專利名稱：聚-γ-谷氨酸產生菌及生產聚-γ-谷氨酸的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于應用微生物技術領域，具體地說涉及到選育到一株聚-γ-谷氨酸產生菌及其利用該菌株生產聚-γ-谷氨酸的方法。
背景技術：
聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid)是由D型和L型谷氨酸通過肽鍵連接而成的生物可降解型高分子聚合物，平均分子量從10,000到2,000,000道爾頓(Matsukawa等.1997 Hydrophilic surface treating aqueous solution and hydrophilic surfacetreating method，U.S.Patents 5.616,585.Ito，Y.，Tamaka等，1996.Glutamic acidIndependent Production of poly(glutamic acid)by Bacillus subtilis TAM-4，Biosci.Biotechnol.Biochen.601239-1242；Cromwick等，Effect of magnese(II)on Bacilluslicheniformis ATCC9945A physiology and poly-(glutamic acid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267；Cromwick等，1995 b.Investigation by NMR of metabolicroutes to bacterial poly-(glutamic acid)using C13 labeled citrate and glutamateas media carbon sources，An，J.Microbiol.41902-909；Birrer等，1994 γ-poly(glutamic acid)formation of Bacillus lecheniformis 9945APhysiology andbiochemical studies.Int.J.Biol.Micromol.16265-275.)。經純化的聚-γ-谷氨酸在不同的pH條件下，物化特性差異顯著，在弱酸性、中性或堿性條件下，聚-γ-谷氨酸的側鏈帶負電荷，呈伸展狀；在酸性條件下則帶正電，構象呈緊密的球狀(He，L.M等，2000.Bacillus lichenformis γ-glutamyl exopolymerphysiochemicalcharacterization and U(VI)interaction，JP Patent 11240827)。在有Ca2+存在的條件下，聚-γ-谷氨酸在中性環(huán)境中也可呈緊密的球狀構相。聚-γ-谷氨酸及其衍生物作為一種環(huán)保型生物高分子，因其具有良好的水溶性，能徹底被生物降解，對人無毒害甚至可以食用等優(yōu)點，在農業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品、纖維輕化工等領域具有廣闊的應用前景。
聚-γ-谷氨酸具有極其優(yōu)良的吸水性，可用于吸水劑的研制。目前，很多單位開發(fā)出吸水性的高分子化合物作為植物的吸水保濕劑。但是這些人工合成的高分子化合物在自然界不能夠被降解，在吸水的同時又造成了環(huán)境污染。在這方面，聚-γ-谷氨酸具有得天獨厚的優(yōu)勢吸水性強，可自然降解。
在動植物養(yǎng)殖方面，聚-γ-谷氨酸含有大量游離α-羧基對二價金屬離子、農藥、氨基酸等物質具有螯合作用，能夠富集這些離子，并有效供給動植物利用。Kinnersley等報道，施用經聚-γ-谷氨酸富集的Ca2+、Mg2+等二價陽離子，植物可以更有效利用(Kinnersley等，1994，Compisition and method for enhanced fertilizer uptake by plants，pateneWO9409628)。另一方面，飼料中添加0.1～3.0％的聚-γ-谷氨酸，可以降低家禽和家畜的脂肪積累，可用于飼養(yǎng)瘦肉型家禽、家畜以及蛋雞等(Tanimot等，2000，F(xiàn)eed compositioncontaining poly-γ-glutamic acid.JP Patent WO9635339)。
