專利名稱：一種熒光假單胞菌及其在促進楊樹生長中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物肥料領域中的微生物肥料技術領域，具體涉及一種楊樹根際高效解 磷的熒光假單胞菌及其在促進楊樹生長中的應用。
背景技術：
磷是限制植物生長發(fā)育的必需大量礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，但土壤中95%以上的磷素 與土壤中Ca^、 Fe2+、 Fe3+、 A^等金屬離子結合而喪失植物有效性。施入土壤中的可溶 性磷肥大部分很快發(fā)生專性吸附和化學沉淀而被固定，當季利用率只有5%~10%，加上 作物的后效，利用率一般不超出25%，大部分磷肥以難溶性的磷酸鹽在土壤中積累起來， 植物難以吸收利用；另一方面，大量施用磷肥既耗竭有限的磷礦資源又加劇環(huán)境的富營 養(yǎng)化，造成一系列的能源危機和環(huán)境污染等問題。因此，通過生物技術途徑來解決這一 問題越來越為人們所接受。
研究表明，土壤中存在大量的解磷微生物，它們能將土壤中的難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為 植物可吸收利用的有效形態(tài)。這些微生物主要是在代謝過程中產(chǎn)生有機酸，通過降低土 壤環(huán)境的pH值以及有機酸陰離子的絡合作用促進磷的釋放。接種解磷微生物提高土壤 難溶性磷的植物有效性和磷肥利用率一直備受關注。與真菌、放線菌相比，植物根際細 菌被認為是最有效的解磷微生物，它們能高效的釋放出土壤中難溶性磷酸鹽，供植物吸 收利用。但通常該類微生物在植物根際的數(shù)量不足以和其它微生物競爭，難以有效的發(fā) 揮作用。因此，有必要在自然條件下，從特定植物的根面、根際土壤中篩選與該植物親 和性好、高效的解磷細菌，制成菌劑后回接到土壤中以促進植物的生長。國內(nèi)外不少文 獻指出，向土壤或作物根系接種解磷菌，能夠促進小麥、青菜、玉米、莜麥、甘藍、花 生、油菜、柱花草、苜蓿等的產(chǎn)量。但目前尚未見在多年生作物接種解磷微生物的研究 報道。
楊樹是世界中緯度平原地區(qū)栽培面積最大、木材產(chǎn)量最高的速生用材樹種之一，是 短輪伐期工業(yè)用材林的重要經(jīng)營樹種，也是我國農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成樹種。楊樹因 生長快，輪伐期短且頻，對土壤養(yǎng)分消耗大，易出現(xiàn)地力衰退現(xiàn)象。其中，磷素供應不 足是突出而具普遍性的問題，造成我國大部分地區(qū)的楊樹生長不良，抗逆下降。楊樹根 際高效解磷細菌能夠提高土壤中難溶性磷的植物有效性和磷肥利用率，改善楊樹人工林 生產(chǎn)中的磷素供應不足的矛盾、促進楊樹生長發(fā)育。目前，有關楊樹根際高效解磷細菌 的篩選及應用研究未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種楊樹根際高效溶解難溶性無機磷的熒光假 單胞菌；
本發(fā)明還要解決的一個技術問題是提供上述熒光假單胞菌在促進楊樹生長中的應用。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下
從江蘇省宿遷市泗洪縣陳圩林場2年生351楊根際土壤中，篩選獲得了一株高效解 磷的熒光假單胞菌(i^mfomomw ^wowsce朋)JW-JS1。已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心CCTCC，保藏編號M209027，保藏日期2009年2月18日。
JW-JS1菌株主要生物學特征在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，菌落較小，顏色淺 黃，圓形、邊緣整齊；菌體直桿狀，革蘭氏染色陰性，大小約0.45x0.74^im 1.91x2.06nm， 無芽孢，極生一根或三根鞭毛；好氧，氧化酶反應陰性，接觸酶試驗陽性，淀粉水解試 驗陰性，發(fā)酵葡萄糖，M.R.與V.P.試驗陰性，明膠水解試驗陽性，硝酸還原試驗陰性， 產(chǎn)氨和硫化氫試驗陰性，檸檬酸鹽生長試驗陽性；在King's B(蛋白胨20g、甘油10g、 磷酸氫二鉀1.5g、硫酸鎂1.5g、瓊脂15g、蒸餾水1000ml、 pH7.2)平板培養(yǎng)24h后，菌 落周圍產(chǎn)生可擴散的青色素，在366 nm波長紫外光下菌落發(fā)綠色熒光，菌落周圍顯示 青到藍色；菌體在熒光顯微鏡下自發(fā)熒光。
JW-JS1菌株16SrDNA基因序列，見SEQ ID No.l所示。
將所測16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST比對。結果表明， JW-JS1菌株與假單胞菌屬(i^Womo"os)同源性都很高，其中與Py7t/omsce朋的相似 度為98%。結合形態(tài)、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鑒定為熒光假單胞菌
JW-JS1菌劑盆栽接種試驗表明，該菌劑明顯促進了楊樹的生長發(fā)育。 有益效果JW-JS1菌株在液體搖培的情況下，對磷酸三鈣(Ca3(P04)3)和羥基磷 灰石(CMP04)6(OH)2)具有較強的溶解效果，與對照(CK)相比，差異顯著；JW-JS1 制成菌劑接種NL-895楊扦插苗和美洲黑楊實生苗，結果表明，該菌劑明顯促進楊樹苗 的生長發(fā)育。因此，本發(fā)明為開發(fā)楊樹專用解磷細菌肥料提供了優(yōu)良的菌株資源。


