專利名稱：一種用于As污染土壤修復(fù)的微生物菌株的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中微生物篩選領(lǐng)域，特別涉及一種用于As污染土壤生物修復(fù)的微生物菌株的篩選方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)重金屬污染土壤的修復(fù)研究正受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注，而生物修復(fù)重金屬污染土壤更是眾所關(guān)注的焦點(diǎn)，對(duì)As污染土壤也不例外。砷是環(huán)境中較受重視的污染物，自從孟加拉國(guó)由于地下水砷污染導(dǎo)致大量人群砷中毒以后，砷污染的研究得到國(guó)際學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。許多研究認(rèn)為食物鏈傳遞是人體暴露于砷的主要途徑之一。對(duì)于東南亞地區(qū)以稻米為主食的國(guó)家，水稻對(duì)砷的吸收積累是一個(gè)關(guān)系到人體健康的重要環(huán)境問(wèn)題。在我國(guó)由于礦業(yè)活動(dòng)和自然因素(地下水污染)也導(dǎo)致大面積的土壤砷污染，對(duì)當(dāng)?shù)啬酥羺^(qū)域的食品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。
土壤中許多微生物通過(guò)代謝作用溶解賦存于礦物中的不可利用性形態(tài)的重金屬元素(Francis and Dodge，1988；Cantafio et al.，1996；Kalinowski et al.，2000)，從而對(duì)重金屬在土壤中的遷移發(fā)揮著重要作用(Gadd，1990；Idris etal.，2004)。As在自然環(huán)境中通常主要以砷酸鹽[As(V)]和亞砷酸鹽[As(III)]形式存在，在氧化環(huán)境中，As以As(V)為主；在還原環(huán)境中，As以As(III)為主(Keon et al.，2001)。一些微生物菌株能使用As作為電子受體或供體，從而氧化或還原As，改變As污染介質(zhì)中As的價(jià)態(tài)，如氧化As(III)(Thermusaquuaticus，T.thermophilus)(Gihring et al.，2001)、(Thiobacillus sp.S1、Ancylobacter sp.OL1)(Rhine et al.，2005)，即把As(III)轉(zhuǎn)變?yōu)锳s(V)，As(V)的毒性較As(III)低。土壤中存在的砷化合物種類較多，但主要以陰離子基團(tuán)的方式賦存于礦物中，且主要賦存于Fe、Al等礦物中(Wenzel et al.，2001)。而As污染土壤中通常生物可利用性的As含量并不高，在使用超富集As植物原位修復(fù)As污染土壤時(shí)，限制了超富集植物吸收土壤中As的效率(Meharg andHartley-Whitaker，2002)。因而，有必要尋找恰當(dāng)?shù)?、環(huán)境友好的技術(shù)手段改變植物修復(fù)As污染土壤時(shí)的吸收效率。
有報(bào)道稱植物生長(zhǎng)促生菌株能在根際營(yíng)養(yǎng)不平衡的條件下有助于植物獲得關(guān)鍵性元素(Egamberdiyeva and Hflich，2004；Belimov et al.，2005)，并能顯著促進(jìn)植物在Ni、Pb、Zn、Cd、Cu等重金屬污染土壤中生長(zhǎng)(Burd et al.，1998，2000；Grichko et al.，2000；Nies et al.，2002；Vivas et al.，2006)，但這些研究中使用的菌株通常是從能耐受重金屬的濃度進(jìn)行篩選，很難兼顧篩選出的菌株是否一定能促進(jìn)植物吸收更多的重金屬。此外，這方面的工作中涉及As的研究還幾乎沒(méi)有。
已有的研究表明，土壤中微生物能影響植物形態(tài)、生理和營(yíng)養(yǎng)(Rovira，1965)，并認(rèn)為產(chǎn)吲哚乙酸(indole acetic acid，1AA)等生長(zhǎng)素是微生物利于植物生長(zhǎng)的重要原因之一(Brows，1972)。因此，在As脅迫環(huán)境下，篩選能產(chǎn)IAA的菌株可能會(huì)利于植物生長(zhǎng)。