在食品應用方面，Konno等發(fā)現(xiàn)，聚-γ-谷氨酸可以增加面包的彈性，使面包，蛋糕的顆粒更加細致(Konno等，1989，Bakery products and noodles containing polyglutamicacid.U.S.Patents.4，8888，193.)。聚-γ-谷氨酸還可以增強面條的韌性，防止面條中的固體物質溶解在沸水中。Mitsuikzi等在1998年發(fā)現(xiàn)分子量低于20萬的聚-γ-谷氨酸具有比葡萄糖更好的抗凍性，因此聚-γ-谷氨酸的抗凍性，可食用性使聚-γ-谷氨酸可被廣泛的應用于食品加工領域和對深度冷凍敏感的酶或培養(yǎng)物的冷凍保藏(Mitsuiki等，1998，Relationship between the antifreeze activities and the chemical structures ofoligo-and poly(glutamic acid)s.J.Agric.Food.Chem.46891-895)；聚-γ-谷氨酸還可以作為礦質吸收促進劑，有助于人體對礦質元素的吸收。與酪蛋白磷酸肽(CPP)相比，因其具有優(yōu)良的水溶性，吸收效果更佳；而且聚-γ-谷氨酸可以掩蓋高濃度礦質元素所帶來的刺激性、收斂性和粗糙感等適口性問題，尤其適用于補鈣和補鐵的保健品。
由于聚-γ-谷氨酸具有良好的水溶性，對人無毒害，其自身無抗原性，因而在藥物的輸送及緩釋方面的應用倍受矚目。Sakurai研制了一種可用于包埋藥物的復合聚合物，聚-γ-谷氨酸是其中主要的水溶性物質(Sakurai等，1995，Water soluble high molecularweight polymerized drug preparation，U.S.Patent，5,693,751.)。聚-γ-谷氨酸的大量游離α-羧基能夠親和抗原呈遞細胞，并可吸附多種藥物。以聚-γ-谷氨酸骨架為橋梁，抗原呈遞細胞和特定藥物結合形成共軛體，將藥物輸送至靶位點，可大幅度降低藥物的使用量，這樣不僅降低了藥物的使用成本，同時降低藥物對人體的毒害。該方案主要用于治療紅斑狼瘡、風濕性關節(jié)炎和I型糖尿病等。
聚-γ-谷氨酸還被作為藥物直接用于某些疾病的治療，如Kato等早在1984年就報道l-beta-D-arabinofuranosylcyutosine與聚-γ-谷氨酸結合后具有抗腫瘤的活性。此外，Otani等于1998年報道由明膠和聚-γ-谷氨酸組成的水凝膠與水溶性的carbodimides交聯(lián)后可做為軟組織的生物膠，這種物質比傳統(tǒng)的fibrin glue更加有效(Markland等，1999.Modified polypeptides containing γ-benzyl glutamic acid asdrug delivery platforms.Int.J.Pharm.178，183-192；Otani Y等，1998，Effectof additives on gelatin and tissue adhesion of gelatin-poly(L-glutamicacid)mixture，Biomaterials，19，2167-2173.)]。
目前，聚-γ-谷氨酸的生物合成主要通過芽胞桿菌屬的地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)發(fā)酵來獲得產物。據(jù)報道Bacilluslicheniformis 9945a菌株，在含有E培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵中，聚-γ-谷氨酸的產量可達17g/L，分子量在3000kDa以下(Cromwick，等，1995a.Effect of magnese(II)on Bacilluslicheniformis ATCC9945A physiology and γ-poly(glutamic acid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267.)。Ko和Gross于1997年(Ko，等，1998.Effects of glucoseand glycerol on gamma-poly(glutamic acid)formation by Bacillus licheniformis ATCC9945a.Biotechnology and Bioengineering.57(4)430-436.)