一種治療骨質(zhì)疏松的重組人甲狀旁腺激素(1-34)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種治療骨質(zhì)疏松重組人甲狀旁腺素(1-34)及其制備方法，通過人工合成編碼重組人甲狀旁腺素(1-34)氨基酸序列的DNA序列，并克隆入表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，并獲得融合表達(dá)甲狀旁腺素(1-34)的基因工程菌，發(fā)酵培養(yǎng)工程菌，經(jīng)過表達(dá)后的處理工作，獲得甲狀旁腺素(1-34)。本發(fā)明所提供的重組人甲狀旁腺素(1-34)與人體內(nèi)天然的人甲狀旁腺素(1-84)的C-端的第1-34個(gè)氨基酸具有相同的氨基酸序列，并且二者具有相同的生物活性和生理、藥理學(xué)特征，且工藝簡單，重現(xiàn)性好，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。
【專利說明】一種治療骨質(zhì)疏松的重組人甲狀旁腺激素(1-34)
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及利用基因工程技術(shù)制備多肽或蛋白的方法，尤其涉及一種治療骨質(zhì)疏松的重組人甲狀旁腺激素(1-34)，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
技術(shù)背景:
[0002]骨質(zhì)疏松癥為一種以骨量降低和骨的微結(jié)構(gòu)退化為特征的全身性骨骼疾病，其后果為骨的脆性增加和容易發(fā)生骨折。它是一些老年性人口增加國家的主要健康問題。目前在全世界大約累及1500萬人的健康。其中包括所有絕經(jīng)期婦女的三分之一。僅在美國，骨質(zhì)疏松癥在美國每年造成150萬人發(fā)生骨折，40萬人需要進(jìn)行住院治療，4400萬人次-天的家庭護(hù)理，花費(fèi)大約140億美圓的健康護(hù)理費(fèi)用，現(xiàn)行的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物，包括補(bǔ)鈣、維生素D、二磷酸鹽、降鈣素、氯化鈉、雌激素及其衍生物等，主要是通過抑制破骨細(xì)胞的活性，減緩骨質(zhì)的分解而減少骨質(zhì)流失，達(dá)到緩解骨質(zhì)疏松癥。
[0003]甲狀旁腺激素(PTH)，是調(diào)節(jié)骨細(xì)胞新陳代謝的重要因子，既可刺激破骨細(xì)胞的增殖及其對老化骨質(zhì)的分解，又具有促進(jìn)成骨細(xì)胞合成新骨的作用。甲狀旁腺激素可以激活成骨細(xì)胞活性，分解吸收老化骨質(zhì)，增加骨質(zhì)量及骨質(zhì)密度。此外甲狀旁腺激素可以促進(jìn)腎小管細(xì)胞對鈣離子的再吸收，激活腎臟產(chǎn)生Ia羥化酶，后者使維生素D3Z轉(zhuǎn)化為la，25 (OH) 2維生素D3，從而促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞對鈣離子的吸收，為成骨細(xì)胞合成新骨提供物質(zhì)保障。因此，甲狀旁腺激素可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的理想藥物。
[0004]甲狀旁腺激素含84個(gè)氨基酸，簡稱PTH (1-84)，其N-端1_34個(gè)氨基酸片段是天然PTH的活性部分。天然甲狀旁腺激素由甲狀旁腺分泌，當(dāng)其進(jìn)入血液內(nèi)后，很快代謝為N-端1-34氨基酸片段，后者與PTH受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)活性強(qiáng)于天然甲狀旁腺激素。
[0005]由于hPTH在治療骨質(zhì)疏松癥方面可能具有很好的應(yīng)用前景，關(guān)于PTH制備方法的研究逐漸引起了人們的重視，除了用固相肽方法合成較短的PTH1-34肽及其類似物外，F(xiàn)orsberg G和BrobjerM等還將Hpthl_34肽基因和IgG結(jié)合蛋白融合后,在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，利用Thrombin&H64A兩種酶切加工手段，分別得到5mg/L和8mg/l的最終得率。
[0006]Yuji Suzuki, Masayuki Yabuta and Kazubiro Ohsuye 則利用 B-galactosidasederivative與PTH(1-34)融合后在大腸桿菌中形成包涵體，利用Kex2_660和V8蛋白酶對其進(jìn)行修飾已得到正確加工的hPTH(l-34)肽。然后，通過一下工藝是流程是:菌體發(fā)酵-洗滌純化融合蛋白(包涵體)_酶解-加乙酸初步去除雜質(zhì)蛋白-POROS HS50柱純化-P0R0SR250純化-去除乙腈-TSK凝膠-120T純化的純品，最終，得到了 0.5g/l的產(chǎn)量。
[0007]然而，到目前為止，甲狀旁腺激素1-34的生產(chǎn)工藝還不能十分令人滿意。因?yàn)楸绢I(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的生產(chǎn)PTH(1-34)肽的工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0008]本發(fā)明的目的在于:針對現(xiàn)有技術(shù)，提供一種藥物及其制備新方法；
