專利名稱：一種慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因家禽研究設(shè)想的提出雖然有近30年的時(shí)間，但由于缺乏有效的外源基因?qū)?手段，進(jìn)展一直不盡人意。2002年Lois等(Lois C, Hong E J ， Pease S, et al. Science, 2002， 295: 868-872)運(yùn)用慢病毒載體生產(chǎn)出高效整合轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果給了轉(zhuǎn)基因禽類 生產(chǎn)以重要的提示。2004年McGrew等(McGrew M J, Sherman A， Ellard F M, et al. EMBO, 2004,5:728-733)利用類似的病毒載體直接注射新鮮雞胚，獲得了高效的生殖系轉(zhuǎn)基因 雞，G0整合轉(zhuǎn)基因效率高達(dá)70y。，并且在繼代傳遞中沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。這一成 果的報(bào)導(dǎo)使人們對轉(zhuǎn)基因家禽的應(yīng)用前景充滿了信心，成為近年來最引人注目的動(dòng)物轉(zhuǎn) 基因成果，世界各大媒體紛紛進(jìn)行了報(bào)道。人們對這一成果的關(guān)注并非空穴來風(fēng)，特別 是近幾年來H5N1型禽流感病毒在世界各國的肆虐，為家禽養(yǎng)殖業(yè)甚至人類的安全造成 了重大的沖擊， 一度人們曾談"禽"色變。在世界各國采取了一系列的"防堵""封殺"的舉 措而又難有滿意收效的同時(shí)，科學(xué)工作者己經(jīng)在思考另辟途徑利用轉(zhuǎn)基因的方法從根本 上解決家禽在這一問題上的"軟肋"。但是在慢病毒載體法出現(xiàn)以前，出于對傳統(tǒng)家禽轉(zhuǎn) 基因方法效率低下的考慮，這方面的工作幾乎是不可想象的。同時(shí)，人們也寄希望于通 過轉(zhuǎn)基因方法打破現(xiàn)有家禽育種的沉悶格局，開創(chuàng)家禽生產(chǎn)的新局面。
其它轉(zhuǎn)基因方法在家禽轉(zhuǎn)基因中面臨的困境主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面1、由于家 禽特殊生理機(jī)制的限制(如大的卵黃、有蛋殼、受精卵的早期發(fā)育等)，禽類卵子、受精 卵的獲取及植入都異常的艱難，同時(shí)受精卵中的雄原核難于分辨，基于顯微注射及核移 植的方法操作困難。2、整合、繼代傳遞及表達(dá)效率的限制，如逆轉(zhuǎn)錄病毒(慢病毒以 外)介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、精子載體法等，雖然也可獲得有外源基因整合的個(gè)體，但 往往效率低，難繼代傳遞，表達(dá)微弱或完全基因沉默。3、干細(xì)胞培養(yǎng)條件及獲取方法 的限制，由于與哺乳動(dòng)物有較大的差異，適用于哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞培養(yǎng)體系在禽類應(yīng)用 上往往并不讓人十分滿意。
而慢病毒載體法很好的解決了這些問題，這主要是因?yàn)槁《据d體與其它逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體相比有諸多優(yōu)勢，如慢病毒載體既可感染分化細(xì)胞(包括原代及繼代培養(yǎng)細(xì)胞)， 對未分化細(xì)胞如原生殖細(xì)胞、干細(xì)胞等也有很好的感染原性，并且可以某種未知機(jī)制克 服外源基因經(jīng)細(xì)胞分化及胚胎發(fā)育出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄沉默現(xiàn)象(Naldini L, Blomer U， Gallay P,etal. Science, 1996,272:263-267)。轉(zhuǎn)基因使用的慢病毒載體是在安全性方面做了重大 改進(jìn)的第三代復(fù)制缺陷型病毒。復(fù)制缺陷型病毒其所有輔助基因及致病基因均被敲除， 沒有自我復(fù)制能力及致病性，但保留了感染細(xì)胞并使外源基因整合進(jìn)入分裂期細(xì)胞基因 組的能力。泡狀口腔炎病毒G糖蛋白(VSV-G)包裝外殼蛋白的引入增加了宿主的廣泛 性，也使高滴度病毒顆粒的生產(chǎn)成為可能(Reiser J. Gene Therapy, 2000， 7: 910-913)。 雖然慢病毒也是以隨機(jī)整合的方式進(jìn)入基因組，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，以慢病毒載體生產(chǎn)轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物可以獲得較好的表達(dá)效率及繼代傳遞比率。同時(shí)，現(xiàn)已發(fā)表的以慢病毒載體進(jìn) 行轉(zhuǎn)基因雞生產(chǎn)的方法均是以病毒濃縮液直接注射雞胚盤實(shí)現(xiàn)的，利用了其囊胚易接近 的特點(diǎn)而避開了干細(xì)細(xì)胞的復(fù)雜培養(yǎng)，顯示了極大的便利性。
