一種熒光假單胞菌y13及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光假單胞菌Y13及制備方法和應(yīng)用，其分離步驟：A、稱取土樣于滅菌生理鹽水中，于恒溫?fù)u床上振蕩，靜置。B、取上清液到蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中。C、恒溫?fù)u床上培養(yǎng)；然后接種到新鮮有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)。D、將不同稀釋倍數(shù)的稀釋液涂布在有機(jī)磷固體平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。E、將平板上得到的單菌落進(jìn)行純化，最終得到的純培養(yǎng)在LB斜面上保存?zhèn)溆?。該菌株?jīng)鑒定為熒光假單胞菌Y13，已保藏，保藏號為CCTCCNO：M2012121。熒光假單胞菌Y13制劑易獲取，成本低廉，能提高土壤中可溶性磷的含量，顯著促進(jìn)植物磷元素的吸收利用,使農(nóng)作物高產(chǎn)豐產(chǎn)，減少種植成本和農(nóng)業(yè)投入，緩解由于農(nóng)用磷肥的過量施用所導(dǎo)致的環(huán)境污染。
【專利說明】—種熒光假單胞菌Y13及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬土壤環(huán)境修復(fù)治理領(lǐng)域。更具體涉及一種熒光假單胞菌Y13，同時還涉及一種熒光假單胞菌Y13的制備方法，還涉及一種熒光假單胞菌Y13在溶解土壤有機(jī)磷、增加土壤可溶性磷含量中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]磷是植物生長不可缺少的元素之一。但是，土壤中大部分的磷與Ca2+、Fe3+、Fe2+、 Al3+等陽離子結(jié)合，以難溶性的金屬螯合物形式存在，導(dǎo)致絕大多數(shù)土壤中有效磷匱乏。我國有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷不能被生物直接吸收利用。即便在施入磷肥的當(dāng)季，作物的磷利用率也只有大約5%-25%(黃偉，2006)。與此同時，為了提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量，大量磷肥被施入土壤中，其中被作物吸收的僅占很少一部分，大量磷肥被轉(zhuǎn)化為土壤中的金屬螯合態(tài)；一部分甚至在雨水清洗下流入凈水和表層水體，造成水體污染。因此，如何提高土壤中磷的生物利用率，有效促進(jìn)農(nóng)作物對土壤中磷的有效利用，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷肥的使用，降低種植成本，減少由于農(nóng)用磷肥的過量施用所導(dǎo)致的環(huán)境污染，是事關(guān)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的重要課題。
[0003]植物根際微生物與土壤中磷的存在狀態(tài)有顯著的關(guān)聯(lián)。根際微生物能夠分泌一些低分子量的有機(jī)酸，將土壤中的難溶金屬螯合狀態(tài)的磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的可溶性磷，供植物吸收利用，這些微生物被稱為溶磷菌。目前報道的溶磷菌包括青霉菌、腸桿菌、 枯草芽孢桿菌、沙雷氏菌EB67和假單胞菌CDB35等。溶磷菌的施用能夠促進(jìn)植物生長，部分溶磷菌還具有生防能力，能夠抑制部分作物病原菌，增加作物的抗病能力。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前全世界各地共篩選出30屬89種溶磷微生物，其中真菌27個種，細(xì)菌58個種，放線菌 4 個種(范丙全,2001 ；Loganathan, 2003 ；Peix, 2004 ；Longanathan2004 ；Rivas, 2006 ； Son,2006)。[0004]利用溶磷微生物可提高土壤中可溶性磷的含量，能夠顯著促進(jìn)植物磷元素的吸收利用，使農(nóng)作物高產(chǎn)豐產(chǎn)。劉榮呂等(1993)把分離到的歐文氏菌(Erwina)解磷細(xì)菌制成微生物菌劑接入土壤后，小麥增產(chǎn)10.4%，綠豆增產(chǎn)23.8%。Chabot (1996)等人發(fā)現(xiàn)，施加溶磷菌能促進(jìn)西紅柿、洋蔥、馬鈴薯、香蕉、柑橘及咖啡的產(chǎn)量。
[0005]溶磷菌菌種資源是解磷微生物肥料的核心和關(guān)鍵。本發(fā)明從環(huán)境土壤中篩選到一株具有高效溶磷能力的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)Y13,并對其解磷能力進(jìn)行了測定，以該溶磷菌制備的微生物菌劑具有很好的土壤溶磷效果，是一種潛在的微生物肥料生產(chǎn)菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是在于提供了一種具有溶解有機(jī)磷能力的溶磷菌——熒光假單胞菌Y13，它從三峽消落帶土壤中分離，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的難溶性有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的可溶性磷，從而促進(jìn)植物生長和提高產(chǎn)量。[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種熒光假單胞菌Y13的制備方法，該菌株在實驗室條件下能夠溶解有機(jī)磷，釋放其中的磷元素；同時，該菌株能夠有效釋放實際土壤中有機(jī)磷的磷元素，顯示了本發(fā)明所提供的菌株在土壤溶磷解磷、改善農(nóng)作物磷素營養(yǎng)方面的運(yùn)用。該菌制備方法簡便快捷。
