專利名稱：一種微生物青貯菌株和復(fù)合菌及其用于生產(chǎn)青貯飼料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物飼料添加劑領(lǐng)域中的菌種及其菌種的復(fù)合菌，具體是指在青貯飼料中微生物添加劑所用的乳酸鏈球菌及其與其它菌種的復(fù)合菌。
本發(fā)明還涉及一種利用乳酸鏈球菌與其它菌種配伍的微生物青貯復(fù)合菌用于生產(chǎn)青貯飼料的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)農(nóng)作物秸稈資源擁有量居世界首位，年產(chǎn)秸稈6億噸，青粗飼料約5.7億噸。其中42％直接或過腹還田，30％作為農(nóng)用燃料，8％作工業(yè)或其他用途，20％約1.2億噸剩余未被利用，造成潛在飼料資源的極大浪費(fèi)。
為防止農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中對(duì)各種資源的破壞和浪費(fèi)，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)環(huán)境的污染，做到農(nóng)業(yè)發(fā)展與資源和環(huán)境相互協(xié)調(diào)，是當(dāng)今全球范圍內(nèi)對(duì)可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)的戰(zhàn)略要求。我國(guó)是一個(gè)人口眾多而農(nóng)業(yè)資源相對(duì)短缺的國(guó)家，狠抓資源的節(jié)約和綜合利用，在大力提高資源利用率的同時(shí)，保護(hù)生態(tài)與環(huán)境，也是我國(guó)整個(gè)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一項(xiàng)戰(zhàn)略措施。農(nóng)作物秸稈中含有大量有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀和微量元素，分析表明，每100千克鮮秸稈中含氮0.48千克，磷0.38千克，鉀1.67千克，相當(dāng)于2.4千克氮肥，3.8千克磷肥，3.4千克鉀肥。根據(jù)農(nóng)業(yè)部《關(guān)于1996-2000年全國(guó)秸稈養(yǎng)畜過腹還田項(xiàng)目發(fā)展綱要》，全國(guó)青貯和氨化秸稈兩項(xiàng)合計(jì)年節(jié)約飼料用糧4000萬(wàn)噸，差不多相當(dāng)于到本世紀(jì)末計(jì)劃增產(chǎn)的全部糧食產(chǎn)量。所以利用青貯秸稈發(fā)酵養(yǎng)畜將是我們未來發(fā)展的一個(gè)大方向，大趨勢(shì)。而高效利用秸稈青貯養(yǎng)畜，不僅可以獲取畜產(chǎn)品，改善人們的膳食結(jié)構(gòu)，糞肥還田，改善土壤，改善生態(tài)環(huán)境，形成農(nóng)牧業(yè)的良性循環(huán)，而且可以節(jié)約大量的糧食，緩解耕地減少及糧食的供需矛盾，這對(duì)于農(nóng)業(yè)發(fā)展和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有十分重大的戰(zhàn)略意義。
飼料青貯技術(shù)的研究及推廣應(yīng)用已有上百年的歷史。青貯飼料對(duì)草食動(dòng)物，尤其是對(duì)奶牛已成為不可缺少的常規(guī)飼料。近年來在我國(guó)推廣的氨化飼料，不僅成本高、耗能高、與農(nóng)業(yè)爭(zhēng)化肥、污染環(huán)境，有些方法對(duì)牲畜還有毒副作用。現(xiàn)代青貯技術(shù)中關(guān)鍵技術(shù)的突破成為今后發(fā)展青貯飼料的關(guān)鍵因素，微生物優(yōu)良菌株的選育、復(fù)合菌種的有效配伍及發(fā)酵工藝的研究成為本發(fā)明突破這項(xiàng)技術(shù)的核心所在。
七十年代，國(guó)外學(xué)者曾利用高活性的木霉纖維素酶在工業(yè)生產(chǎn)條件下，將纖維素幾乎全部轉(zhuǎn)化成纖維二糖與葡萄糖。日本有人結(jié)合堿化處理，用木霉纖維素酶分解粗飼料中的纖維素，其分解率(重量減少)可達(dá)80％。Jbolin(新西蘭，1989)用厭氧瘤胃菌在純凈狀態(tài)下發(fā)酵大麥秸稈，加快了秸稈的消化；Pemir(1989)用孢子絲菌和念珠菌粉劑固體發(fā)酵小麥秸稈，增加了氮素利用；Sukhumavasi(泰國(guó)，1989)從堆肥中分離出厭氧的纖維素分解菌Clostridium josui FERM p-9684，它對(duì)纖維素有極強(qiáng)的水解能力，其主要的發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇和乙酸；Kostyukovskii(俄羅斯，1990)從牛瘤胃液中分離出Neocallimastix 71和Piromonas 12兩種菌，它們都含有可以分解纖維素和木質(zhì)素的酶；Jung等人和Sundstol等人(1992)用真菌對(duì)大麥秸稈進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，秸稈經(jīng)真菌好氧發(fā)酵后，其體內(nèi)消化率與干物質(zhì)的損失成正比，并且真菌孢子會(huì)造成飼料和環(huán)境污染，至今沒有應(yīng)用。U.S.Pat No4842871、4981705、5747020、6054148都是這方面有關(guān)青貯微生物菌劑的研究，但是對(duì)于綜合解決青貯飼料發(fā)酵過程中抑制腐敗菌、防止二次發(fā)酵，有效控制有機(jī)酸和降解木質(zhì)纖維素，降低成本、易于被農(nóng)民應(yīng)用等方面存在問題。