雖然以慢病毒載體對胚盤(囊胚)進(jìn)行直接注射與其它生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家禽的方法相比 表現(xiàn)出很強(qiáng)的高效性、便利性，但實(shí)際生產(chǎn)中的技術(shù)障礙及困難仍然不容忽視，集中體 現(xiàn)在以下方面
1、 要經(jīng)過禽卵的開腔操作及胚盤注射，操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，對胚胎影響大，孵 化率低。禽卵的開腔一般有兩種， 一種是通過換蛋殼的方法， 一種是蛋殼的側(cè)壁開窗， 不論哪種方法都要求操作者有一定的操作經(jīng)驗(yàn)，胚盤注射要小心謹(jǐn)慎，即便如此對一個(gè) 有經(jīng)驗(yàn)的操作人員，在操作中即使有意的把操作失敗的個(gè)體人為剔除掉，其孵化率一般 也只有4-30%。
2、 成本高、病毒消耗大。 一般病毒在注射前要濃縮200-1000倍，而每一禽卵的注射 量達(dá)10-20pL,病毒消耗量十分可觀。
3、 是否生殖嵌合進(jìn)而能穩(wěn)定傳代也是未知數(shù)。
4、 轉(zhuǎn)基因個(gè)體少，擴(kuò)群慢。由于孵化率低，而孵出個(gè)體的轉(zhuǎn)基因比率也不高，陽性 個(gè)體數(shù)十分有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是對現(xiàn)有慢病毒載體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞方法進(jìn)行技術(shù)優(yōu)化， 進(jìn)一步增加其便利性，降低成本，提供一種以慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得 轉(zhuǎn)基因雞的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的思路是將慢病毒載體直接注射雞睪丸，使內(nèi)源精 原干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因，進(jìn)而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的精子，與正常母雞交配后獲得轉(zhuǎn)基因雞。 若要實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，必須要解決如下問題
一是，慢病毒能否感染精原干細(xì)胞。雖然有以慢病毒感染哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞的例
證，但這并不一定能說明慢病毒同樣可以感染禽類精源干細(xì)胞。但Kalina等的結(jié)果(Kalina J, Senigl F， Micva'kova A et al. Reproduction, 2007，134:445453)可從一個(gè)方面佐 證，慢病毒完全可以感染禽類的精原干細(xì)胞，雖然Kalina等使用的是非慢病毒的載體， 但二者具有相同的VSV-G包裝外殼蛋白，說明其同樣可以被慢病毒所識(shí)別。
二是，慢病毒能否通過血睪屏障感染精原干細(xì)胞。因?yàn)檠G屏障能隔絕精原干細(xì)胞 與外界環(huán)境的接觸，那么慢病毒通過血睪屏障就成為感染精原干細(xì)胞的關(guān)鍵，當(dāng)血睪屏 ,障形成以后，慢病毒顯然是不可能接觸到精原干細(xì)胞的，但我們知道，血睪屏障必須在 性成熟期間，有單倍體細(xì)胞生殖細(xì)胞出現(xiàn)以后才可以形成，因此解決這一問題的策略就 是在性成熟之前進(jìn)行病毒注射。
三是，轉(zhuǎn)基因精子形成的比例問題。只有感染慢病毒的精原干細(xì)胞達(dá)到一定比例才 能保證在一定的篩選群體內(nèi)能夠發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因個(gè)體。我們策略是增加病毒濃度，進(jìn)行多點(diǎn) 注射，或進(jìn)行曲細(xì)精管注射，或睪丸網(wǎng)注射。
具體技術(shù)方案如下
慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法，包括如下步驟
(1) 表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建，具體步驟如下