發(fā)現(xiàn)利用葡萄糖和甘油的混合碳源，可以提高聚-γ-谷氨酸的產量。他們認為對于Bacillus licheniformisATCC9945a來說，葡萄糖是比甘油更有利于細胞生長的碳源，同時菌體細胞對葡萄糖的利用也比甘油、檸檬酸、谷氨酸快。但是，發(fā)酵培養(yǎng)基中缺乏甘油將會導致聚-γ-谷氨酸產率的急劇下降。把培養(yǎng)基中甘油的含量從40克/升降至0，經96小時的培養(yǎng)，聚-γ-谷氨酸的濃度從對照的20.5克/升降至5.7克/升。對于甘油的這種增效作用現(xiàn)在還沒有很好的解釋。此外，高濃度的葡萄糖會使地衣芽胞桿菌會產生多糖類的副產物。Ito等在1996年發(fā)現(xiàn)葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖比乳糖、半乳糖和甘油更適合Bacillus subtilis TAM-4合成聚-γ-谷氨酸，在適合條件下，該菌株最高可產生22.1克/升聚-γ-谷氨酸。枯草芽胞桿菌IFO3335需要L-谷氨酸，檸檬酸和硫酸銨作為碳源來合成聚-γ-谷氨酸，產量達到20克/升?？莶菅堪麠U菌(natto)在含麥芽糖、豆油和甘油的MSG培養(yǎng)基中可產生35克/升聚-γ-谷氨酸(Ogawa等，1991 Purification and properties of γ-glutamyltranspeptidasefrom Bacillus subtilis(natto).Agric.Biol.Chem.55(12)2971-2977.)。
在目前普遍使用的菌種Bacillus licheniformis ATCC 9945a、Bacillussubtilis(natto)合成聚-γ-谷氨酸的過程中，存在菌株合成聚-γ-谷氨酸性狀不穩(wěn)定的現(xiàn)象，在保藏或轉接之后，大部分的菌落丟失了合成聚-γ-谷氨酸的性能(Ashiuchi等，2001，Isolation of Bacillus subtilis(chungkookjang)，a poly-γ-glutamate producer withhigh genetic competence.Appl.Microbiol.Biotechnol.，57764-769.)，這種情況要求實驗過程中反復純化菌種；同時，采用Bacillus licheniformis ATCC 9945a合成聚-γ-谷氨酸，培養(yǎng)基中需要添加高濃度的甘油(至80g/L)，從而導致發(fā)酵成本過高，此外還存在發(fā)酵周期較長(2天至5天)等問題(Soon等，2000，Biotech.Lett.，22585-588.；Borbely，2001，Polymeric product，United States Patent 6,326,511)；以上這些問題嚴重制約了聚-γ-谷氨酸產業(yè)化進程。此外，Bacillus licheniformis ATCC 9945a和Bacillus subtilis(natto)等菌株生物合成的聚-γ-谷氨酸的分子量在3000KD以下((Cromwick，等，1995a.Effect of magnese(II)on Bacillus licheniformis ATCC9945Aphysiology and γ-poly(glutamic acid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267.))，在利用聚-γ-谷氨酸合成高分子生物材料時，在性能上和應用范圍上受到了很大的限制。目前，僅報道Bacillus subtilis(chungkookjang)生物合成的聚-γ-谷氨酸的分子量可達10000KD，是否能夠篩選到產生聚-γ-谷氨酸分子量更高的菌株，迫切有待開發(fā)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的缺陷，選育一株產聚-γ-谷氨酸能力強，合成聚-γ-谷氨酸的特性穩(wěn)定；適應液體發(fā)酵條件，能夠合成高分子量聚-γ-谷氨酸的產生菌及其生產聚-γ-谷氨酸的方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種能產生聚-γ-谷氨酸的菌株，其特征在于，所述菌株為X-003，一種枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，保藏在中國典型物保藏中心(CCTCC)，保藏時間2002年12月25日，保藏編號NOM202048。