熒光假單胞菌(尸w^fowomwy Moresce M) JW-JS1已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心CCTCC，保藏編號M209027，保藏日期2009年2月18日。 圖1為JW-JS1菌株對磷酸三鈣和羥基磷灰石的溶解能力。圖2為接種JW-JS1菌劑美洲黑楊實生苗生長情況。
具體實施例方式
根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
實施例l: J\V-JS1解磷能力試驗
解磷培養(yǎng)基A:葡萄糖10g， Ca3(P04)3 5g， MgCL2 5g， KCL 0.2g， MgS04.7H20 0.25g， (NH4)2SO40.1g，蒸餾水lOOOmL ， pH7.0。
解磷培養(yǎng)基B:用Can)(P04)6(OH)2代替解磷培養(yǎng)基A中的Ca3(P04)3，其它成分和
含量相同。
將活化的JW-JSl菌株接種NB培養(yǎng)基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾 水1000mL， pH7.2~7.4)中，3(TC振蕩培養(yǎng)18~24h制成種子液，取0.5ml種子液分別 接種于含50mL解磷培養(yǎng)基A和50mL解磷培養(yǎng)基B的lOOmL三角瓶中，以接相同體 積空白種子液的解磷培養(yǎng)基為對照(CK)，每個處理3個重復，30°C， 180r/min振蕩培 養(yǎng)72h后，發(fā)酵液4'C， 10000r/min離心10min，鉬銻抗比色法測定發(fā)酵液有效磷含量 (見圖1)。
從圖l中可看出，以Ca3(P04)3為唯一磷源時，發(fā)酵液有效磷含量達669.56mg丄—1， 是對照(CK)的18.61倍；以Caw(P04)6(OH)2為唯一磷源時，發(fā)酵液有效磷含量為546.24 mg.1/1，是對照(CK)的113倍。綜上表明，JW-JS1菌株對磷酸三鈣和羥基磷灰石具 有較強的溶解能力。
實施例2: JW-JS1最適解磷條件試驗
以NBRIP (國際植物研究所磷酸鹽生長培養(yǎng)基，配方同解磷培養(yǎng)基A)為基本培養(yǎng) 基，改變C源、N源、不同C/N和環(huán)境條件。結果表明，最適解磷條件為，100mL三 角瓶中，以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源，C/N為80/1-100/1，裝液量20 30mL、初始 pH值7.0-7.2、接種量3%~4%、溫度28。C 30。C。
實施例3: JW-JS1溫室盆栽試驗
將JW-JS1活化后，用接種環(huán)挑取少量菌體接種于裝有50mLNB培養(yǎng)基(牛肉膏3g， 蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL， pH 7.2~7.4)的100mL三角瓶中，29°C ， 180r/min 振蕩培養(yǎng)72h。發(fā)酵液(4°C， 6000r/min)離心5min，用無菌生理鹽水潤洗菌體2 3次 后，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液(7~8xl08cfii/mL)制成菌劑。分別接種NL-895扦插苗
5和美洲黑楊實生苗(苗齡60天)，以等量無菌生理鹽水為對照，接種量為扦插苗15mL/ 株、實生苗5mL/株。每處理6個重復，置于溫室統(tǒng)一管理，光照為12h/天，適時澆水。 NL-895楊扦插苗150天生長情況(見表1)。從表1可看出，接種JW-JS1菌劑對 NL-895盆栽扦插苗的具有明顯的促生作用。接種處理使NL-895楊的苗高、莖粗、鮮重 和干重比對照有不同程度的增加。其中，苗高和莖粗比對照分別增加了 21.96%和5.04 %;鮮重和干重比對照分別增加了 57.33%和54.36%。
表1 JW-JS1對NL-895楊扦插苗的生長及生物量
處理苗高(cm)增長率 (%)莖粗(mm)增長率 (%)鮮重(g)增長率 (%)干重(g)增長率 (%)
JW-JS178.57土6.11b21.967.29士0.30b5.0457.33土3.12b57.8322.21士2.13b54.36
CK64.42士4.09a—6.94士0.28a—36.32士1.02a14.39±0.69a—
注P<0.05，同列不同行小寫字母不相同代表差異顯著
美洲黑楊實生苗90天生長情況(見表2及圖2)。從表2可看出，接種JW-JS1菌 劑對美洲黒楊盆栽實生苗的具有明顯的促生作用。接種處理使美洲黒楊實生苗的苗高、 地徑、鮮重和干重比對照有不同程度的增加。其中，苗高和地徑比對照分別增加了 51.66 %和1.98%;鮮重和干重比對照分別增加了 150.18%和168.49%。
表2 JW-JS1對美洲黑楊實生苗的生長及生物量
處理苗高(cm)增長率 (%)地徑(mm)增長率 (%)鮮重(g)增長率 (%)干重(g)增長率 (%)
JW-JS152.37士2.11b51.664.80士0.13b1.9820.59士0.50b150.187.87士0.42b168.49
CK34.53土0.76a一4.71士0.18a一8.23±0.34a一2.92i0.22a—
注P<0.05,同列不同行小寫字母不相同代表差異顯著
6SEQUENCE LISTING
〈110〉南京林業(yè)大學
<120〉 一種熒光假單胞菌及其在促進楊樹生長中的應用