[0008]本發(fā)明的再一個目的在于提供了一種熒光假單胞菌Y13在溶解土壤難溶磷、提高有效磷含量、改善植物磷素營養(yǎng)中的應(yīng)用，該菌株能夠有效釋放土壤有機(jī)磷的磷元素，顯示了本發(fā)明所提供的菌株能有效促進(jìn)土壤中磷的釋放，增強(qiáng)農(nóng)作物對土壤中磷的有效利用， 提高了土壤中磷的生物利用率，減少了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷肥的使用，降低了種植成本，能有效緩解由于農(nóng)用磷肥的過量施用所導(dǎo)致的環(huán)境污染問題。[0009]為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0010]一種熒光假單胞菌Y13的制備方法，其步驟是:
[0011]A、稱取5g 土樣于90mL滅菌生理鹽水中，于28°C恒溫?fù)u床上150r/min振蕩30min, 靜置lmin。
[0012]B、取上清液5mL到蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中(葡萄糖10.00g, (NH4)2SO40.50g， MgSO4 ? 7H20 0.30g, NaCl 0.30g, KCl 0.30g, FeSO4 ? 7H20 0.03g, MnSO4 ? 4H20 0.03g, CaC035.0Og,卵磷脂 2.0Og,蒸餾水 1000ML, PH7.0 -7.2)。
[0013]C、28°C恒溫?fù)u床上150r/min，培養(yǎng)3天；然后以1:100體積比接種到新鮮有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3天，取ImL菌液進(jìn)行10倍系列稀釋；
[0014]D、然后將100 UL不同稀釋倍數(shù)的稀釋液涂布在有機(jī)磷固體平板上(即在液體培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂),倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。
[0015]E、將得到的單菌落在有機(jī)磷固體平板上進(jìn)一步地劃線分離純化。經(jīng)多次分離篩選后，將分離到的純培養(yǎng)在LB斜面上保存?zhèn)溆谩?br> [0016]通過上述步驟獲得了熒光假單胞菌Y13， 申請人:于2012年4月20日將該菌株送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，地址:中國武漢武漢大學(xué)保藏編號=CCTCC NO: M2012121,分類命名:突光假單胞菌 Y13Pseudomonas f lorescens Y13。
[0017]溶磷菌Y13的特性:
[0018]①生物學(xué)特性:菌株呈短桿狀，革蘭氏陰性菌(圖1)，無芽孢，專性需氧，最適生長溫度20°C-28°C。
[0019]②遺傳學(xué)特性:結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)該菌為熒光假單胞菌。
[0020]③培養(yǎng)條件:熒光假單胞菌Y13菌株保存采用LB培養(yǎng)基；測試其對有機(jī)磷的溶磷效果采用有機(jī)磷液體培養(yǎng)基:葡萄糖10.00g, (NH4)2SO40.50g, MgSO4 ? IW2Q 0.30g, NaCl 0.30g, KC10.30g, FeSO4 ? 7H20 0.03g, MnSO4 ? 4H20 0.03g, CaC035.0Og,卵磷脂 2.0Og,蒸餾水 IOOOmL,瓊脂 15-18g/L, PH7.0-7.2。121 °C高壓蒸汽滅菌 30min。并進(jìn)行 28°C，180r/min 搖瓶培養(yǎng)。制備固體培養(yǎng)基以雞蛋黃稀釋液代替。雞蛋黃稀釋液制備方法:用酒精擦凈新鮮雞蛋外殼，取蛋黃，約加5mL等量的無菌生理菌水，混勻。將蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基融化冷卻至50°C后，立即加入卵黃液。每IOOmL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加5mL卵黃稀釋液作為有機(jī)磷源，混勻后分裝于培養(yǎng)皿內(nèi)凝成平板(李繁，2006)。圖2為Y13在LB培養(yǎng)基中的生長曲線，菌株培養(yǎng)3h后進(jìn)入對數(shù)生長期，28h后進(jìn)入穩(wěn)定期。