菌種的分離與篩選取中國湖北省武漢市華中農業(yè)大學實驗農場水稻田土壤表層以下5cm的土壤，加入適量的無菌水，搖勻，梯度稀釋100倍。將懸液在80℃熱處理15分鐘，涂LB固體平板，經過夜培養(yǎng)，挑取粘性菌落于5毫升聚-γ-谷氨酸篩選培養(yǎng)基(E培養(yǎng)基見文獻Cromwick等，Effect of magnese(II)on Bacillus licheniformis ATCC9945A physiology andpoly-(glutamic acid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267)培養(yǎng)2～3天。將培養(yǎng)液離心取上清，用3倍體積的乙醇沉淀，收集沉淀物，冰凍干燥，加適量雙蒸水溶解，利用HPLC檢測產物。將篩選到的菌株按規(guī)定的方法進行菌株鑒定。
聚-γ-谷氨酸產生菌Bacillus subtilis，X-003的生物學及其遺傳特性生物學特性菌體直桿狀，革蘭氏染色陽性，芽胞近似圓形，偏端生。在LB固體培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣平滑，菌苔豐滿，粘稠。最適生長溫度30-37℃，適宜pH6.8-7.2。接觸酶實驗陰性，吲哚陰性，硝酸鹽利用陽性，檸檬酸鹽利用陽性，明膠液化實驗陽性。
遺傳特性該菌株含有兩條質粒(如

圖1所示)，聚-γ-谷氨酸合成酶基因位于染色體上。該菌株合成聚-γ-谷氨酸的性能穩(wěn)定，連續(xù)傳代20次以上，該菌株合成聚-γ-谷氨酸的能力不變。
菌種培養(yǎng)、傳代和保藏在LB培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方如前所述)固體斜面上于37℃培養(yǎng)，可于4℃短期保藏，以冷凍甘油管長期保藏，作為原始菌種；生產菌種需從原始菌種中轉接。
2、利用所述菌株為X-003，一種枯草芽孢桿菌X-003，Bacillus subtilis，CCTCC，NOM202048生產聚-γ-谷氨酸的方法，按照下列步驟生產本發(fā)明的菌株(菌株為X-003，一種枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，CCTCC，NOM202048)保藏按下列步驟A、Bacillus subtilis X-003在LB(培養(yǎng)基配方如前所述)固體平板上劃線，37℃培養(yǎng)；B、括取菌苔至無菌的20％甘油保藏管中，65℃水浴處理15分鐘；C、-70℃冷凍保藏。
種子液制備A、將冷凍保藏的菌種接種于含有蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、瓊脂20克/升、pH7.0的LB固體培養(yǎng)基的斜面上，37℃培養(yǎng)24～48小時，使其活化；B、將上述活化的種子轉入含有蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、pH7.0的LB三角瓶液體種子培養(yǎng)基中，37℃ 200rpm培養(yǎng)5～6小時至對數(shù)生長中期；C、按照每1升培養(yǎng)基的加入量配制種子培養(yǎng)基谷氨酸15克；葡萄糖40克；檸檬酸10克，氯化銨7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；補充蒸餾水至1000ml，pH6.5～6.8；D、按種子罐容積的60～80％投入C步驟制備的培養(yǎng)基，以0.1Mpa高壓蒸汽滅菌，維持30分鐘，冷卻至37℃接入B步驟制備的種子液；發(fā)酵生產A、按照每1升培養(yǎng)基的加入量配制發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸15克；葡萄糖40～100克；檸檬酸10克，氯化銨7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；泡敵0.5～2ml，補充蒸餾水至1000ml，pH6.5～6.8；