<130> njfu090122
<160〉 1
<17t)> Patentln version 3. 3
〈210〉 1
<211> 1323
〈212〉 ■
<213> Pseudomonas fluoresceins
<400> 1
acacatgcaa gtcgagcggc agcacgggta cttgtacctg gtggcgagcg gcggacgggt 60
gagtaatgcc taggaatctg cctggtagtg ggggataacg ctcggaaacg gacgctaata 120
ccgcatacgt cctacgggag aaagccaggg gaaccttcgg gccttgcgct atcagatgag 180
cctaggtcgg attagctagt tggtggaggt aatggctcac caaggcgacg attccgtaac 240
tggtctgaga ggatgatcca gtcacactgg aactgaggac acggtccaga ctcctacggg 300
鄉(xiāng)cagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgaaagcctg atccagccat gccgcgtgtg 360tg朋gaaggt cttcggattg taaagcactt taagttggga ggaagggcag ttacctaata 420
cgtaattgtt ttgacgttac cgacagaata agcaccggct aactctgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacag agggtgc犯g cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc gcgtaggtgg 540
tttgttaagt tggatgtgaa atccccgggc tcaacctggg aactgcattc aaaactgaca 600
agctagagta tggtagaggg tggtggaatt tcctgtgtag cggtgaaatg cgtagatata 660
ggaaggaaca ccagtggcga aggcgaccac ctggactgat actgacactg aggtgcgaaa 720
gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtcaacta 780
gccgttggga gccttgagct cttagtggcg cagctaacgc attaagttga ccgcctgggg 840
agtacggccg caaggttaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcac犯gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg ccttgacatc caatgaactt 恥O
tccagagatg gattggtgcc ttcgggaaca ttgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gtaacggagc gcaacccttg tccttagtta 1080
ccagcacgta atggtgggca ctctaaggag actgccgtgt gacaaaccgg aggaetggtgg 1140
ggatgaacgt caaggtctat caatggccct tacggctctg ggctacaceic gtgctacaat 1200
ggtcggtaca gagggttgcc aagccgcgag gtggagctaa tcccacaaaa ccgatcgtag 1260
tccggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgaatca 1320
gaa 1323
8
權利要求
1、一種熒光假單胞菌，其分類命名為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)JW-JS1，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號M 209027，保藏日期2009年2月18日。
2、 權利要求l所述的熒光假單胞菌在促進楊樹生長中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離自楊樹根際土壤、高效溶解難溶性無機磷的熒光假單胞菌，其分類命名為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)JW-JS1，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號M 209027，保藏日期2009年2月18日。本發(fā)明還公開了上述熒光假單胞菌在促進楊樹生長中的應用。JW-JS1菌株在液體搖培的情況下，對磷酸三鈣和羥基磷灰石具有較強溶解效果；JW-JS1菌劑接種NL-895楊扦插苗和美洲黑楊實生苗。結果表明，該菌劑能明顯促進楊樹苗的生長。因此，本發(fā)明為開發(fā)楊樹專用解磷細菌肥料提供了優(yōu)良的菌株資源。
文檔編號C05F11/08GK101575583SQ20091002588
公開日2009年11月11日 申請日期2009年3月12日 優(yōu)先權日2009年3月12日
發(fā)明者輝 劉, 葉建仁, 吳小芹 申請人:南京林業(yè)大學