將peGFP質(zhì)粒經(jīng)JVcfe I 、 I雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后獲取增強(qiáng)型 綠色熒光蛋白基因；用相同的酶酶切pL-lacZ質(zhì)粒獲取含慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體序列的DNA 片段，以熱酶磷酸酶進(jìn)行載體去磷酸化，瓊脂糖凝膠電泳分離純化后，再以快速連接試 劑盒與綠色熒光蛋白基因連結(jié)，最后轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒。
(2) 以步驟(1)得到的表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建表達(dá)人組 織型纖溶酶原激活劑綠色熒光蛋白融合蛋白的慢病毒載體質(zhì)粒，具體步驟如下
(2a)人組織型纖溶酶原激活劑基因的PCR擴(kuò)增；
(2b)分別將人組織型纖溶酶原激活劑基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及表達(dá)綠色熒光蛋白的 慢病毒載體質(zhì)粒用Xho I 、 BamH I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后以 快速連接試劑盒進(jìn)行連結(jié)，最后轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒。
P)以步驟(1)或(2)得到的載體質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒混合物混合成四質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染
293FT細(xì)胞生產(chǎn)病毒，具體步驟如下
(3a)轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化293FT細(xì)胞，完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
(3b)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，待細(xì)胞達(dá)到90~95%融合度時(shí)，移除培養(yǎng)液，加入無雙抗培養(yǎng)基進(jìn)
行培養(yǎng)；
(3c)將步驟(1)或(2)得到的載體質(zhì)粒與包裝質(zhì)?；旌衔锇?:3質(zhì)量比混合成四 質(zhì)粒系統(tǒng)，四質(zhì)粒系統(tǒng)與脂質(zhì)體按l^g: 3pL的比例混合孵育制作DNA—脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)
6合物；
(3d)將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)瓶中，并來回輕搖以混勻，37'C孵育過夜； (3e)轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，移去含復(fù)合物的培養(yǎng)基，換上新鮮完全培養(yǎng)基； (3f)轉(zhuǎn)染后48~72小時(shí)收集含病毒上清； (3g)離心以去除細(xì)胞沉淀； (3h)取上清，抽濾；
(3i)病毒原液經(jīng)離心，棄上清，以1/200含酚紅DMEM， 4'C重懸，-80°〇保存?zhèn)溆谩?br> (4) 使用步驟(3)得到的病毒濃縮液，，加入Polybrene至最終濃度為6ug/mL,對4-15 周齡公雞進(jìn)行睪丸注射；睪丸注射方法為隨機(jī)多點(diǎn)注射，或進(jìn)行曲細(xì)精管注射，或睪丸 網(wǎng)注射。
(5) 轉(zhuǎn)染病毒的公雞與正常母雞交配后獲得轉(zhuǎn)基因雞。
有益效果本發(fā)明公開的慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方 法，其優(yōu)點(diǎn)包括-
1、 與普遍采用的慢病毒胚盤注射相比，可避開禽卵的開腔操作及胚盤注射，操作 簡便、生產(chǎn)效率高，病毒相對消耗量小，成本低，能形成穩(wěn)定的生殖嵌合，同時(shí)轉(zhuǎn)基因 個(gè)體擴(kuò)群快。
2、 慢病毒對器官組織直接注射即可實(shí)現(xiàn)外源基因的高效整合，對精原干細(xì)胞等未 分化細(xì)胞也有很高的轉(zhuǎn)染效率，可有效提高轉(zhuǎn)基因內(nèi)源精原干細(xì)胞的比例，提高獲得轉(zhuǎn) 基因后代的可能性，生產(chǎn)實(shí)用價(jià)值高。
3、 與逆轉(zhuǎn)錄病毒(慢病毒以外)介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法相比，慢病毒可以某種未 知的機(jī)制克服轉(zhuǎn)錄沉默現(xiàn)象，保證整合的外源目的蛋白基因得以有效的表達(dá)，防止整合 而不表達(dá)現(xiàn)象的發(fā)生。
4、 轉(zhuǎn)基因使用的慢病毒載體為第三代復(fù)制缺陷型病毒，已經(jīng)對其基因組結(jié)構(gòu)做了 重大改進(jìn)，安全可靠。