B、按發(fā)酵罐容積的60～80％投入上述發(fā)酵培養(yǎng)基，以0.07～0.1Mpa高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至37℃接入種子液；在37℃條件下培養(yǎng)，罐壓0.3～0.5Kg/cm2，通氣量1∶0.6～1.2(v/v)；提取與精制將所述的菌株進行液體深層發(fā)酵，28～36小時結束發(fā)酵；然后離心去除菌體，收集上清液，超濾濃縮上清液，并用95％乙醇沉淀聚-γ-谷氨酸，回收得到聚-γ-谷氨酸。
本發(fā)明的效果與國外所采用的聚-γ-谷氨酸產生菌相比，本發(fā)明的聚-γ-谷氨酸產生菌Bacillussubtilis X-003具有以下特點(1)菌株生長速度快本發(fā)明的菌株在10升發(fā)酵罐中，發(fā)酵時間為28小時；其它枯草芽胞桿菌為36小時以上；地衣芽胞桿菌需48小時以上。
(2)所合成的聚-γ-谷氨酸分子量高(分子量10000KD以上，見附圖2，3，4)。聚-γ-谷氨酸產量高采用液體三角瓶搖瓶培養(yǎng)方法(250ml三角瓶搖瓶發(fā)酵48小時)，發(fā)酵液中聚-γ-谷氨酸的濃度達10mg/ml，聚-γ-谷氨酸的分子量分布范圍1000～20,000kDa。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基中不需要甘油，因而可降低生產成本。
(4)在高濃度的葡萄糖下也不合成多糖等副產物。
(5)本發(fā)明的菌株的遺傳性狀穩(wěn)定，保藏、轉接之后都沒有發(fā)生合成聚-γ-谷氨酸的能力降低的現(xiàn)象；發(fā)酵接種前不需要重新劃線分離。
附圖及其說明圖1是本發(fā)明的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，X-003菌株的質粒圖譜(1、是Bacillus subtilis X-003的質粒，2、是λ/HindIII)圖2是聚-γ-谷氨酸純品的HPLC分析(保留時間為14min的色譜峰為發(fā)酵產物，分子量200KD)。
圖3是Bacillus subtilis，X-003菌株的聚-γ-谷氨酸發(fā)酵液的HPLC分析(保留時間為10min的色譜峰為發(fā)酵產物，分子量10000KD以上)。
圖4是聚-γ-谷氨酸發(fā)酵液的HPLC分析(保留時間為10min的色譜峰為發(fā)酵產物，分子量10000KD)具體實施方式
實施例1聚-γ-谷氨酸產生菌X-003的分離、鑒定取華中農業(yè)大學實驗農場水稻田土壤表層以下5cm的土壤，加入適量的無菌水，搖勻，梯度稀釋100倍。將懸液在80℃熱處理15分鐘，涂LB(LB培養(yǎng)基按每1升蒸餾水中應加入的量其配方如下蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、瓊脂20克/升、pH7.0)固體平板，經過夜培養(yǎng)，挑取粘性菌落于5毫升聚-γ-谷氨酸篩選培養(yǎng)基E(E培養(yǎng)基配方及制作見文獻Cromwick等，Effect ofmagnese(II)on Bacillus licheniformis ATCC9945A physiology and poly-(glutamicacid)formation.Int.J.Biol.Macromol.17259-267)培養(yǎng)2-3天。將培養(yǎng)液離心取上清，用3倍體積的乙醇沉淀，收集沉淀物，冰凍干燥，加適量雙蒸水溶解，利用HPLC(高效液相色譜)檢測產物。將篩選到的菌株按規(guī)定的方法進行菌株鑒定，確定該菌株為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。
將該菌株做搖瓶發(fā)酵試驗，產物經提純用HPLC檢測，檢測其分子量在10000KD以上。目前國內外報道的分子量在10000KD以上的菌株只有Bacillus subtilis chungkookjang，在相同的HPLC分析條件下，其保留時間為11min，說明其產物的分子量小于Bacillussubtilis，X-003的聚-γ-谷氨酸分子量；而且Bacillus subtilis chungkookjang菌株沒有任何質粒存在；其產物聚-γ-谷氨酸的產生需要甘油。所以本發(fā)明分離得到的菌株經鑒定為Bacillus subtilis X-003屬于一株新菌種。
