專利名稱：構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株m181的突變菌株m18δr的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種構(gòu)建假單胞菌誘變株的突變菌株的方法，尤其是一種運(yùn)用基因技術(shù)的構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，屬于農(nóng)業(yè)基因技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
一般認(rèn)為，農(nóng)作物病害造成的減產(chǎn)幅度約占總收的25～75％。目前，除了選用良種和科學(xué)的栽培措施外，生產(chǎn)上控制農(nóng)作物病害的主要手段是使用化學(xué)殺菌劑。大多殺菌劑對(duì)動(dòng)物和人類有害，化學(xué)農(nóng)藥造成的食物中毒時(shí)有發(fā)生，在可食部分的殘留毒物對(duì)人體的潛在危害，已引起社會(huì)各方面的關(guān)注?；瘜W(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期地累積在生態(tài)系統(tǒng)中，造成對(duì)環(huán)境的污染，不利于國(guó)民經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。同時(shí)，在許多情況下，化學(xué)農(nóng)藥并不完全有效。因此，在發(fā)展環(huán)境相容的高效低毒的新一代化學(xué)農(nóng)藥的同時(shí)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)微生物源農(nóng)藥顯得十分必要。
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，(微生物學(xué)報(bào)，2003，43(3)315-323)“熒光假單胞M18rpoD克隆及其對(duì)抗生素合成的影響”，野生性熒光假單胞菌株M18的發(fā)酵液中藤黃綠菌素的產(chǎn)量?jī)H為12.5ppm，利用rpoD基因擴(kuò)增技術(shù)，也只能提高6倍，發(fā)酵效價(jià)可達(dá)75ppm。M18的誘變株M181，其發(fā)酵效價(jià)能提高到134ppm。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在克服上述技術(shù)中的缺陷，提供一種構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，通過(guò)基因工程技術(shù)，進(jìn)行定向突變，獲得一種基因工程菌株M18ΔR，可將發(fā)酵效價(jià)提高到300ppm，提高了熒光假單胞菌(fluorescent Pseudomonas sp.)M18生物合成藤黃綠菌素(Plt)的能力，從而提高防治植物腐霉病害的能力。本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的方法如下1、引物及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)根據(jù)E.coli.P.aeruginosa和E.carotovora中csrA基因的保守序列，設(shè)計(jì)PCR兼并引物用于擴(kuò)增熒光假單胞菌M18基因組的csrA片段。引物15’-CGTGGATCCATGCTKATTYTGACTCG-3’，引物25’-TGAATAAGCTTCHCGGTGW ACSGMVAC-3’。其中簡(jiǎn)并堿基K＝G/T，Y＝C/T，H＝A/C/T，W＝A/T，M＝A/C，V＝A/C/G。分別在兩引物的5’端增添BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)，以利于PCR產(chǎn)物克隆。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 6min；95℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 45s，35個(gè)循環(huán)；最后循環(huán)為95℃ 1min，57℃ 1min，72℃延伸10min。從M18基因組中，擴(kuò)增出csrA基因部分片段。
2、以該片段為探針，從M18的基因組柯斯文庫(kù)中篩出陽(yáng)性克隆。從柯斯陽(yáng)性克隆中，切取帶有csrA基因及兩側(cè)序列的1.5kb片段，插入編碼Kmr的片段，獲得csrA-體外突變體，pMOR2。
3、運(yùn)用同源重組剔除技術(shù)，構(gòu)建M181菌株的csrA突變株M18ΔR。采用固相濾膜雜交方法。供體菌為帶有pMOR2的大腸桿菌E.coliS17-1(100μl)，受體菌為M181(200μl)分別培養(yǎng)過(guò)夜，混合均勻，4℃，13000r/m離心兩分鐘，去上清，新鮮培養(yǎng)基淋洗一次，懸浮于100μl新鮮培養(yǎng)基。取5μl點(diǎn)樣于無(wú)菌濾膜上，培養(yǎng)8-16小時(shí)后，無(wú)菌鑷子刮取菌體，置于1ml培養(yǎng)液中，懸浮混勻，稀釋涂布Km50Chl100Sp100三抗平板，37℃培養(yǎng)，12-24小時(shí)后出現(xiàn)共整合接合子。隨機(jī)挑選幾個(gè)接合子，合并接種于蔗糖選擇培養(yǎng)基，誘導(dǎo)結(jié)合子發(fā)生第二次重組，消除共整合質(zhì)粒，篩出同源重組雙交換子M18ΔR。