我國(guó)從20世紀(jì)60年代以來，就有學(xué)者開始在該領(lǐng)域進(jìn)行研究，主要在木霉和人工瘤胃兩方面做了不少工作，均因生產(chǎn)工藝、設(shè)備條件不足未能推廣。黃立光(1990)報(bào)道了用木霉菌發(fā)酵水稻秸稈飼喂家兔；畢東輝等(1992)利用熱噴—微生物處理兩步法生產(chǎn)秸稈飼料，其粗蛋白等成分含量有較大提高；張景宏等(1994)用多菌株聯(lián)合發(fā)酵處理秸稈粉，粗蛋白提高94.5％；趙小立等(1996)研究了黑曲霉HD9478纖維素酶固體發(fā)酵條件；劉思方等(1996)用好氧菌直接發(fā)酵，對(duì)植物秸稈微生物飼料的生產(chǎn)工藝及飼喂效果做了研究分析；尚太成等(1998)采用雙重發(fā)酵(需氧發(fā)酵、厭氧發(fā)酵)新工藝降解棉稈木質(zhì)纖維素，增加微生物蛋白質(zhì)和適口性，提高采食量及消化率。中國(guó)發(fā)明專利93110883公開了一種“飼用微生物添加劑制造方法及用途”，該專利合理利用了芽孢桿菌作為飼用添加劑，但只是芽孢桿菌沒有涉及到其他有益的飼用添加劑的菌群。中國(guó)發(fā)明專利02112909.6申請(qǐng)了“一種微生物青貯飼料添加劑及其制備方法”，該項(xiàng)技術(shù)采用乳酸桿菌作為發(fā)酵促進(jìn)劑，以長(zhǎng)雙歧桿菌作為后續(xù)發(fā)酵菌種，采用兩次發(fā)酵技術(shù)，不利于青貯飼料的有效控制。中國(guó)發(fā)明專利93110883.7和01102202.7是有關(guān)“利用微生物秸稈發(fā)酵劑生產(chǎn)秸稈蛋白飼料的方法”，盡管在技術(shù)中采用復(fù)合菌種的優(yōu)化組合，但是針對(duì)農(nóng)作物黃貯秸稈生產(chǎn)的飼料。中國(guó)發(fā)明專利97192289.6公開一種動(dòng)物飼料的技術(shù)，但是針對(duì)的是非反芻動(dòng)物的飼料添加劑。
當(dāng)前在青貯微生物飼料添加劑方面主要采用以下兩方面技術(shù)手段。一是外加防腐劑、有機(jī)酸或無機(jī)酸，即屬于添加發(fā)酵抑制劑，以停止青貯飼料中的微生物的活動(dòng)，從而達(dá)到保藏的目的；另一項(xiàng)是微生物青貯技術(shù)的研究，即屬于發(fā)酵促進(jìn)劑技術(shù)領(lǐng)域。但是對(duì)于綜合解決青貯飼料發(fā)酵過程中抑制腐敗菌、防止二次發(fā)酵，控制有機(jī)酸和降解纖維素，降低成本、易于被農(nóng)民應(yīng)用等方面存在的問題還沒有得以有效解決，而且也沒有涉及到有關(guān)高產(chǎn)乳酸菌株的選育、菌株配伍和發(fā)酵工藝的優(yōu)化控制等重要技術(shù)工藝，這已成為發(fā)展優(yōu)質(zhì)青貯飼料的技術(shù)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種微生物青貯菌株和復(fù)合菌及其用于生產(chǎn)青貯飼料的方法，通過高效選育到的乳酸鏈球菌和植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌三株菌組成高活性復(fù)合微生物添加劑，本發(fā)明有效解決了青貯飼料發(fā)酵中的技術(shù)難題，同時(shí)方便農(nóng)民，簡(jiǎn)單實(shí)用。
本發(fā)明目的實(shí)現(xiàn)通過以下技術(shù)方案
本發(fā)明通過引進(jìn)國(guó)外優(yōu)良菌種，經(jīng)過誘變、篩選出一種具有優(yōu)良產(chǎn)乳酸特性的青貯微生物菌株，經(jīng)微生物學(xué)鑒定，確定為乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis CGMCC.No.0878)。
該菌種的培養(yǎng)基配方，包括平板培養(yǎng)基玉米漿2％-5％，可溶性淀粉2％-2.5％，CaCO32-3％，瓊脂1-3％，PH6.8-7.0，1.0-1.6％溴甲酚酚紫乙醇溶液1.5-2.0毫升，121℃，滅菌25-40分鐘；搖瓶培養(yǎng)基可溶性淀粉2％，玉米漿2％-4％，酵母粉0.2％-0.5％，CaCO30.05-0.15％，土溫80(Tween80)0.05-0.15％，PH 6.8-7.0。
同時(shí)，在乳酸鏈球菌的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種以乳酸鏈球菌為主體菌與植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌混合復(fù)配生產(chǎn)的高活性微生物青貯菌劑。本發(fā)明還提供了這種高活性微生物青貯菌劑的生產(chǎn)工藝，該工藝已具備規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)能力。