[0009]本發(fā)明另一個(gè)目的是所提供的藥物對骨質(zhì)疏松，特別是絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的治療具有顯著的療效；
[0010]本發(fā)明所提供的藥物作用明顯，毒性很低，用藥安全、價(jià)格低廉，且生產(chǎn)工藝科學(xué)合理，操作可行、生產(chǎn)成本低。
[0011]本發(fā)明是這樣構(gòu)成的:
[0012]設(shè)計(jì)并合成了編碼人甲狀旁腺素(1-34)的雙鏈DNA序列，并將該片段克隆入表達(dá)載體中形成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入菌體，經(jīng)篩選得到高效表達(dá)人甲狀旁腺素(1-34)基因工程菌株。該基因工程菌以Thioredoxin為融合伴侶融合表達(dá)hPTH(l_34)，所表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過分離純化后，得到高度純化的rhPTH(l-34)。
[0013]更為具體的制備工藝為:
[0014]甲狀旁腺素(1-34)是由甲狀旁腺合成和分泌的甲狀旁腺激素的活性片段，按照遺傳密碼的通用性、簡并性和大腸桿菌對遺傳密碼使用的偏好性原則，設(shè)計(jì)并合成了適合在大腸桿菌表達(dá)的編碼人甲狀旁腺素(1-34)的雙鏈DNA序列片段；
[0015]片段克隆入表達(dá)載體pTDa中形成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，經(jīng)篩選得到高效表達(dá)人甲狀旁腺素(1-34)基因工程菌株HXBOl ；
[0016]基因工程菌以Thioredoxin為融合伴侶融合表達(dá)hPTH(l_34)，所表達(dá)的融合蛋白經(jīng)過分離純化；
[0017]采用凝血酶(Thrombin)將hPTH(l_34)從融合蛋白上切割下來,經(jīng)過分離純化,得到高度純化的rhPTH(1-34)。`
[0018]具體的實(shí)施方式為:
[0019]說明:以下說列舉的實(shí)施例只為更充分的說明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明所要求保護(hù)的內(nèi)容。
[0020]實(shí)施例1:基因工程菌的構(gòu)建及穩(wěn)定性考察
[0021]1、基因的設(shè)計(jì)與表達(dá)載體選擇
[0022]按照現(xiàn)有技術(shù)合成PTH (1-34)，并選擇pTDa作為表達(dá)載體，該載體具有如下特點(diǎn):
[0023]①具有強(qiáng)啟動子Ptac，其轉(zhuǎn)錄啟動能力比LacUV5啟動子強(qiáng)5倍，從而為rhPTH(l-34)融合蛋白的高效表達(dá)提供了前提條件；
[0024]②Thioredoxin(硫氧還蛋白)編碼序列，來源于E.coli K12菌株,在表達(dá)載體中作為融合伴侶，hPTH(l-34)基因與其C-末端同相位融合。Thioredoxin作為融合伴侶，本身的分子量不大(約為12KDa)，因而間接提高了目的多肽在整個(gè)表達(dá)中所占的比例；更為重要是Thioredoxin具有質(zhì)子供體的功能,在因融合蛋白高效表達(dá)而形成包涵體的情況下，在包涵體的復(fù)性過程中，Thioredoxin能催化融合蛋白復(fù)性,從而極大提高復(fù)性效率，使工藝得到簡化。
[0025]③多克隆位點(diǎn)(MCS)位于Thioredoxin基因的C-末端，利于目的基因在Thioredoxin基因C-末端融合表達(dá)。
[0026]3.重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0027]①目的基因片段的制備:大量制備含hPTH(l_34)基因片段的pUC18載體，用EcoRI和SalI雙酶切下hPTH(l_34)編碼基因小片段，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化hPTH(l-34)編碼基因片段。
[0028]②表達(dá)載體大片段的制備:大量制備pTDa質(zhì)粒DNA載體，用EcoRI和SalI雙酶切質(zhì)粒，用低熔點(diǎn)瓊脂糖法分離、回收PTDa的質(zhì)粒DNA大片段，并用酚氯仿對所提取DNA進(jìn)行純化。用小牛堿性磷酸酶對分離純化好的PTDa的質(zhì)粒DNA大片段進(jìn)行脫5’-磷酸化處理。
[0029]③重組質(zhì)粒DNA的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化:將純化好的目的基因片段和表達(dá)載體大片段按5: I比例混合，加入適量的T4 DNA Ligase、相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液和終濃度為ImM的ATP，16°C保溫4小時(shí)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HBlOl，經(jīng)篩選即得rhPTH(1-34)高效表達(dá)基因工程菌 HXBOI。
[0030]實(shí)施例2:rhPTH(l-34)融合蛋白的表達(dá)及目標(biāo)產(chǎn)物的獲得
[0031]1.工程菌XOl發(fā)酵培養(yǎng)
[0032]①培養(yǎng)基的篩選:采用TB培養(yǎng)基發(fā)酵，細(xì)菌密度和rhPTH (1-34)融合蛋白的表達(dá)量優(yōu)于其它培養(yǎng)基，故選定TB培養(yǎng)基作為工程菌XOl中試生產(chǎn)用培養(yǎng)基。