5、 有效性、安全性及技術(shù)操作難度低的特點(diǎn)，使轉(zhuǎn)基因雞生產(chǎn)的大范圍開展成為 可能，可促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。


圖l pL-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建圖。
圖2 pL-EGFP質(zhì)粒的鑒定圖，其中(A) pL-EGFP質(zhì)粒為經(jīng)Gene Construction Kit 2.0軟件分析的簡圖，(B) pL-EGFP質(zhì)粒的酶切鑒定，1,2為pL-EGFP質(zhì)粒，M為線性分子標(biāo)記(TOYOBO)。圖3 tPA的PCR擴(kuò)增電泳圖。 圖4 pL-tPAGFP質(zhì)粒圖。圖5 pL-tPAGFP質(zhì)粒的鑒定圖，其中，A: pL-tPAGFP質(zhì)粒為經(jīng)Gene Construction Kit2.0軟件分析的簡圖；B: pL-tPAGFP質(zhì)粒酶切鑒定圖，1，2為pL-tPAGFP質(zhì)粒，M 為線性分子標(biāo)記(TOYOBO)。圖6 pL-EGFP病毒活性檢測熒光圖。圖7轉(zhuǎn)染pL-EGFP病毒8周齡公雞睪丸切片熒光圖。圖8轉(zhuǎn)基因個(gè)體精子PCR分析。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例l:表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)來自peGFP質(zhì)粒(GeneBank Accession No: U55762, Clontech公司)，由peGFP質(zhì)粒經(jīng)AWe I 、 Wa I (NEB公司)雙酶切后經(jīng)瓊 脂糖凝膠電泳分離純化后獲取。相同的酶酶切pL-lacZ質(zhì)粒(Irwitrogen)獲取含慢病毒 轉(zhuǎn)運(yùn)載體序列的DNA片段，以熱酶磷酸酶進(jìn)行載體去磷酸化(NEB)，瓊脂糖凝膠電泳 分離純化后以快速連接試劑盒(LigaFastTM Rapid DNA Ligation System, Promega)與 EGFP連結(jié)，最后轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒，新質(zhì)粒命名為pL-EGFP (圖l)。經(jīng)Gene Construction Kit 2.0軟件分析，pL-EGFP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖3所示，大小應(yīng)為 7679bp，含有兩個(gè)4/HI和一個(gè)SamHl酶切位點(diǎn)，將質(zhì)粒分成三個(gè)片段分別為1901bp, 2122bp, 3656bp，這與質(zhì)粒經(jīng)4/HI、 B^w/Zl雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果是 一致的，見圖2。實(shí)施例2:表達(dá)人組織型纖溶酶原激活劑(tPA)綠色熒光蛋白融合蛋白的慢病毒載體質(zhì) 粒的構(gòu)建。為將tPA插入到病毒載體中，以tPA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物分別在tPA編碼區(qū)的前、 后引入^7w I及5flwH I酶切位點(diǎn)。正向引物在起始密碼子ATG前引入四個(gè)位點(diǎn)突變， 其中+3位置由A變成G沒有改變Kozak轉(zhuǎn)錄起始保守序列，不影響tPA在真核細(xì)胞中 的轉(zhuǎn)錄效率。反向引物在終止密碼子之前引入了三個(gè)突變位點(diǎn)，酶切后與EGFP基因融 合后將造成最后三個(gè)氨基酸的缺失。引物l: GCGGGAATTCTCGAGATGGATGCAA下劃線指示^7w I酶切位點(diǎn)引物2: GATTATCACGGATCCATGTTGTCAC下劃線指示BamH I酶切位點(diǎn)tPA基因模板直接為pGEM-tPA質(zhì)粒(此質(zhì)粒構(gòu)建方法是以人卵巢癌組織cDNA為 模板，根據(jù)GenBankNM—000930公布的序列設(shè)計(jì)引物，正向引物對應(yīng)第209-228bp，反 向引物對應(yīng)1897-1878bp，擴(kuò)增產(chǎn)物TA克隆進(jìn)入Promega公司pGEM-T Easy載體)， PCR為20^L反應(yīng)體系包括50ng基因組DNA， 2pl PCR緩沖液，0.2 mM dNTPs, IO^iM 引物，0.5單位的Taq DNA polymerase (Promega)。 PCR反應(yīng)條件為94。C變性2min; 94°C 30s， 58°C 30s和72。C 2min共32個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸7 min。經(jīng)擴(kuò)增獲得了一 條約1700bp的DNA片段，見圖3。