專利名稱：一株離子注入誘變選育的高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種新興的交叉學(xué)科-離子注入育種技術(shù)篩選得到絮凝效果提高顯著的高效絮凝菌。絮凝技術(shù)是提高水處理效率的一種既經(jīng)濟又簡便的處置處理方法，絮凝效果的好壞往往決定后續(xù)流程的運行狀況、最終出水水質(zhì)和費用，在絮凝處理過程中，絮凝劑的種類、性質(zhì)、品種直接影響到處理效果，因此絮凝劑是絮凝法處理水的核心。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，無機和有機合成高分子絮凝劑越來越廣泛地被應(yīng)用于各種水源水和廢水的處理過程中。但是，在其使用的過程中，人們逐漸認識到傳統(tǒng)絮凝劑的不安全性和造成環(huán)境二次污染染的問題。過量的無機離子不僅影響產(chǎn)品的風(fēng)味、口感，腐蝕生產(chǎn)輸送設(shè)備，也不利于人體健康。比如鋁系絮凝劑的頻繁使用，導(dǎo)致飲用水中含有過量的鋁離子，或者毒害水生生物和微生物，通過食物鏈進入人體，攝入過量的鋁離子人群中，老年性癡呆的患者比例較高。有機合成高分子絮凝劑如丙烯酰胺多聚體，雖然其本身沒有任何毒性，但其難降解性卻易造成二次污染，而且聚合單體丙烯酰胺的殘留也是一個令人十分擔(dān)憂的問題，它不僅具有強烈的神經(jīng)毒性，而且是強致癌物，現(xiàn)在許多國家和領(lǐng)域已禁止或限量使用此類絮凝劑。因此，開發(fā)一種安全無毒、絮凝活性高、無二次污染的新型絮凝劑對人類的健康和環(huán)境保護都具有很重要的現(xiàn)實意義。
微生物絮凝劑是利用生物技術(shù)，從微生物體內(nèi)或分泌物中分離提取的一種安全、高效且能自然降解的特殊高分子代謝產(chǎn)物(次生代謝產(chǎn)物)。生物絮凝劑與傳統(tǒng)的無機和有機合成高分子絮凝劑相比具有許多獨特的性質(zhì)和優(yōu)點，如高效、無毒、無二次污染、價格較低，采用微生物絮凝劑處理廢水時，其處理費用較目前的化學(xué)絮凝處理費用低，大約節(jié)約1/3的費用。
20世紀(jì)50年代，人們發(fā)現(xiàn)了能產(chǎn)生絮凝作用的細菌培養(yǎng)液，1986年，Ryuichiro Kurane等人，采用從旱田土壤中分離出的紅球菌屬微生物Rhodococcus erythropolis的S-1菌株，用特定培養(yǎng)及培養(yǎng)條件，制成絮凝劑NOC-1。并且把它用于畜牧產(chǎn)廢水處理、膨脹污泥處理、磚廠生產(chǎn)廢水處理和廢水的脫色處理，都取得了很好的處理效果，被認為是目前發(fā)現(xiàn)的最好的微生物絮凝劑，也是目前研究最為深入的生物絮凝劑。此后，國內(nèi)外掀起了微生物絮凝劑研究的高潮，但大部分研究都集中在利用傳統(tǒng)的分離純化方法篩選微生物絮凝劑產(chǎn)生菌及絮凝特性的研究、化學(xué)本質(zhì)的分析和產(chǎn)絮凝劑機制的研究。
但是，制備高絮凝活性的微生物絮凝劑離不開菌種的篩選，篩選是最為艱難也是最為重要的步驟。目前篩選高效的微生物絮凝劑的方法有兩種一是通過傳統(tǒng)的分離純化方法，另一種是通過誘變的方法。傳統(tǒng)的分離純化方法工作量大，而且由于從自然界直接分離到的野生型菌株積累產(chǎn)物的能力往往很低，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，這就要求對它們進行菌種改造。根據(jù)大量的研究報導(dǎo)，微生物絮凝劑的產(chǎn)生是由絮凝基因控制的，而誘變能夠從本質(zhì)上改變絮凝基因，使遺傳物質(zhì)核酸中的核苷酸順序發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化，從而產(chǎn)生絮凝率大幅度提高的可穩(wěn)定遺傳的突變株。
目前，國內(nèi)外對微生物絮凝劑產(chǎn)生菌進行誘變育種的研究很少，并且僅僅局限于傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變，但是，由于這些誘變源的反復(fù)使用，導(dǎo)致其誘變新突變的能力減弱，老的誘變源誘變產(chǎn)量的提高已到極限，若再想使工業(yè)微生物積累大量新的突變，必須尋找新的物理誘變源。離子束生物技術(shù)是一種菌種選育新方法，它集化學(xué)誘變和物理誘變于一身，突變率高、操作簡單，顯現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢，并已被生產(chǎn)實踐證明是一種行之有效的微生物菌種選育的方法，也是一種不可替代的育種方法。目前，采用離子注入微生物誘變育種的研究工作主要集中于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品行業(yè)的微生物誘變育種及基因工程，該技術(shù)在環(huán)境微生物的誘變育種工作中開展的不多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用離子注入的方法誘變微生物絮凝劑，篩選出具有高產(chǎn)趨勢，遺傳性能穩(wěn)定的高效微生物絮凝劑突變菌株C3-X。使一些其他方法很難取得誘變效果的環(huán)境微生物發(fā)生有經(jīng)濟意義的突變，為環(huán)境微生物誘變育種開辟一條新的途徑。