本發(fā)明提供了一種乳酸鏈球菌株，命名為乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis CGMCC.No.0878)，該菌乳酸產(chǎn)率高，能有效控制青貯發(fā)酵過程，抑制其它腐敗病菌，防止青貯飼料二次發(fā)酵，為反芻家畜提供酸甜可口、適口性好的青貯飼料，提高其采食量。該主體乳酸鏈球菌菌株已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址中國(guó)北京中關(guān)村2714信箱，郵編100080。保藏日期是2003年01月13日，保藏號(hào)是CGMCC.No.0878。該乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)，為兼性厭氧產(chǎn)乳酸菌。在青貯剛開始階段，能迅速繁殖，產(chǎn)生大量乳酸，迅速降低PH，有效控制青貯過程?？稍谳^大溫度范圍30℃-38℃內(nèi)生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度范圍為35℃-38℃，最適生長(zhǎng)溫度為37℃，生長(zhǎng)PH范圍為3.0-7.8。依照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(第二卷)，鑒定為乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)。本發(fā)明進(jìn)一步建立了菌種保藏、復(fù)壯及選育的系統(tǒng)工藝流程技術(shù)。
本發(fā)明涉及到的其它菌株都來源于國(guó)家農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心，可以通過市場(chǎng)購(gòu)得。
本發(fā)明提供一種高活性微生物青貯復(fù)合菌，是以乳酸鏈球菌(CGMCC.No.0878)為主體菌與植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌通過不同比例混合組成青貯微生物菌劑，其達(dá)到的技術(shù)效果相同。
本發(fā)明中是由一份產(chǎn)朊假絲酵母菌(Candida utilis)與一至四份乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)混合配伍組成，每份以重量比計(jì)。最佳配伍比例之一為以乳酸鏈球菌為主體菌混合植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌組成，其用量為比是1∶(0.5-1)∶(0.5-1)∶(0.2-0.5)。
本發(fā)明還提供了以乳酸鏈球菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌混合配伍組成的菌劑，其用量為比是1∶(0.5-1)∶(0.2-0.5)；以及乳酸鏈球菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌混合配伍組成的菌劑，其用量為比是1∶(0.5-1)∶(0.5-1)；以及乳酸鏈球菌和枯草芽孢桿菌混合配伍組成的菌劑，其用量為比是1∶(0.5-1)，這幾組的使用效果相同。
本發(fā)明提供一種高活性微生物青貯復(fù)合菌劑的生產(chǎn)工藝，其包括乳酸鏈球菌(CGMCC.No.0878)、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌4種菌的發(fā)酵工藝。
本發(fā)明中乳酸鏈球菌(CGMCC.No.0878)的發(fā)酵工藝為取斜面1支在37℃培養(yǎng)24小時(shí)，鏡檢，菌體應(yīng)健壯無雜菌，挑取2-3環(huán)接種到搖瓶，接4瓶，200毫升/瓶，在37℃，100rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)15小時(shí)，OD540 30×達(dá)0.32左右時(shí)，接種至25升種子罐，在一定條件下培養(yǎng)6小時(shí)，OD540 30×達(dá)0.3左右進(jìn)入250升發(fā)酵罐，流加氨水控制PH6.8-7，發(fā)酵4小時(shí)左右進(jìn)行補(bǔ)料玉米漿1.7升，淀粉340克，8小時(shí)-10小時(shí)下罐離心。
本發(fā)明以選擇高活性微生物青貯復(fù)合菌產(chǎn)量較高的發(fā)酵條件為優(yōu)選工藝條件。優(yōu)選發(fā)酵溫度32℃-38℃，通氣量2vvm-10vvm，攪拌速度為250rpm，發(fā)酵周期8小時(shí)-24小時(shí)。
本發(fā)明在中的高活性微生物青貯復(fù)合菌劑符合1999年7月26日國(guó)家農(nóng)業(yè)部105號(hào)公告《允許使用的飼料添加劑品種》。本發(fā)明已通過250升、3000升發(fā)酵罐中試，發(fā)酵周期8小時(shí)-24小時(shí)，發(fā)酵液產(chǎn)菌率≥1.0％，總收率≥90％；菌粉質(zhì)量指標(biāo)菌劑水分≤7％，活菌數(shù)≥1×1010c/g，12個(gè)月內(nèi)復(fù)活率≥90％，霉菌、腐敗菌不得檢出。
本發(fā)明生產(chǎn)的高活性微生物青貯菌劑可廣泛用于生產(chǎn)青貯飼料，使用該菌劑生產(chǎn)青貯飼料的工藝過程控制非常重要。
一、青貯制作過程中青貯發(fā)酵的關(guān)鍵青貯發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物活動(dòng)和生物化學(xué)變化過程。青貯過程中，參與活動(dòng)和作用的微生物種類很多，主要以乳酸菌為主。青貯的成敗主要決定于乳酸發(fā)酵的程度。青貯料之所以能長(zhǎng)期保存不壞，是由于有機(jī)酸產(chǎn)生菌發(fā)酵作用使得酸性增強(qiáng)，抑制了腐敗菌生長(zhǎng)。要使青貯通過細(xì)菌的作用，能迅速地產(chǎn)生足量的乳酸，抑制其它有害菌種，從而使原料能夠正常發(fā)酵，最關(guān)鍵的兩點(diǎn)是(1)青貯原料要有足量的糖分，既必須含有最低需要的含糖量；(2)青貯中保證排盡空氣，裝填緊密，造成無氧條件。這樣，厭氣性的乳酸菌才能旺盛的繁衍，產(chǎn)生大量的乳酸，青貯飼料的發(fā)酵就進(jìn)入正常過程，青貯制作就易于成功。
