的乳酸菌菌株進(jìn)行生化鑒定，在無菌操作臺上用接種針挑取單菌落置于含不同糖類的生化鑒定管中，將生化鑒定管用蠟密封后置于35°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，之后根據(jù)生化鑒定管中的顯色反應(yīng)并結(jié)合步驟D得出的結(jié)論對得到的菌株進(jìn)行初步分類； F、對乳酸菌菌株進(jìn)行分子鑒定，具體步驟如下:首先，提取乳酸菌菌株的基因組DNA，其次，對提取的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到瓊脂糖凝膠，接著，從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段，得到PCR產(chǎn)物，最后，對得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，根據(jù)步驟E得出的結(jié)論，將測得的序列與Genbank中的已知序列進(jìn)行比對,尋找同源性最高的菌種,從而確定菌株的類別； G、混合菌劑的制備，根據(jù)步驟F得到的鑒定結(jié)果，將需要選用的植物乳桿菌LP、乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB的菌株分離出來接種于MRS液體培養(yǎng)基中， 然后在30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后將各菌液稀釋至I X 106cfu/mL,將植物乳桿菌LP作為第一菌種，乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一種菌種作為第二菌種，按照第一菌種與第二菌種的容積比例為1:(I~3)混合制成乳酸菌添加劑。
5.如權(quán)利要求4所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑制作方法，其特征在于:在步驟A中，所述培養(yǎng)基成分為:水100000份，蛋白胨1000份，牛肉膏1000份，酵母膏500份，葡萄糖2000份，吐溫80100份，K2HP04200份，乙酸鈉500份，檸檬酸銨200份，MgSO4.7H2058 份，MnSO4.4H2025 份，瓊脂 2000 份。
6.如權(quán)利要求5所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑制作方法，其特征在于:在步驟D中，所述革蘭氏染色的具體步驟如下:將載玻片消毒滅菌后置于無菌操作臺上晾干，用移液管向載玻片中央滴一小滴無菌蒸餾水，用接種針挑取一部分乳酸菌單菌落置于載玻片上的無菌水中并攪拌混勻，手持載玻片一端，載有乳酸菌的液滴朝上，將載玻片中央在酒精燈火焰最外層處來回通過數(shù)次，使水分蒸發(fā)，載玻片冷卻后染色，向載玻片上樣品位置滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液I~2滴，染色I(xiàn)min后傾斜載玻片，用自來水沿一端緩慢沖洗，直至沖下的水為無色為止，接著向載玻片樣品位置滴加碘液I~2滴，染色I(xiàn)min后用自來水沖洗，至沖下的水為無色為止，再向載玻片樣品位置滴加復(fù)紅乙醇溶液，染色I(xiàn)min后用自來水沖洗至沖下的水為無色，用吸水紙吸干載玻片樣品四周水分，待樣品晾干后置于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察，視野中找到乳酸菌，向載玻片樣品位置滴加I滴香柏油，換用油鏡觀察乳酸菌的染色情況及形態(tài)。
7.如權(quán)利要求6所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑制作方法，其特征在于:在步驟F中，采用如下方法提取乳酸菌菌株的基因組DNA:首先，取過夜培養(yǎng)乳酸菌細(xì)胞加入離心管中，在1000Orpm室溫下離心lmin，收集菌體，并吸去上清液，然后加入180ul溶菌酶溶液，重懸菌液，在37°C的水中進(jìn)行水浴30~60min，接著加入20ul蛋白酶K溶液，在56°C的水中進(jìn)行水浴30min至細(xì)胞完全裂解，再加入200ul溶液BD，在70°C的水中水浴lOmin，再加入200ul無水乙醇，充分顛倒混勻，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加入吸附柱中，靜置2min,在12000rmp室溫下離心3min,倒掉濾液,然后向吸附柱中加入500ul溶液PW,在1000Ormp室溫下離心lmin,倒掉濾液,再向吸附柱中加入500ul漂洗液Washbuffer,在1000Ormp室溫下離心lmin,倒掉濾液,將吸附柱重新放入收集管中，在12000rmp室溫下離心2分鐘，除去殘留的漂洗液Wash buffer,取出吸附柱,放入另外一個離心管中，加入50ul預(yù)熱的洗脫液Elution buffer,靜置3min,在1000Ormp室溫離心lmin,收集DNA溶液，即得到提取的基因組DNA。
8.如權(quán)利要求7所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑制作方法，其特征在于:在步驟F中，從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的具體步驟如下:首先，割取含需回收DNA的瓊脂塊，放入離心管中，稱量凝膠的重量，以Img=Iul換算凝膠的體積，按照凝膠濃度，加入相應(yīng)比例的Binding Buffer II，置于50~60°C水浴中l(wèi)Omin，使膠徹底融化，將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置2min,在12000rpm室溫下離心lmin,取下吸附柱,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一個收集管中，加入500ul Wash Solution,在12000rpm室溫下離心lmin，取下吸附柱，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一個收集管中，在12000rpm室溫下離心2min，將吸附柱放入另一根離心管中，在柱子膜中央加40ul Elution Buffer放置5min，在12000rpm室溫離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段。
9.如權(quán)利要求4所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑制作方法，其特征在于:在步驟G中，根據(jù)步驟F得到的鑒定結(jié)果，需要選用的菌株為植物乳桿菌LP和魏斯氏菌WB。
10.如權(quán)利要求9所述的用于多花黑麥草的青貯用乳酸菌添加劑制作方法，其特征在于:在步驟G中，將選取的植物乳桿菌LP、魏斯氏菌WB稀釋至lX106cfu/mL，然后按照容積比例1:3混合制成乳 酸菌添加劑。
【文檔編號】C12N1/20GK103981136SQ201410214857
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】楊春華, 劉剛, 賈露潔, 李達(dá)旭, 劉琳, 郭麗娟, 王目森 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)