表達(dá)tPA慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體的構(gòu)建是以pL-EGFP質(zhì)粒為基礎(chǔ)的。具體為分別將tPA 基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pL-EGFP質(zhì)粒用屈o I 、 5flmH I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，其中PCR 產(chǎn)物以熱酶磷酸酶載體去磷酸化(NEB)，隨后兩種產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳分離純化后 以快速連接試劑盒(LigaFastTM Rapid DNA Ligation System, Promega)進(jìn)行連結(jié)，最后 轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒，新質(zhì)粒命名為pL-tPAGFP (圖4)。經(jīng)Gene Construction Kit 2.0軟件分析，pL-tPAGFP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖5所示，大小應(yīng)為 9317bp，含有兩個(gè)4/7II和一個(gè)BflwHl酶切位點(diǎn)，將質(zhì)粒分成三個(gè)片段分別為1901bp, 3656bp, 3760bp，這與質(zhì)粒經(jīng)4/HI 、 SawH I雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果是 一致的(圖5)。實(shí)施例3:病毒的生產(chǎn)。1) 轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化293FT細(xì)胞，取約6><106個(gè)細(xì)胞種植于7501112培養(yǎng)瓶中， 加入約10ml完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。2) 轉(zhuǎn)染當(dāng)天，待細(xì)胞達(dá)到90-95%融合度時(shí)，移除培養(yǎng)液，加入6ml 293FT無雙 抗培養(yǎng)基。3) 準(zhǔn)備DNA—脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物A:取U.25嗎病毒輔助包裝質(zhì)?；旌衔?invitrogen)及3.75嗎pL-EGFP或pL-tPAGFP 質(zhì)粒，共15嗎DNA，加入到1.9mL293FT無血清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕混勻， 待用。B:取另一離心管，加入45pL的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(invitrogen)進(jìn)入1.9mL 293FT無血清無雙抗培養(yǎng)基中，輕輕吹吸混勻，室溫孵育2-4min(不能超過5min)。 迅速與B步的混合液混合，并輕輕混勻。C-室溫孵育20分鐘，以形成DNA—脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù)合物。溶液出現(xiàn)云霧狀，不影 響轉(zhuǎn)染。4) 將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)瓶中，并來回輕搖以混勻。37'C孵育過夜。5) 第二天(距轉(zhuǎn)染12h)，移去含復(fù)合物的培養(yǎng)基，換上新鮮完全培養(yǎng)基。6) 轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)收集含病毒上清，于已滅菌有蓋的15ml的尖底離心管內(nèi)。7) 4°C 3000rpm離心15分鐘，以去除細(xì)胞沉淀。8) 取上清，以0.45pm低蛋白結(jié)合PVDF濾膜進(jìn)行抽濾。小心不要產(chǎn)生氣泡。9) 病毒原液經(jīng)4°C 50000g離心2h，棄上清，以1/200含酚紅DMEM 4。C重懸，一80'C保存?zhèn)溆?。不要反?fù)凍融病毒，否則會(huì)導(dǎo)致病毒滴度下降。 取少量病毒原液加入雞胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，觀察病毒生產(chǎn)是否成功。如圖6， 表明有侵染能力的病毒產(chǎn)生。實(shí)施例4:病毒滴度分析。病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染滴度的簡單測算是通過獲取的病毒原液感染雞胚胎成纖維細(xì)胞，48h 后觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，每瓶細(xì)胞隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行熒光陽性計(jì)數(shù)，根據(jù)視野 與培養(yǎng)瓶面積的比例計(jì)算轉(zhuǎn)染的總細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而估測每mL病毒原液的轉(zhuǎn)染滴度。