原料中的糖類和淀粉含量高，有利于這類微生物的生長(zhǎng)。所以，選用含糖分2％-6％的原料可以制成優(yōu)質(zhì)青貯，而含糖量低于2％的則不易成優(yōu)質(zhì)的青貯。排氣是為了造成無氧條件，除制作青貯時(shí)壓緊外，還可加水提高排氣成效。過干的玉米秸或使用摘穗后的玉米秸，做青貯時(shí)加水，能提高糖分的溶解度，也有利于糖分均勻分布，加速發(fā)酵?？刂魄噘A原料的含水量65-70％是提高青貯成功率的有效手段。
二、微生物青貯復(fù)合菌制作青貯飼料的工藝1、建窖窖應(yīng)建在地勢(shì)高、地下水位低，排水容易、土質(zhì)堅(jiān)硬、距離畜舍較近的地方。青貯窖可用石塊(磚)、砂、水泥等材料建造，窖底及四周應(yīng)光滑平整，不滲水。最好將窖建成倒梯形，便于原料自然下沉，且窖內(nèi)周壁青貯料不易變質(zhì)。一般每立方米容量可裝填青秸稈550千克-600千克、干秸稈450千克-500千克。建1個(gè)裝4噸-5噸青貯料的窖，需建長(zhǎng)2.5米、上口寬2米、下口寬1.5米、深1.8米的容量。若養(yǎng)畜頭數(shù)較多，最好同時(shí)建兩個(gè)窖，以利交替使用。青貯窖要在使用前7-10天建好待用，以利于密封發(fā)酵，防霉保質(zhì)。
2、原料準(zhǔn)備(1)青貯原料青貯原料要適時(shí)收割，青貯玉米選在乳熟期末至蠟熟期刈割，苜蓿宜選在現(xiàn)蕾期至初花期收割。應(yīng)保證原料清潔、無污染、無霉?fàn)€變質(zhì)。入窖前，將原料切短至2厘米-3厘米。
(2)食鹽每噸原料需準(zhǔn)備6千克-8千克食鹽。
(3)聚乙烯塑料薄膜按青貯窖的大小準(zhǔn)備適量。
3、菌劑活化每2克微生物青貯菌劑可處理青貯原料(整株玉米、玉米秸、苜蓿、各種牧草等)1噸。將青貯菌劑2克倒入200毫升清水中，每100毫升水中可加白砂糖0.8克-1克，在常溫下約經(jīng)0.5小時(shí)-1小時(shí)菌劑即可活化。
4、菌液配制根據(jù)需處理原料的含水量來判斷加水量，含水量在65％-70％的原料，每噸需加水50千克-70千克。在適當(dāng)?shù)娜萜髦袑⑺渲瞥?.8％-1.2％食鹽水溶液，然后，把預(yù)先活化好的菌劑倒入其中拌勻，備用。配制的菌種應(yīng)于當(dāng)日用完，最好隨配隨用。
5、裝窖和封窖入窖原料的含水量應(yīng)控制在65％-70％。檢查方法是抓一把切短的原料，用力擠壓30秒，如松開手后料團(tuán)慢慢散開，手不濕，表明其含水量為60％-70％，正適合用于青貯。過干或過濕可加水或加料予以調(diào)節(jié)。原料應(yīng)分層(大型窖分段)入窖，裝填至30厘米-40厘米厚時(shí)，撒一遍食鹽(按總量每層均勻分配)，噴灑一遍菌液，攪拌均勻后，人工踩壓，大型窖可用小四輪或鏈軌式拖拉機(jī)壓實(shí)，盡量排盡原料中的空氣。裝一層，噴灑一遍菌液，并壓實(shí)。待原料裝填壓實(shí)到高于窖面40厘米-60厘米時(shí)，壓實(shí)一次，在上面撤一層食鹽(每平方米200克-300克)，覆上一層聚乙烯塑料膜，再掩蓋一層20厘米-30厘米厚的黃土，將窖密封嚴(yán)實(shí)。原料入窖必須在1天-2天內(nèi)完成，大型窖可分段裝填、分段封窖，否則易造成原料腐爛、變質(zhì)，影響發(fā)酵的效果。
6、檢查質(zhì)量裝窖密封20天-30天即發(fā)酵完畢，可開窖檢查。質(zhì)量好的飼料呈黃綠色，有酸香味。
7、飼喂方法開窖時(shí)，應(yīng)從一邊開啟，分段取用，在取喂貯料時(shí)，要用多少取多少，每次取出量的多少以在當(dāng)天喂完為準(zhǔn)，每次取完料時(shí)應(yīng)立即再用薄膜把取口封嚴(yán)，以防貯料二次發(fā)酵，發(fā)霉變質(zhì)。初喂時(shí)要由少到多，讓牛、羊等家畜有個(gè)逐步適應(yīng)的過程，適應(yīng)期一般為3天-7天，逐漸增加到正常飼喂量。每天每頭家畜的飼喂量是犢牛5千克-8千克，成年育肥牛15千克-18千克，羊2千克-3千克。有益效果1、青貯原料來源豐富，作物秸稈(如玉米秸稈、麥秸、稻秸等)、各種野草、牧草、地瓜秧、樹葉等，都可以用作青貯的原料。飼料青貯技術(shù)可以充分利用當(dāng)?shù)刎S富的飼草資源，特別是利用大量的玉米秸稈青貯飼喂肉牛，大大減少玉米秸稈的浪費(fèi)。
2、青貯飼料營(yíng)養(yǎng)豐富，在制作時(shí)，整株秸稈(包括桿、莖、葉)都可用于青貯，秸稈的綠色和葉片可以保存下來。所以，能保存作物秸稈中大部分(85％以上)的養(yǎng)分，粗蛋白質(zhì)及胡蘿卜素?fù)p失量也較小(一般青飼料曬干后養(yǎng)分損失30％至40％，維生素幾乎全部損失)。
3、利用添加微生物青貯復(fù)合菌劑制作青貯飼料技術(shù)，厭氧發(fā)酵3天-7天PH可降至3.8-4.2，青貯30天后PH穩(wěn)定于3.7-4.2，生產(chǎn)的青貯飼料各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)良，具酸香味、呈黃綠色后，纖維素、半纖維素降低10％-20％，體外消化率提高10％-20％。
4、經(jīng)飼喂試驗(yàn)表明，適口性明顯改善，采食量提高10％-15％。產(chǎn)奶量提高5％-8％，羊、犢牛日增重提高8％-12％。
5、青貯飼料柔軟多汁、氣味酸甜芳香，適口性好，能促進(jìn)消化腺的分泌，對(duì)于提高飼料的消化率有良好作用。