實施例2聚-γ-谷氨酸的HPLC分析方法聚-γ-谷氨酸的定量分析及分子量的測定由HPLC完成，色譜柱G6000PWXL，流動相為25mM Na2SO4溶液與乙腈按4∶1比例的混合液。經提純的聚-γ-谷氨酸作為定量的標準物，分子量的標準物為TSK standard Poly(ETHYLENE OXIDE)。
聚-γ-谷氨酸的產量及分子量的測定步驟如下發(fā)酵液經定量稀釋后，調節(jié)pH值至3.0，10000rpm，30分鐘離心，收集上清。經稀釋后的發(fā)酵液用來檢測濃度及分子量。發(fā)酵產物聚-γ-谷氨酸的保留時間為10min，分子量在10000KD以上(見圖2、3)所示。
實施例3聚-γ-谷氨酸產生菌的液體分批發(fā)酵生產1.用冷凍管保藏的菌種作為原始菌種。
2.斜面菌種將冷凍管保藏的菌種Bacillus subtilis x-003用接種環(huán)接種到LB固體斜面(在每1升蒸餾水量的培養(yǎng)基中加入蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、瓊脂20克/升、pH7.0.)，37℃培養(yǎng)。
3.種子液培養(yǎng)將LB(培養(yǎng)基成分同上所述)固體斜面上活化的菌落，接種于在按1升蒸餾水量的培養(yǎng)基中加入蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、pH7.0的250毫升三角瓶中，每瓶培養(yǎng)液的裝液量為20～40毫升，37℃200rpm培養(yǎng)5～6小時至對數(shù)生長中期。
4.發(fā)酵罐培養(yǎng)將560g葡萄糖與3.5g MnSO4·7H2O混合，配成1.5L母液，115℃滅菌20分鐘。其余成分(配方谷氨酸15克；檸檬酸10克，氯化銨7克；K2HPO40.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；泡敵0.5～2ml，水1000ml，pH6.5～6.8)直接加入10L發(fā)酵罐中，加水至培養(yǎng)基體積為5.5L，調節(jié)培養(yǎng)基pH值為6.5～6.8，121℃滅菌30分鐘。滅菌結束后，將葡萄糖母液加入發(fā)酵罐中，并以1％接種量接種，發(fā)酵攪拌轉速300～800rpm，通氣量1∶0.6～1.2(v/v)，發(fā)酵溫度37±2℃。發(fā)酵至28小時結束，檢測、分析所得到的聚-γ-谷氨酸(分子量在10000KD以上)的濃度為12g/L。
5、聚-γ-谷氨酸發(fā)酵液后處理取上述發(fā)酵液5升，直接調節(jié)發(fā)酵液pH值至3.0，在10000rpm下，離心30分鐘，收集上清液；超濾除去小分子量物質，并濃縮至1升；向濃縮液中加入3升95％乙醇，沉淀過夜。在10000rpm下，30分鐘離心收集沉淀，真空干燥，得到52克干燥產品。在本實施例中聚-γ-谷氨酸提取回收率為86.7％。
實施例4聚-γ-谷氨酸產生菌的液體補料發(fā)酵生產1.用冷凍管保藏的菌種作為原始菌種。
2.斜面菌種將冷凍管保藏的菌種Bacillus subtilis x-003用接種環(huán)接種到LB固體斜面(在每1升蒸餾水量的培養(yǎng)基中加入蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、瓊脂20克/升、pH7.0)，37℃培養(yǎng)。
3.種子液培養(yǎng)將LB(培養(yǎng)基成分同上所述)固體斜面上活化的菌落，接種于在按1升蒸餾水量的培養(yǎng)基中加入蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、pH7.0的250毫升三角瓶中，每瓶培養(yǎng)液的裝液量為20～40毫升，37℃200rpm培養(yǎng)5～6小時至對數(shù)生長中期。
4.發(fā)酵罐培養(yǎng)將1120g葡萄糖與28g MgSO4·7H2O混合，配成3L母液，115℃滅菌20分鐘；另取4480g葡萄糖，配成15L葡萄糖母液，115℃滅菌20分鐘。其余成分(配方谷氨酸15克；檸檬酸10克，氯化銨7克；K2HPO40.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；泡敵0.5～2ml，水1000ml，pH6.5～6.8)直接加入80L發(fā)酵罐中，加水至培養(yǎng)基體積為38L，調節(jié)培養(yǎng)基pH值為6.5～6.8，121℃滅菌30分鐘。滅菌結束后，將3L葡萄糖鹽母液加入發(fā)酵罐中，并以1％接種量接種，發(fā)酵攪拌轉速200～400rpm，通氣量1∶0.6～1.2(v/v)，發(fā)酵溫度37±2℃。發(fā)酵過程中，流加葡萄糖母液。發(fā)酵至36小時結束，檢測、分析所得到的聚-γ-谷氨酸(分子量在10000KD以上)的濃度為30g/L。