[0021]④功能特性:將Y13菌株點(diǎn)種到有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)，測定溶磷菌Y13溶解有機(jī)磷的能力。熒光假單胞菌Y13能將固體平板中的卵磷脂大分子分解為脂肪和磷酸，形成清晰的水解圈。溶磷菌的溶磷能力用菌落(d)和溶磷圈(D)的直徑的比值，即D/d 值評價。隨著培養(yǎng)時間的增加，D/d增加，6天后其值為4.03。將Y13菌株接種到裝有IOOmL 有機(jī)磷液體培養(yǎng)基的三角瓶中，其中卵磷脂的濃度為2.0g/L，對照處理接入等量的無菌水。 震蕩培養(yǎng)5天后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至無菌的50mL的離心管中，進(jìn)行超聲波破碎(200w，20min), 4000r/min離心20min,取上清5mL,用鑰鋪抗比法測可溶性磷的含量(張祥勝,2008),結(jié)果表明添加溶磷菌的測試體系中可溶性磷的含量為135.4mgL。
[0022]一種熒光假單胞菌Y13在溶解土壤難溶磷、提高有效磷含量、改善植物磷素營養(yǎng)中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程如下:
[0023]①微生物菌劑的制備:
[0024]1)將保存在LB斜面上的一種熒光假單胞菌Y13菌株接種新鮮LB斜面，28°C活化過夜；
[0025]2)接種到LB液體培養(yǎng)基中，28°C，180r/min過夜培養(yǎng)。
[0026]3)然后以1:100的比例接種到新鮮培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)到菌體濃度達(dá)到IO7— 108cfu/mL 為止。
[0027]4)取IOOg草炭到三角瓶中，120°C, 30min,高溫滅菌。
[0028]5)加入IOmL菌液到IOOg滅菌草炭中，均勻混合。菌劑的含水量達(dá)到手攥成團(tuán)，一碰即散的程度。
[0029]6)將混合好的菌劑放置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)到草炭中的菌量達(dá)到Kf-KTcfu/g。即為微生物菌劑。
[0030]②微生物菌劑對土壤有機(jī)磷的溶磷效果:
[0031]采用基于一種熒光假單胞菌Y13菌株的微生物菌劑，測試其對添加卵磷脂后的實際土壤的溶磷效果。土壤取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獅子山(其它地方也可以)。
[0032]1)按5.0g:1OOOg (卵磷脂:土)的比例，在土壤樣品中加入卵磷脂，混勻。
[0033]2) 一共分為四個處理方式:1)滅菌土(對照組I) ；2)非滅菌土(對照組2) ；3)非滅菌土 +微生物菌劑；4)滅菌土 +微生物菌劑。每個處理設(shè)有3個重復(fù)。
[0034]3)每500克含卵磷脂的土樣中加入10克微生物菌劑，混勻后置于盆中，室溫放置。 對照組加入10克滅菌草炭。
[0035]4)分別于處理7天、14天、21天定時取樣分析該菌株的溶磷效果。
[0036]5)如圖3所示，施加微生物菌劑七天后，土壤中可溶性磷的含量增加到380g/kg。
[0037]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0038](1)微生物制劑易獲取，成本低廉。
[0039](2)利用Y13微生物菌劑可提高土壤中可溶性磷的含量，能夠顯著促進(jìn)植物磷元素的吸收利用，使農(nóng)作物高產(chǎn)豐產(chǎn)，是一種很有市場前景的微生物肥料生產(chǎn)菌，具備商業(yè)化應(yīng)用的潛力。
[0040](3)利用Y13微生物菌劑，能降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中磷肥的使用，減少種植成本和農(nóng)業(yè)投入，緩解由于農(nóng)用磷肥的過量施用所導(dǎo)致的環(huán)境污染。
【專利附圖】

【附圖說明】[0041]圖1為一種熒光假單胞菌Y13在LB培養(yǎng)基中的生長曲線示意圖。
[0042]圖2為一種熒光假單胞菌Y13菌株革蘭氏染色結(jié)果示意圖。
[0043]圖3為一種熒光假單胞菌Y13菌劑對土壤中卵磷脂的溶磷能力測試示意圖。
[0044]橫坐標(biāo)表示培養(yǎng)時間(d)，縱坐標(biāo)表示可溶性磷的含量(單位:mg/l)。
【具體實施方式】
[0045]以下敘述是根據(jù)本發(fā)明實施方案的實施例。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。本發(fā)明中所涉及的其他各種實驗操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，文中沒有特別說明的部分，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請日之前的各種常用工具書、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說明書、手冊等加以實施。
[0046]實施例1: 一種熒光假單胞菌Y13的制備方法及溶磷能力的檢測
[0047]1、菌株分離:
[0048]A、稱取5g土樣于90mL無菌生理鹽水中，于28°C恒溫?fù)u床上180r/min振蕩30min, 靜置lmin。
[0049]B、取上清液5mL到蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中(葡萄糖10.00g, (NH4) 2S040.50g， MgSO4 ? 7H20 0.30g, NaCl 0.30g, KCl 0.30g, FeSO4 ? 7H20 0.03g, MnSO4 ? 4H20 0.03g, CaC035.0Og,卵磷脂 2.0Og,蒸餾水 1000ML，PH7.0-7.2)。
[0050]C、28°C恒溫?fù)u床上180r/min，培養(yǎng)3天。