6、青貯飼料的制作方法簡(jiǎn)便、成本小，不受氣候和季節(jié)限制，飼草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可長(zhǎng)期保存，能滿足家畜冬春季乃至全年飼喂青綠飼料的需要。


圖1為青貯微生物菌種的選育研究流程2為中試生產(chǎn)工藝流程3為利用微生物青貯復(fù)合菌劑生產(chǎn)青貯飼料流程圖
具體實(shí)施例方式青貯微生物菌種的選育可參見圖1。微生物菌劑中試生產(chǎn)工藝可參見圖2，利用微生物青貯復(fù)合菌劑生產(chǎn)青貯飼料可參見圖3。
實(shí)施例一青貯菌種中乳酸鏈球菌及其功能乳酸鏈球菌，Streptococcus lactis，兼性厭氧產(chǎn)乳酸菌。在青貯剛開始的階段，能迅速繁殖，產(chǎn)生大量乳酸，迅速降低PH，有效控制青貯過程。
1.1 菌種培養(yǎng)平板培養(yǎng)基玉米漿3％，可溶性淀粉2.3％，CaCO32％，瓊脂2％，pH6.8-7.0，1.6％溴甲酚酚紫乙醇溶液1.6ml，121℃，30分鐘滅菌；斜面培養(yǎng)基不加溴甲酚酚紫乙醇溶液，其余成分同上，制成斜面(先分裝后滅菌，或先滅菌后分裝)。
菌種活化從斜面菌種或發(fā)酵液在平板上分區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)24小時(shí)-48小時(shí)，得單菌落(周圍培養(yǎng)基因產(chǎn)酸變黃)。若菌種保藏時(shí)間長(zhǎng)，可多活化一次斜面接種挑選平板上生長(zhǎng)好的單菌落，斜面劃線。
斜面培養(yǎng)37℃，24小時(shí)。
1.2種子培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)基可溶性淀粉2％，玉米漿3％，酵母粉0.3％，CaCO30.1％，Tween80 0.1％，pH6.8-7.0。500ml三角瓶，每瓶裝培養(yǎng)基100ml，121℃，0.1MPa滅菌30分鐘。
接種新鮮斜面(培養(yǎng)好保存不超過2天)1只，取無菌水試管1只(3毫升/只)，倒入無菌水，涮下菌苔，將菌懸液倒入搖瓶(注意無菌操作)。
培養(yǎng)37℃，100rpm，13小時(shí)。
種子檢查(1)測(cè)30倍稀釋液的OD540值(以后測(cè)量的OD540值均為30倍稀釋液)將種子搖瓶中的發(fā)酵液無菌操作倒入接種瓶后，取剩余液0.5毫升，加1毫升2M HCl和13.5毫升的純凈水，搖勻后，測(cè)量其OD540值，應(yīng)為0.28-0.35。
(2)測(cè)種子搖瓶剩余液的PH，應(yīng)為5左右。
(3)剩余液涂片鏡檢，100倍油鏡下觀察，應(yīng)為大量球菌，大小均勻，鏈狀排列，少量成對(duì)。
1.3 7L發(fā)酵配料可溶性淀粉1％，50克；玉米漿5％，250毫升；進(jìn)口酵母粉0.2％10克；CaCO30.1％，5克，Tween800.1％，5毫升；用自來水定容體積5L，調(diào)節(jié)PH6.8-7.0，121℃，0.1MPa滅菌30分鐘，接種前取空白樣，測(cè)OD540值，應(yīng)為0.11-0.13，測(cè)PH，鏡檢，允許有少量菌體(上一罐殘留)。
補(bǔ)料玉米漿50％，淀粉10％，200毫升，PH6.8-7.0，121℃，0.1MPa滅菌30分鐘。
接種上述種子瓶，100毫升接種量。
條件37℃，100rpm，0.02MPa，1.5L/min，氨水控制PH為6.8-7.0。
培養(yǎng)5小時(shí)，OD540值應(yīng)0.24-0.27，補(bǔ)料100毫升；7小時(shí)，OD540值達(dá)到0.36左右時(shí)，補(bǔ)料100毫升；9小時(shí)，OD540值達(dá)到0.38-0.40左右時(shí)，可下罐。
活菌數(shù)取下罐發(fā)酵液1毫升，10倍梯度稀釋，取10-11、10-12、10-13、10-14稀釋液各0.1毫升涂布平板(1.1)，37℃，培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)平板上周圍培養(yǎng)基變黃的單菌落，計(jì)算活菌數(shù)，應(yīng)為1014個(gè)/毫升1.4 25L發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基可溶性淀粉1％玉米漿5％進(jìn)口酵母粉0.20％CaCO30.10％Tween80 0.10％PH6.8-7121℃，0.1MPa滅菌30分鐘培養(yǎng)條件溫度 37℃攪拌速度 100rpm罐壓 0.05MPa-0.1MPa通氣量 1∶0.31.5 250L發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基可溶性淀粉1％玉米漿5％酵母粉0.20％CaCO30.10％Tween80 0.10％PH6.8-7121℃，0.1MPa滅菌30分鐘培養(yǎng)條件溫度 37℃攪拌速度 100rpm罐壓 0.05MPa-0.1MPa通氣量 1∶0.3實(shí)施例二微生物青貯復(fù)合菌是由2克產(chǎn)朊假絲酵母菌(Candida utilis)、1克乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、1克植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、1克枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的混合組成。