4、Plt的提取和定量測(cè)定取菌懸液1ml，經(jīng)等體積乙酸乙脂抽提，離心取上清，真空抽干，溶于與1ml甲醇中，取5μl進(jìn)樣。HPLC檢測(cè)條件為Plt檢測(cè)波長(zhǎng)308nm，保留時(shí)間為3.1min；流動(dòng)相為70％甲醇，流速1ml/min，C18反相柱。發(fā)酵過(guò)程中，每隔6小時(shí)取樣，測(cè)定Plt的產(chǎn)量，6次重復(fù)，取平均值。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，瓜果腐霉是一種植物病原真菌，侵染植物幼苗引起腐爛。Plt能夠高效抑制瓜果腐霉保護(hù)幼苗免受侵染。經(jīng)生物測(cè)定結(jié)果表明突變株的抑菌圈明顯大于野生型菌株，表明M18ΔR生物合成Plt的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生性菌株。無(wú)論King’s B還是以PPM作發(fā)酵培養(yǎng)基，Plt都在菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期至停滯期合成，但是，60小時(shí)后，M18ΔR在KB發(fā)酵液中積累Plt的量比對(duì)照提高9倍左右。在PPM發(fā)酵液中，M18不能合成可檢測(cè)的Plt量，M18ΔR仍能合成的大量Plt。


圖1 KB平板上兩種菌株對(duì)瓜果腐霉的抑制作用的照片照片中1、3為熒光假單胞菌株M181，2、4為工程菌株M18ΔR。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步描述實(shí)施例1、生物測(cè)定采用平板試驗(yàn)。用滅菌牙簽將M181和M18ΔR單菌落接種在無(wú)菌KB平板的外圓周四等分點(diǎn)上，倒置于28℃培養(yǎng)36小時(shí)。從果蔬腐霉(Pythium.aphanidermatum)生長(zhǎng)3天的平板上，選擇均勻、旺盛生長(zhǎng)處沿同心圓用打孔器(孔徑5mm)取樣，將帶有培養(yǎng)基的菌塊點(diǎn)接在M181和M18ΔR生長(zhǎng)36小時(shí)后的平板圓心處，28℃繼續(xù)培養(yǎng)60小時(shí)。測(cè)定結(jié)果顯示兩種菌株的菌斑呈現(xiàn)不同的表型M181的菌斑呈擴(kuò)散型，邊緣不規(guī)則；M18ΔR的菌斑不易擴(kuò)散，邊緣呈光滑型。突變株的抑菌圈明顯大于出發(fā)菌株，表明M18ΔR生物合成Plt的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于出發(fā)菌株(見(jiàn)圖1)。
2、在King’s B發(fā)酵液中，工程菌株M18ΔR與出發(fā)菌株M181相比，生物合成Plt的能力提高4倍。將工程菌株M18ΔR與出發(fā)菌株M181兩個(gè)不同菌株分別接種于150毫升發(fā)酵液中(三角瓶體積為250毫升)，置于28C下，220rpm搖床中發(fā)酵，每隔6小時(shí)取樣，Plt的產(chǎn)量，6次重復(fù)，取平均值。經(jīng)60小時(shí)發(fā)酵后，M18ΔR生物合成Plt量可達(dá)到300ppm，而M181生物合成Plt量?jī)H為134ppm。
3、在PPM發(fā)酵液中，工程菌株M18ΔR與出發(fā)菌株M181相比，生物合成Plt的能力提高15倍。將工程菌株M18ΔR與出發(fā)菌株M181兩個(gè)不同菌株分別接種于150毫升發(fā)酵液中(三角瓶體積為250毫升)，置于28C下，220rpm搖床中發(fā)酵，每隔6小時(shí)取樣，Plt的產(chǎn)量，6次重復(fù)，取平均值。經(jīng)60小時(shí)發(fā)酵后，M18ΔR生物合成Plt量可達(dá)到86ppm，而M181生物合成Plt量?jī)H為5ppm。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，其特征在于，具體方法的步驟如下(1)引物及聚合酶鏈PCR反應(yīng)根據(jù)E.coli，P.aeruginosa和E.carotovora中csrA基因的保守序列，設(shè)計(jì)PCR兼并引物用于擴(kuò)增熒光假單胞菌M18基因組的csrA片段；(2)以該片段為探針，從M18的基因組柯斯文庫(kù)中篩出陽(yáng)性克??；(3)運(yùn)用同源重組剔除技術(shù)，構(gòu)建M181菌株的csrA突變株M18ΔR采用固相濾膜雜交方法；(4)Plt的提取和定量測(cè)定取菌懸液1ml，經(jīng)等體積乙酸乙脂抽提，離心取上清，真空抽干，溶于與1ml甲醇中，取5μl進(jìn)樣。