實(shí)施例5:病毒睪丸注射。臨注射前，病毒濃縮液加入Polybrene至最終濃度6ug/mL混均待用。取4-15周齡公雞 以速眠新II(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所)全身麻醉劑，按0.2 mL/kg體重肌肉注射公 雞，麻醉后，右側(cè)肋骨處開2 3cm切口，暴露兩側(cè)睪丸，分別隨機(jī)點(diǎn)注射病毒濃縮液， 每側(cè)睪丸注射4 5點(diǎn)，注射約0.5 mL，縫合創(chuàng)口，注射破傷風(fēng)一次及青、鏈霉素一周， 以防感染。實(shí)施例6:轉(zhuǎn)基因雞熒光觀察。注射病毒二周或性成熟后，取不同周齡個(gè)體進(jìn)行熒光觀察。對于大尺寸的樣品，用 手提式460-495nm長波紫外燈進(jìn)行熒光激發(fā)，并通過一個(gè)最大透射波長為550nm的濾 鏡進(jìn)行觀察；小尺寸樣品及切片直接在熒光顯微鏡(Leica)下進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)染pL-EGFP 病毒8周齡公雞睪丸切片熒光圖見圖7。實(shí)施例7:轉(zhuǎn)基因個(gè)體精子及轉(zhuǎn)基因后代的PCR分析。為檢測病毒注射轉(zhuǎn)基因個(gè)體精子及轉(zhuǎn)基因后代是否有目的基因EGFP的插入，我們 設(shè)計(jì)了EGFP特異引物(引物3: 5'TGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3'，引物4: 5'CAG GGCGGACTGGGTGCTCA3')用于擴(kuò)增一條674-bp片段。PCR為20pL反應(yīng)體系包 括50ng精子基因組DNA， 2^1 PCR緩沖液，0.2 mM dNTPs, 10pM引物，0.5單位的Taq DNApolymerase (Promega)。 PCR反應(yīng)的條件為94。C變性2min; 94°C 30s， 64。C 30 s和72。C 30s共35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸7min。轉(zhuǎn)基因個(gè)體精子PCR分析見圖8。SEQUENCE LISTING〈110〉劉，紅林 徐，世永〈120〉 一種慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法<130> JIT090301<歸 4〈170> Patentln version 3. 3〈210〉 1〈211〉 25〈212> 腿〈213〉 Artificial〈220〉〈223>以tPA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物〈400〉 1gcgggaattc tcgagatgga tgcaa 25〈210〉 2<211> 25〈212〉 腿<213> Artificial<220>〈223〉以tPA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物<formula>formula see original document page 13</formula>
權(quán)利要求
1、一種慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法，其特征在于將慢病毒載體直接注射雞睪丸，使內(nèi)源精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因，進(jìn)而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的精子，與正常母雞交配后獲得轉(zhuǎn)基因雞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方 法，其特征在于該方法包括如下步驟(1) 表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建；(2) 以步驟(1)得到的表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建表達(dá)人組 織型纖溶酶原激活劑綠色熒光蛋白融合蛋白的慢病毒載體質(zhì)粒；(3) 以步驟(1)或(2)得到的載體質(zhì)粒與包裝質(zhì)?