用上述的微生物青貯復(fù)合菌發(fā)酵青貯秸稈生產(chǎn)家畜飼料的方法如下1、原料準(zhǔn)備(1)2.5噸整株玉米(蠟熟期刈割)，切碎至2厘米-3厘米；(2)水150千克，加食鹽1.2千克配制成0.8％鹽水溶液；(3)食鹽15千克。
2、菌種復(fù)活用青貯菌劑5克。將青貯菌放入500毫升清水中，加白砂糖4克-5，在常溫下約經(jīng)0.5小時(shí)復(fù)活，再把菌劑倒入預(yù)先食鹽水中溶解。經(jīng)復(fù)活的菌液應(yīng)隨配隨用，最好當(dāng)日用完。
3、裝窖和封窖原料應(yīng)分層入窖，裝填至30厘米-40厘米厚時(shí)，撒一遍食鹽(按總量每層均勻分配)，噴灑一遍菌液，攪拌均勻后，踩壓結(jié)實(shí)，盡量排盡原料中的空氣。裝一層，噴灑一遍菌液和食鹽，并壓實(shí)。待原料裝填壓實(shí)到高于窖面40厘米-60厘米時(shí)，壓實(shí)一次，在上面撒一層食鹽(每平方米200克-300克)，覆上一層聚乙烯塑料膜，再掩蓋一層20厘米-30厘米厚的黃土，將窖密封嚴(yán)實(shí)。原料入窖必須在1天-2天內(nèi)完成。
4、裝窖密封30天可開窖檢查，具酸香味，無腐爛、變質(zhì)說明青貯成功。
5、飼喂方法取料時(shí)，從窖的一邊開始取料，從上層至下層垂直取用，依據(jù)當(dāng)天用量隨取隨用，取后立即封口。每天每頭家畜的飼喂量是犢牛6公斤，成年育肥牛15公斤。
實(shí)施例三微生物青貯復(fù)合菌由2克產(chǎn)朊假絲酵母菌(Candida utilis)、1.5的乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、1克植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、0.5克枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)混合組成。
用上述微生物青貯復(fù)合菌劑生產(chǎn)家畜飼料的方法與實(shí)施例二相同。
實(shí)施例四微生物青貯復(fù)合菌由2克乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、1克植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、2克枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)混合組成。
用上述微生物青貯復(fù)合菌劑生產(chǎn)家畜飼料的方法與實(shí)施例二相同。
實(shí)施例五微生物青貯復(fù)合菌由1克產(chǎn)朊假絲酵母菌(Candida utilis)、2克乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、2克枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)混合組成。
用上述的微生物青貯復(fù)合菌劑生產(chǎn)家畜飼料的方法與實(shí)施例二相同。
實(shí)施例六微生物青貯復(fù)合菌由3克乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、2克枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)混合組成。
用上述的微生物青貯復(fù)合菌劑生產(chǎn)家畜飼料的方法與實(shí)施例二相同。
實(shí)施例七青貯原料的選擇和處理1.原料品種一般是豆科牧草含蛋白質(zhì)量高，比較難以貯存，而禾本科牧草和作物秸桿碳水化合物含量高，易于成功。成功地制作青貯必須要有一個(gè)最低的含糖量標(biāo)準(zhǔn)，如果原料中實(shí)際含糖量高于青貯最低含糖要求，原料就屬于易貯藏類型，如玉米全株、高粱、甘藍(lán)、胡蘿卜、甘薯藤、南瓜等。
低于最低含糖要求的就屬于難貯藏類型，如苜蓿、草木樨、毛莒子、馬鈴薯莖葉等，還有不能單獨(dú)青貯的原料，如南瓜蔓、西瓜蔓等。這類植物含糖量極低，單獨(dú)青貯不易成功。但是，不易于青貯的原料如苜蓿、毛莒子和不能單獨(dú)青貯的原料之間，以2∶1或1∶1配合，可以提高成功率。
2.追肥對(duì)青貯作物的影響追施肥料而肥效未發(fā)揮完以前就割來當(dāng)青貯原料，這種作物的含糖量較低，青貯制作結(jié)果不理想。為了使青貯有良好的發(fā)酵過程，施肥后應(yīng)間隔一定時(shí)間才能割青入窖。
3.生長(zhǎng)期和刈割時(shí)間牧草抽穗后結(jié)籽前是收割青貯的好時(shí)刻。玉米是最好的青貯原料，玉米植株入窖的最好時(shí)機(jī)是乳熟至糊熟期。目前我國(guó)有專用的青貯玉米品種，莖桿高、含糖多，在生產(chǎn)上有良好的效果。但目前廣大農(nóng)區(qū)較多的是用去穗后的玉米秸桿，這種秸桿應(yīng)該貯藏的越早越好，如果玉米秸全部枯黃，也能貯存，稱作黃貯，營(yíng)養(yǎng)成分就很低了。牧草在下午收割可以有較高的含糖量。玉米含糖量較高，青貯時(shí)只要掌握好生長(zhǎng)期，可以在全天任何時(shí)間刈割。
4.切鍘長(zhǎng)短和碾壓青貯原料無論是牧草還是秸桿作物，經(jīng)過碾壓，最好是撕碎，原料變軟壓實(shí)，可以保證青貯質(zhì)量。其作用是增加原汁滲出機(jī)會(huì)，使糖分分布均勻，同時(shí)易于裝填緊密，有利于排盡空氣，家畜容易采食。對(duì)牛、羊來說，細(xì)莖植物如禾本科牧草，豆科牧草，甘薯藤等，切成2～3厘米長(zhǎng)即可。
5、青貯窖本發(fā)明主要采用以下兩種青貯窖