[0051 ] D、以1:100比例接種到新鮮有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3天，取ImL菌液進(jìn)行 10倍系列梯度稀釋。
[0052]Ejf 100 U L不同稀釋倍數(shù)的稀釋液(10—1，10_2，10_3，10_4，10_5)分別涂布在有機(jī)磷固體平板上，制備固體培養(yǎng)基以雞蛋黃稀釋液代替卵磷脂。
[0053]F、雞蛋黃稀釋液制備:用酒精擦凈新鮮雞蛋外殼，取蛋黃，約加5mL等量的無菌生理菌水，混勻。將蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基融化冷卻至50°C后，立即加入卵黃液。每IOOmL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加5mL卵黃稀釋液作為有機(jī)磷源，混勻后分裝于培養(yǎng)皿內(nèi)凝成平板(李繁，2006)。 液體培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂,倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。
[0054]F、將平板上長出的單菌落在上述有機(jī)磷平板上進(jìn)一步地劃線分離純化。經(jīng)多次分離篩選后，將分離到的純培養(yǎng)在LB斜面上保存?zhèn)溆谩?br> [0055] 申請人:將上述分離得到的菌株命名為Y13，經(jīng)鑒定為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。 申請人:于2012年4月20日將該菌株送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC) 保藏，其保藏編號為:CCTCC NO:M2012121。
[0056]2、菌株的生物學(xué)特性:
[0057]①生物學(xué)特性:熒光假單胞菌Y13為桿狀的革蘭氏陰性細(xì)菌(圖1);最適生長溫度 28。。。
[0058]②遺傳學(xué)特性:熒光假單胞菌Y13菌株的16S rDNA序列見SEQ ID NOl，序列分析結(jié)果表明:Y13與突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的16S rDNA序列相似性達(dá) 100% ;結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，確認(rèn)該菌株為熒光假單胞菌。
[0059]③培養(yǎng)條件:熒光假單胞菌Y13菌株保存采用LB培養(yǎng)基；測試其對有機(jī)磷的溶磷效果采用有機(jī)磷液體培養(yǎng)基:葡萄糖10.00g, (NH4)2SO40.50g, MgSO4 ? IW2Q 0.30g, NaCl0.30g, KC10.30g, FeSO4 ? 7H20 0.03g, MnSO4 ? 4H20 0.03g, CaC035.0Og,卵磷脂 2.0Og,蒸餾水lOOOmL，瓊脂15-18gL，PH7.0-7.2。121°C高壓蒸汽滅菌30min。制備固體培養(yǎng)基以雞蛋黃稀釋液代替。雞蛋黃稀釋液制備方法:用酒精擦凈新鮮雞蛋外殼，取蛋黃，約加5mL等量的無菌生理菌水，混勻。將蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基融化后冷卻至50°C后，立即加入卵黃液。每 IOOmL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加5mL卵黃稀釋液作為有機(jī)磷源，混勻后分裝于培養(yǎng)皿內(nèi)凝成平板(李繁，2006)。圖2為Yl3在LB培養(yǎng)基中的生長曲線，菌株培養(yǎng)3h后進(jìn)入對數(shù)生長期，28h后進(jìn)入穩(wěn)定期。
[0060]3、一種熒光假單胞菌Y13的溶磷能力測試:
[0061]I)溶磷圈的測定:
[0062]將一種熒光假單胞菌Y13點(diǎn)種到有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)，測定溶磷菌Y13 溶解有機(jī)磷的能力。溶磷菌的溶磷能力用菌落(d)和溶磷圈(D)的直徑的比值，即D/d值評價。隨著培養(yǎng)時間的增加，Y13將固體平板中的卵磷脂大分子分解為脂肪和磷酸，形成清晰的水解圈。
[0063]表I為點(diǎn)種溶磷菌Y13后2、4、6天的D/d值。
【權(quán)利要求】
1.一種突光假單胞菌，其特征在于:突光假單胞菌fluorescens) Y13, CCTCC, NO:M2012121o
2.權(quán)利要求1所述的一種熒光假單胞菌Y13在溶解土壤難溶磷中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的一種熒光假單胞菌Y13在提高有效磷含量中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的一種 熒光假單胞菌Y13在改善植物磷素營養(yǎng)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103451116SQ201210180724
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月4日
【發(fā)明者】陳雯莉, 黃巧云, 高怡 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)