；旌衔锘旌铣伤馁|(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染 293FT細(xì)胞生產(chǎn)病毒；(4) 使用步驟(3)得到的病毒濃縮液，加入PoIybrene，使Polybrene濃度為6ug/mL，對 4-15周齡公雞進(jìn)行睪丸注射；(5) 轉(zhuǎn)染病毒的公雞與正常母雞交配后獲得轉(zhuǎn)基因雞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原千細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方 法，其特征在于步驟(l)所述的表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建方法為將 peGFP質(zhì)粒經(jīng)Mfe I 、力a I雙酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后獲取增強(qiáng)型綠色熒 光蛋白基因；用相同的酶酶切pL-iacZ質(zhì)粒獲取含慢病毒轉(zhuǎn)運(yùn)載體序列的DNA片段， 以熱酶磷酸酶進(jìn)行載體去磷酸化，瓊脂糖凝膠電泳分離純化后，再以快速連接試劑盒與 綠色熒光蛋白基因連結(jié)，最后轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方 法，其特征在于步驟(2)所述的表達(dá)人組織型纖溶酶原激活劑綠色熒光蛋白融合蛋白的慢 病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括如下步驟(2a)人組織型纖溶酶原激活劑基因的PCR擴(kuò)增；(2b)分別將人組織型纖溶酶原激活劑基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及表達(dá)綠色熒光蛋白的 慢病毒載體質(zhì)粒用^fe I 、 S^wH I進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后以 快速連接試劑盒進(jìn)行連結(jié)，最后轉(zhuǎn)染JM109感受態(tài)細(xì)菌擴(kuò)增質(zhì)粒。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方 法，其特征在于步驟(3)所述的病毒的生產(chǎn)方法如下(3a)轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化293FT細(xì)胞，完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)； (3b)轉(zhuǎn)染當(dāng)天，待細(xì)胞達(dá)到90 95%融合度時(shí)，移除培養(yǎng)液，加入無雙抗培養(yǎng)基進(jìn) 行培養(yǎng)；(3c)將步驟(1)或(2)得到的載體質(zhì)粒與包裝質(zhì)?；旌衔锇?:3質(zhì)量比混合成四質(zhì)粒系統(tǒng)，四質(zhì)粒系統(tǒng)與脂質(zhì)體按lpg: 3pL的比例混合孵育制作DNA—脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染復(fù) 合物；(3d)將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入培養(yǎng)瓶中，并來回輕搖以混勻，37'C孵育過夜； (3e)轉(zhuǎn)染后12小時(shí)，移去含復(fù)合物的培養(yǎng)基，換上新鮮完全培養(yǎng)基； (3f)轉(zhuǎn)染后48~72小時(shí)收集含病毒上清； (3g)離心以去除細(xì)胞沉淀；(3h)取上清，抽濾；(3i)病毒原液經(jīng)離心，棄上清，以1/200含酚紅DMEM， 4。C重懸，-80°(:保存?zhèn)溆谩?br> 6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法，其特征在于步驟(4)所述的睪丸注射方法為隨機(jī)多點(diǎn)注射，或曲細(xì)精管注射，或睪丸網(wǎng)注射。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法，即將慢病毒載體直接注射雞睪丸，使內(nèi)源精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因，進(jìn)而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的精子，與正常母雞交配后獲得轉(zhuǎn)基因雞。本發(fā)明的慢病毒載體介導(dǎo)體內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因雞的方法，通過內(nèi)源精原干細(xì)胞途經(jīng)，可以避開禽蛋的開腔操作，病毒消耗少，擴(kuò)群快，且可穩(wěn)定傳代。
文檔編號(hào)A01K67/027GK101503706SQ200910025758
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月9日
發(fā)明者劉紅林, 徐世永 申請人:劉紅林;徐世永