(1)青貯地窖可建成土窖和水泥窖兩種，是一種地壕樣的結(jié)構(gòu)，土窖建造成本低，在雨水較少和排水良好的山區(qū)較為適用；水泥窖壁用磚或石塊砌成，高出地面40-60厘米，內(nèi)壁用水泥抹面，成本較高。地窖的四壁要光滑平直，窖的上端必須比底部寬，以免四周塌土；窖底須形成斜坡，以利排除飼草中過多的汁液。把塑料薄膜鋪在挖好的地窖內(nèi)，使所貯的飼草全部用塑料薄膜包裹起來。
(2)地面青貯窖在雨水較多和地下水位較高的地區(qū)較為適用，其他有條件的地區(qū)，也可建地面永久窖。青貯窖底部在地面以上或稍低于地面，整個(gè)窖壁和窖底都用石塊或磚徹成，內(nèi)壁用水泥抹面，使之平直光滑。窖底部不能滲水，除有一定坡度外，窖的四周應(yīng)有較好的排水道，特別要防止地面水從一端的入口處灌入。本發(fā)明主要采用這類型窖。
6、填裝青貯原料入窖前，要清潔青貯設(shè)施。裝填青貯原料要快捷迅速，避兔空氣分解而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)。一般要求在1-2天完成，填裝時(shí)間越短，青貯品質(zhì)越好。青貯窖的窖底須鋪一層30-40厘米厚的切斷的秸稈軟草，以便吸收青貯汁液。窖壁四周須襯一層塑料薄膜，以加強(qiáng)密封性能和防止漏滲水。原料裝入圓形青貯設(shè)備時(shí)，要一層一層均勻鋪平。
7、貯料壓實(shí)青貯窖裝填原料，須用履帶式拖拉機(jī)或用人力層層壓實(shí)，尤其要注意周邊部位。越緊實(shí)越易造成厭氧環(huán)境，有利于乳酸菌的活動(dòng)和繁殖。在壓實(shí)過程中要注意清潔，不要帶進(jìn)泥土、油垢、鐵釘。鐵絲等，以兔污染青貯原料，并可避免牛羊食后造成瘤胃穿孔。有條件的地區(qū)可以采用真空青貯技術(shù)，即在密封條件下，將原料中的空氣用真空泵抽出，為乳酸菌繁殖創(chuàng)造厭氧條件。
8、密封與管理原料裝填完畢后，立即密封覆蓋，以防止空氣與原料接觸和雨水進(jìn)人。在原料上面蓋一層切斷的秸稈，覆蓋薄膜，再覆上20-30厘米的細(xì)土，踩踏成饅頭形。密封后須經(jīng)常檢查，發(fā)現(xiàn)漏氣要及時(shí)修補(bǔ)從杜絕透氣并防止?jié)B入。
9、青貯菌劑對(duì)于青貯飼料的質(zhì)量判定。
(1)取樣方法開窯后，深入青貯窯70厘米-100厘米深處，按三點(diǎn)取樣法，各抓一把進(jìn)行檢查。
(2)判定標(biāo)準(zhǔn)①合格其顏色青綠色或黃綠色，近于原色，有光澤。其氣味芳香、酒酸味給人舒適感。其質(zhì)地結(jié)構(gòu)濕潤(rùn)、緊密，但容易分離，莖、花、葉保持原狀。
②不合格其顏色黑色或褐色。其氣味有刺鼻腐敗味或霉味。其質(zhì)地結(jié)構(gòu)腐爛、發(fā)粘、結(jié)塊或過干、不成結(jié)構(gòu)。造成不合格飼料是由于以下原因造成的。
一種是酸敗青貯飼料。這種青貯飼料的酸味不足，具有明顯的腐敗臭味，有刺鼻感，多呈深綠色，含水量高，用手觸摸時(shí)感覺粘滑。這種酸敗青貯飼料適口性差，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很低，肉牛若采食過多會(huì)引起拉稀。造成這種劣質(zhì)飼料的主要原因是青貯原料沒有在適期內(nèi)收割，含水量過高，又未進(jìn)行晾曬，或是在青貯過程中和青貯以后有雨水進(jìn)入所造成的。
另一種劣質(zhì)青貯飼料是焦化青貯飼料，具有焦味或霉味，呈褐色或深褐色。其水分含量少，適口性差，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低。造成的原因是青貯原料過于成熟，收割過晚。原料切的過長(zhǎng)，不易壓實(shí)或者裝窯不及時(shí)，延誤時(shí)間過長(zhǎng)，封頂過晚，致使青貯原料因氧化受熱過多。
10、青貯飼料的飼喂方式青貯飼料封窖后，一般經(jīng)過20-30天可開窖取用。取用時(shí)，應(yīng)從一頭開始垂直挖取，分段取料時(shí)，要把窖周圍發(fā)白長(zhǎng)毛或腐爛的仔細(xì)揀出來，每次取料后，青貯窖要用塑料布及時(shí)蓋嚴(yán)密并壓實(shí)，防止第二次發(fā)酵。
飼喂方法初次用青貯飼料喂牛，應(yīng)經(jīng)過3-7天適應(yīng)階段，使牛逐漸習(xí)慣采食青貯飼料，喂量要由少到多，逐漸增多，可以與其他飼料摻和著喂，待牛適應(yīng)后再單喂青貯料。
飼喂量一般每頭每天犢牛5至8千克，成年育肥牛15至18千克，羊2至3千克。
青貯原料的選擇和處理實(shí)施例八復(fù)合菌劑青貯效果將復(fù)合菌劑用于制作整株玉米(乳熟期至蠟熟期刈割)、苜蓿(現(xiàn)蕾期至初花期)或其它各類秸稈、牧草青貯飼料，7天PH可降至4.0，青貯30天后PH穩(wěn)定于3.8，具酸香味、呈黃綠色，纖維素、半纖維素降低20％，體外消化率提高10％。適口性明顯改善，采食量提高10％。產(chǎn)奶量提高8％，羊、犢牛日增重提高10％。
權(quán)利要求
1.一種微生物青貯菌株，及能在青貯過程中有效控制乳酸的乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis CGMCC.No.0878)。
2.如權(quán)利要求1所述的微生物青貯菌株，其特征在于菌種的培養(yǎng)基配方，包括A、平板培養(yǎng)基玉米漿2％-5％，可溶性淀粉2％-2.5％，CaCO32-3％，瓊脂1-3％，PH6.8-7.0，1.0-1.6％溴甲酚酚紫乙醇溶液1.5-2.0毫升，121℃，滅菌25-40分鐘；B、搖瓶培養(yǎng)基可溶性淀粉2％，玉米漿2％-4％，酵母粉0.2％-0.5％，CaCO30.05-0.15％，土溫80(Tween80)0.05-0.15％，PH 6.8-7.0。