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，其特征是，步驟(1)所述的引物具體含義為引物15’-CGTGGATCCATGCTKATTYTGACTCG-3’，引物25’-TGAATAAGCTTCHCGGTGWACSGMVAC-3’，其中簡(jiǎn)并堿基K＝G/T，Y＝C/T，H＝A/C/T，W＝A/T，M＝A/C，V＝A/C/G。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，其特征是，所述的引物分別在兩引物的5’端增添BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)，以利于PCR產(chǎn)物克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，其特征是，所述的PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 6min；95℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 45s，35個(gè)循環(huán)；最后循環(huán)為95℃ 1min，57℃ 1min，72℃延伸10min，從M18基因組中，擴(kuò)增出csrA基因部分片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，其特征是，對(duì)步驟(2)的進(jìn)一步限定為從柯斯陽(yáng)性克隆中，切取帶有csrA基因及兩側(cè)序列的1.5kb片段，插入編碼Kmr的片段，獲得csrA-體外突變體，pMOR2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，其特征是，步驟(3)具體為供體菌為帶有pMOR2的大腸桿菌E.coli S17-1(100μl)，受體菌為M181(200μl)分別培養(yǎng)過(guò)夜，混合均勻，4℃，13000r/m離心兩分鐘，去上清，新鮮培養(yǎng)基淋洗一次，懸浮于100μl新鮮培養(yǎng)基，取5μl點(diǎn)樣于無(wú)菌濾膜上，培養(yǎng)8-16小時(shí)后，無(wú)菌鑷子刮取菌體，置于1ml培養(yǎng)液中，懸浮混勻，稀釋涂布Km50Chl100Sp100三抗平板，37℃培養(yǎng)，12-24小時(shí)后出現(xiàn)共整合接合子，隨機(jī)挑選幾個(gè)接合子，合并接種于蔗糖選擇培養(yǎng)基，誘導(dǎo)結(jié)合子發(fā)生第二次重組，消除共整合質(zhì)粒，篩出同源重組雙交換子M18ΔR。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建熒光假單胞菌出發(fā)菌株M181的突變菌株M18ΔR的方法，其特征是，對(duì)步驟(4)所述的Plt的提取和定量測(cè)定進(jìn)一步說(shuō)明為HPLC檢測(cè)條件為Plt檢測(cè)波長(zhǎng)308nm，保留時(shí)間為3.1min；流動(dòng)相為70％甲醇，流速1ml/min，C18反相柱。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或者7所述的構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，其特征是，對(duì)步驟(4)所述的Plt的提取和定量測(cè)定進(jìn)一步說(shuō)明為發(fā)酵過(guò)程中，每隔6小時(shí)取樣，測(cè)定Plt的產(chǎn)量，6次重復(fù)，取平均值。
全文摘要
一種構(gòu)建熒光假單胞菌誘變株M181的突變菌株M18ΔR的方法，屬于農(nóng)業(yè)基因技術(shù)領(lǐng)域。具體步驟(1)引物及聚合酶鏈PCR反應(yīng)根據(jù)E.coli，P.aeruginosa和E.carotovora中csrA基因的保守序列，設(shè)計(jì)PCR兼并引物用于擴(kuò)增熒光假單胞菌M18基因組的csrA片段；(2)以該片段為探針，從M18的基因組柯斯文庫(kù)中篩出陽(yáng)性克??；(3)運(yùn)用同源重組剔除技術(shù)，構(gòu)建M181菌株的csrA突變株M18ΔR采用固相濾膜雜交方法；(4)Plt的提取和定量測(cè)定取菌懸液1ml，經(jīng)等體積乙酸乙脂抽提，離心取上清，真空抽干，溶于與1ml甲醇中，取5μl進(jìn)樣。本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，M18ΔR在KB發(fā)酵液中積累Plt的量比出發(fā)菌株M181提高2倍以上。在PPM發(fā)酵液中，M18不能合成可檢測(cè)的Plt量，M18ΔR仍能合成的大量Plt。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1472310SQ0312954
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2003年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月26日
發(fā)明者許煜泉, 王素蓮, 耿海峰 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)