本發(fā)明優(yōu)點與現(xiàn)有的微生物絮凝劑育種技術(shù)相比，本發(fā)明有以下優(yōu)點1.離子注入生物體有眾多新特點，注入離子的質(zhì)、能、電聯(lián)合作用的生物學(xué)效應(yīng)比核輻射產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)具有更豐富的內(nèi)容和更寬廣的誘變圖譜，可能在較低的劑量下，產(chǎn)生很高的突變率，尤其是在存活下來的菌種中發(fā)生變異的幾率是很高的；2.大幅度提高了絮凝率；3.拓寬了離子注入的應(yīng)用領(lǐng)域。
具體實施辦法出發(fā)菌株C3為傳統(tǒng)方法篩選，確定其為細菌，其絮凝率為84.2％。本發(fā)明實施過程所采用的模擬廢水為高嶺土懸濁液(200目過篩、濃度4g/L)，在其中投加一定量的絮凝劑和助凝劑(1％的CaCl2溶液)，進行絮凝試驗，水力條件為200rpm快攪1min，80rpm慢攪2min，靜沉5min，取距液面50％深度處液體，測定其吸光度OD550，同時以蒸餾水代替發(fā)酵液作對照。
絮凝率的計算公式如下絮凝率E＝(A-B)/A×100％式中A-對照上清液550nm處的吸光度B-絮凝后清液550nm處的吸光度離子注入方法采用干胞法。于新鮮斜面取一環(huán)菌接入種子培養(yǎng)基(100mL/250mL三角瓶)，30℃，150r/min培養(yǎng)10h，取菌液1.5mL與離心管中。離心收集菌體(4000r/min，5min)，用無菌生理鹽水洗滌菌體三次，加0.4mL生理鹽水，制成菌體濃度約為107個/mL的單細胞菌懸液，取0.03mL均勻涂布于無菌平皿中央Φ10mm左右范圍，以無菌風(fēng)吹干，即制得菌膜。取鏡檢無細胞重疊者進行離子注入。注入劑量為1012-1014ion/cm2H+，輻照在大氣中進行。篩選出的突變株菌落形態(tài)見表1，存活率-劑量曲線見

圖1。
表1初篩結(jié)果

離子注入篩選到一株突變株C3-X，照片見圖2。將其連續(xù)轉(zhuǎn)接六代，絮凝率均穩(wěn)定保持在98％左右，絮凝率比野生菌株C3提高了13.8％，證明通過離子照射后的菌株發(fā)生了突變而不是刺激作用，同時也表明用離子注入的方法進行微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的誘變篩選是可行的，具有實際意義及工業(yè)價值。
權(quán)利要求
1.一種本實驗室篩選保藏的絮凝劑產(chǎn)生菌C3及突變株C3-X。
2.權(quán)力要求書1中的C3-X菌用于制備微生物絮凝劑。
3.權(quán)力要求書1中的用C3菌制備微生物絮凝劑的方法，其特征是挑取純菌落涂布至細菌平板培養(yǎng)基使菌落長到滿視野，用打孔器打孔，接入裝有150ml發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)，在恒溫振蕩器中30℃，150rpm條件下培養(yǎng)66h，即得到絮凝劑樣品。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖30g，尿素0.3g，酵母膏0.6g，NaCl0.6g，K2HPO46g，KH2PO43g，pH＝7。
4.權(quán)力要求書1中所利用的離子注入選育高效的微生物絮凝劑產(chǎn)生突變株C3-X的方法。
全文摘要
目前所使用的絮凝劑存在著各種局限性，限制了其廣泛的開發(fā)應(yīng)用，生物絮凝劑作為一類新型絮凝劑，其廣譜的絮凝活性、可生物降解性及應(yīng)用安全性，顯示了它在水處理、食品加工和發(fā)酵工業(yè)等方面的應(yīng)用前景。因此，篩選高效新型絮凝劑產(chǎn)生菌對其應(yīng)用做出很大的貢獻。重離子和傳統(tǒng)的物理誘變源相比具有許多獨特的特性，利用它可能使一些其他方法很難取得誘變效果的工業(yè)微生物發(fā)生有經(jīng)濟意義的突變，為工業(yè)微生物誘變育種開辟一條新的途徑。同理，此種方法也可以應(yīng)用于環(huán)境微生物工程中，提高微生物絮凝劑的生產(chǎn)能力，目前將重離子誘變微生物應(yīng)用于環(huán)境工程中的研究微乎其微，可以說我們的發(fā)明可以為此領(lǐng)域的研究提供一些重要的基礎(chǔ)。
文檔編號C02F1/52GK101050434SQ20061001161
公開日2007年10月10日 申請日期2006年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日
發(fā)明者楊玉楠, 任娜, 胡訓(xùn)杰, 陳亞松, 韓冬, 湯歷漫 申請人:北京航空航天大學(xué)