5、聚-γ-谷氨酸發(fā)酵液后處理取上述發(fā)酵液30升，經稀釋后調節(jié)發(fā)酵液pH值至3.0，在10000rpm下，離心30分鐘，收集上清液；超濾除去小分子量物質，并濃縮至15升；向濃縮液中加入45升95％乙醇，沉淀過夜。在10000rpm下，30分鐘離心收集沉淀，真空干燥，得到819克干燥產品。在本實施例中聚-γ-谷氨酸提取回收率為91％。
權利要求
1.一種能產生聚-γ-谷氨酸的菌株，其特征在于，所述菌株為X-003，一種枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，CCTCC，NOM202048。
2.一種實現(xiàn)權利要求1的生產聚-γ-谷氨酸的方法，其特征按照下列步驟；(1)種子液制備A、將冷凍保藏的菌種接種于含有蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、瓊脂20克/升、pH7.0的LB固體培養(yǎng)基的斜面上，37℃培養(yǎng)24～48小時，使其活化；B、將上述活化的種子轉入含有蛋白胨10克/升、NaCl 10克/升、酵母抽提物5克/升、pH7.0的LB三角瓶液體種子培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)5～6小時至對數(shù)生長中期；C、按照每1升培養(yǎng)基的加入量配制種子培養(yǎng)基谷氨酸15克；葡萄糖40克；檸檬酸10克，氯化銨7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；補充蒸餾水至1000ml，pH6.5～6.8；D、按種子罐容積的60～80％投入C步驟制備的培養(yǎng)基，以0.1Mpa高壓蒸汽滅菌，維持30分鐘，冷卻至37℃接入B步驟制備的種子液；(2)發(fā)酵生產A、按照每1升培養(yǎng)基的加入量配制發(fā)酵培養(yǎng)基谷氨酸15克；葡萄糖40～100克；檸檬酸10克，氯化銨7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；泡敵0.5～2ml，補充蒸餾水至1000ml，pH6.5～6.8；B、按發(fā)酵罐容積的60～80％投入上述發(fā)酵培養(yǎng)基，以0.07～0.1Mpa高壓蒸汽滅菌維持30分鐘，冷卻至37℃接入種子液；在37℃條件下培養(yǎng)，罐壓0.3～0.5Kg/cm2，通氣量1∶0.6～1.2(v/v)；(3)提取與精制將所述的菌株進行液體深層發(fā)酵，28～36小時結束發(fā)酵；然后離心去除菌體，收集上清液，超濾濃縮上清液，并用95％乙醇沉淀聚-γ-谷氨酸，回收得到聚-γ-谷氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能產生聚－γ－谷氨酸的菌株以及利用該菌株生產聚－γ－谷氨酸的方法。其特征在于，所述菌株為X－003，一種枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，CCTCC，NOM202048。采用種子液制備、液體深層發(fā)酵工藝生產獲得聚－γ－谷氨酸產品。所述的菌株遺傳性狀穩(wěn)定，合成聚－γ－谷氨酸的能力強，所合成的聚－γ－谷氨酸分子量達10000KD以上。利用本發(fā)明的菌株及其發(fā)酵方法聚－γ－谷氨酸的搖瓶發(fā)酵水平達到10mg/ml，80升發(fā)酵罐發(fā)酵水平為30mg/ml。
文檔編號C12P13/14GK1536071SQ03118908
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月10日 優(yōu)先權日2003年4月10日
發(fā)明者陳守文, 喻子牛, 江昊, 孫明, 何進, 蔡皓, 李林 申請人:華中農業(yè)大學