3.如權(quán)利要求1所述的微生物青貯菌株，其特征在于該乳酸鏈球菌能在青貯過程中產(chǎn)生大量乳酸，迅速降低PH，有效控制青貯飼料的二次發(fā)酵，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，并具有防腐作用，增加家畜的可口性。
4.一種微生物青貯復(fù)合菌，其特征在于它是由一份產(chǎn)朊假絲酵母菌(Candida utilis)與一至四份乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)混合組成，每份以重量比計(jì)。
5.如權(quán)利要求4所述的一種微生物青貯復(fù)合菌，其特征在于以乳酸鏈球菌為主體菌混合植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌組成，其用量為比是1∶(0.5-1)∶(0.5-1)∶(0.2-0.5)。
6.如權(quán)利要求4所述的一種微生物青貯復(fù)合菌，其特征在于由乳酸鏈球菌、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌組成，其用量為比是1∶(0.5-1)∶(0.2-0.5)。
7.如權(quán)利要求4所述的一種微生物青貯復(fù)合菌，其特征在于由乳酸鏈球菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌組成，其用量為比是1∶(0.5-1)∶(0.5-1)。
8.如權(quán)利要求4所述的一種微生物青貯復(fù)合菌，其特征在于由乳酸鏈球菌和枯草芽孢桿菌組成，其用量為比是1∶(0.5-1)。
9.如權(quán)利要求4所述的一種微生物青貯復(fù)合菌用于生產(chǎn)青貯飼料的方法，其特征在于將高活性的微生物青貯復(fù)合菌接種在鍘短的整株或去穗玉米(乳熟期至蠟熟期刈割)、苜蓿(現(xiàn)蕾期至初花期)或其它各類秸稈、牧草上，在厭氧條件下發(fā)酵數(shù)天。
10.如權(quán)利要求9所述的一種微生物青貯復(fù)合菌用于生產(chǎn)青貯飼料的方法，其特征在于A、青貯原料預(yù)處理，將適時(shí)刈割的青貯原料鍘短至2厘米-3厘米。B、微生物青貯復(fù)合菌劑活化每2克菌劑克處理青貯原料1噸。將青貯菌劑倒入100倍清水中，每100毫升水中可加白砂糖0.8克-1克，在常溫下經(jīng)0.5小時(shí)-1小時(shí)可復(fù)活；制作青貯飼料時(shí)，根據(jù)需處理原料的含水量來判斷加水量，確定加水量后，在適當(dāng)?shù)娜萜髦袑⑺渲瞥?.8％-1.2％食鹽水溶液，然后，把預(yù)先活化好的菌劑倒入其中拌勻，備用。C、青貯原料入窖將鍘短的青貯原料逐層、逐段裝填入窖。D、噴灑菌劑當(dāng)青貯料每裝填30厘米-40厘米厚時(shí)，噴灑一遍配置好的菌劑，注意要邊裝填邊壓實(shí)，菌劑應(yīng)噴灑均勻。E、封窖考慮到在青貯過程中原料往往有一定程度的下沉，裝填原料時(shí)應(yīng)高出地面40厘米-60厘米，上面鋪一層聚乙烯塑料膜密封，再蓋一層20厘米-30厘米厚的黃土，確保將青貯窖密封嚴(yán)實(shí)，不能漏氣、漏水。F、開窖青貯20天-30天后，即可取出飼喂家畜；開窖時(shí)，應(yīng)從一邊開啟，分段取用，用多少，取多少，取好料后，要及時(shí)封好窖口。窖內(nèi)發(fā)酵溫度在25℃-38℃左右，3天-7天PH可降至3.8-4.2，20天-30天后PH穩(wěn)定于3.7-4.2。
11.如權(quán)利要求10所述的微生物青貯復(fù)合菌用于生產(chǎn)青貯飼料的方法，其特征在于經(jīng)過微生物青貯菌劑發(fā)酵所獲得的青貯飼料具有酸香味、呈黃綠色；纖維素、半纖維素較青貯前降低10％-20％，體外消化率提高10％-20％。適口性明顯改善，采食量提高10％-15％。產(chǎn)奶量提高5％-8％，羊、犢牛日增重提高8％-12％。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種主要由乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)與其它三種菌株組成的高活性微生物青貯復(fù)合菌劑，及其將該復(fù)合菌劑用于制作整株玉米、苜?；蚱渌黝惤斩挕⒛敛萸噘A飼料的方法。通過在青貯原料中添加乳酸鏈球菌與其它三種菌株組成的高活性微生物青貯復(fù)合菌劑，在厭氧條件下，乳酸鏈球菌生長(zhǎng)旺盛，大量產(chǎn)酸，迅速降低貯料pH值，同時(shí)產(chǎn)酶菌大量產(chǎn)生纖維分解酶，分解纖維素、半纖維素，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的家畜青貯飼料。該方法解決了目前秸稈青貯中不易控制的技術(shù)難題，同時(shí)解決了液氨氨化和尿素氨化的缺點(diǎn)，在使用該青貯菌劑制作青貯飼料過程中，無需添加成本高和易污染環(huán)境的化學(xué)物質(zhì)，并能夠有效保存各種營(yíng)養(yǎng)成分。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1530437SQ0311914
公開日2004年9月22日 申請(qǐng)日期2003年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月14日
發(fā)明者王煒, 崔衛(wèi)東, 魏東, 馬彩霞, 張慧濤, 侯新強(qiáng), 龍濤, ?，|, 閻論, 王 煒 申請(qǐng)人:新疆威仕達(dá)生物工程股份有限公司