[0033]②培養(yǎng)條件的選擇:當(dāng)發(fā)酵體積為20升時(shí)，D.0控制在30%以上，pH控制在7.0，37°C培養(yǎng)；當(dāng)0.D600達(dá)到12時(shí)，加入IPTG使其終濃度為0.5mM誘導(dǎo)。4小時(shí)后停止發(fā)酵培養(yǎng)，收獲細(xì)菌。即得到較好的細(xì)菌量和高的表達(dá)效率。
[0034]③在上述條件下，我們連續(xù)進(jìn)行三批中試發(fā)酵。結(jié)果表明:該發(fā)酵工藝穩(wěn)定可靠，且重現(xiàn)性較好。
[0035]2.分離純化
[0036]①融合蛋白的分離及復(fù)性
[0037]發(fā)酵培養(yǎng)所得的發(fā)酵液,經(jīng)冷凍高速離心機(jī)離心(5000rpm,5min),收集菌體并用緩沖液洗菌一次。然后將菌體以20% (g/g)比例懸浮于緩沖液中，用超聲細(xì)胞破碎儀破菌三次，鏡檢破菌結(jié)果，破菌率在95%以上，離心得包涵體沉淀。將包涵體沉淀用含8M脲素的緩沖液在37°C下溶解4小時(shí)，然后9000rpm離心30分鐘，棄沉淀。上清緩慢加入復(fù)性緩沖液稀釋至脲素的終濃度為IM濃度，通過上述處理，其復(fù)性效率可達(dá)90%以上，復(fù)性融合蛋白純度可達(dá)60-70%。
[0038]②酶解條件的選擇
[0039]以I單位酶:5mg融合蛋白的比例加入Thrombin于離心所得上清,37°C保溫,每I小時(shí)取樣至24小時(shí)，經(jīng)SDS-PAGE分析，反應(yīng)4小時(shí)酶切效率可達(dá)70%，反應(yīng)20小時(shí)后酶切
效率只略有提高。
[0040]③rh PTH (1-34)的分離純化
[0041]由于rhPTH(l_34)等電點(diǎn)為8.7，在pH8.0時(shí)帶正電荷。因此酶解液直接上用緩沖液平衡好的Q-Sepharose F.F.柱，此時(shí)rhPTH(l_34)不被吸附，而其它雜蛋白、核酸及酶切掉的融合片段絕大部分被填料吸附；穿透液再上經(jīng)0.1% TFA H20平衡的S0urcel5RPC柱，經(jīng)Acetonitrile梯度洗脫，此時(shí)rhPTH(l-34)純度達(dá)95%以上。因所收集的活性峰含有Acetonitrile,故上SP-Sepharose F.F.,洗下活性峰經(jīng)稀釋即得rhPTH(l_34)多肽原液。以上步驟收率可達(dá)到40%左右。
[0042]④rh PTH (1-34)分裝及凍干
[0043]將rhPTH(l_34)多肽原液用磷酸鹽緩沖液稀釋至20ug/ml，并加入注射用甘露純至終濃度為1%，分裝成Iml/瓶，凍干即得成品。
[0044]實(shí)施例3:rhPTH(l-34)原液及成品的檢定
[0045]1.rhPTH(1-34)原液檢定
【權(quán)利要求】
1.一種治療骨質(zhì)疏松重組人甲狀旁腺素(1-34)，它包括下述步驟獲得: ①設(shè)計(jì)并人工合成編碼甲狀旁腺素PTH1-34氨基酸序列的DNA序列； ②構(gòu)建含有甲狀旁腺素PTH1-34多肽編碼序列的重組質(zhì)粒的表達(dá)載體； ③將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，獲得融合表達(dá)或者非融合表達(dá)的甲狀旁腺素PTH1-34基因工程菌； ④發(fā)酵培養(yǎng)工程菌； ⑤表達(dá)后處理，獲得甲狀旁腺素PTH1-34。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟②中所述的表達(dá)載體是原核表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的原核表達(dá)載體是大腸桿菌融合表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的大腸桿菌融合表達(dá)載體是pTDa0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟⑤中所述的表達(dá)后處理包括下述步驟:純化融合蛋白，用用凝血酶(Thrombin)將hPTH(l_34)從融合蛋白上切割下來,分離純化經(jīng)過分離純化，得到高度純化的rhPTH(l-34)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的制備方法，其特征在分離純化工藝按一下方式進(jìn)行:破菌復(fù)性-酶解-過柱。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述 的分離純化工藝步驟，其特征在于所述的酶解條件是按融合蛋白與酶用量比為5: I。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的酶解條件,其特征在于所述的酶:Thrombin。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的過柱純化工藝，其特征在于所述在于將上述酶解液直接上用緩沖液平衡好的Q-Sepharose F.F.柱，穿透液再上經(jīng)0.1 % TFA H2O平衡的Sourcel5RPC柱，經(jīng)Acetonitrile梯度洗脫。
【文檔編號】C12N15/70GK103451219SQ201210179832
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月4日
【發(fā)明者】董佳里, 鐘邵東, 徐小萍 申請人:成都博發(fā)生物技術(shù)有限公司, 天津博發(fā)生物技術(shù)有限公司