從以上資料可以看出目前，在篩選應(yīng)用于重金屬污染土壤植物修復(fù)的微生物菌株時(shí)，常常是從菌株耐受重金屬濃度的角度進(jìn)行篩選，該方法很難兼顧菌株是否能有利于植物在重金屬污染環(huán)境中生長(zhǎng)的特性、是否能促進(jìn)植物吸收更高含量的重金屬及修復(fù)效率，更沒(méi)有一種適合用于植物修復(fù)As污染土壤的微生物菌株篩選方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)目前菌株篩選中存在的問(wèn)題，提出一種用于As污染土壤生物修復(fù)的微生物菌株的篩選方法，該方法可以篩選出有利于植物生長(zhǎng)，也能促進(jìn)植物高效地吸收更多的As，提供植物修復(fù)As污染土壤的效率。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案為一種用于As污染土壤生物修復(fù)的微生物菌株的篩選方法，篩選步驟為混勻的植物根際土直接接入滅菌的、含As的細(xì)菌和真菌液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基在28℃、120r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)一周，每周轉(zhuǎn)接一次，以新鮮液體培養(yǎng)基體積的1％的接種量接入新鮮培養(yǎng)基中，如此重復(fù)五次；然后，用梯度稀釋法篩選菌株，其中在固體培養(yǎng)基上，細(xì)菌采用劃線分離法分離，真菌采用點(diǎn)狀法分離，得到純的細(xì)菌和真菌單菌落；上述細(xì)菌液體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，用NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0-7.2的范圍；真菌液體培養(yǎng)基為馬丁氏培養(yǎng)基，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至約6.5；上述兩種液體培養(yǎng)基中還添加有Na2HAsO4，使得兩種培養(yǎng)基的As濃度范圍為50-1000mg/kg，篩選出耐As程度不同的菌株；向液體培養(yǎng)基中加入2.0％瓊脂即可獲得相應(yīng)固體培養(yǎng)基；該步驟將篩選出多種、耐As程度不同的細(xì)菌和真菌菌株。將上步所得單菌落分別接種于不含Na2HAsO4的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和液體馬丁氏培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，再將上述兩種培養(yǎng)液分別在4℃下用離心機(jī)以8000r/min離心后，傾去上清液，無(wú)菌蒸餾水洗滌沉淀物，均以光吸收值OD600＝0.5為基準(zhǔn)，用無(wú)菌水制成細(xì)菌和真菌的菌懸液；接種菌懸液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(不加As)中，再加入γ-射線滅菌過(guò)的含As土壤5g，培養(yǎng)10d后，把溶液倒入燒杯中，測(cè)定培養(yǎng)液pH，再用蒸餾水洗滌三角瓶中殘留物于燒杯中，60℃烘干至衡重，稱取1g殘留物通過(guò)逐級(jí)提取法進(jìn)行As形態(tài)的分析，篩選出能改變土壤中As形態(tài)的細(xì)菌和真菌菌株；該步驟簡(jiǎn)單易行地從篩選出的菌株中進(jìn)一步篩選出能顯著影響土壤中As與礦物結(jié)合方式的細(xì)菌和真菌菌株，并能理解菌株作用于土壤中何種As結(jié)構(gòu)。將上步篩選出的細(xì)菌、真菌菌株分別接種于不含Na2HAsO4·7H2O的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和液體馬丁氏培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，將上述兩種培養(yǎng)液分別用離心機(jī)在8000r/min下離心，離心后所得沉淀物中直接加入3mL pH＝7.5磷酸鹽緩沖液(含質(zhì)量濃度1％的葡萄糖)中，再加入2mL質(zhì)量濃度1％的L-色氨酸后，在37℃下培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，加入2mL質(zhì)量濃度5％三氯乙酸和1mL 0.5M CaCl2，過(guò)濾，移出3mL濾液于測(cè)定管中，向管中加入2mL Salper溶液后在25℃的黑暗條件下培養(yǎng)30min，培養(yǎng)結(jié)束后用722型分光光度計(jì)波長(zhǎng)535nm下測(cè)定吲哚乙酸含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線使用吲哚乙酸0-20mg/L的范圍，測(cè)定菌株產(chǎn)IAA的量，從而篩選出利于植物生長(zhǎng)的菌株、真菌菌株；從該步篩選的菌株中能挑選出兼顧改變土壤中生物可利用態(tài)As含量的菌株，又能兼顧As脅迫環(huán)境下會(huì)利于植株生長(zhǎng)。將上步篩選出的菌株、真菌各一株進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，驗(yàn)證各菌株對(duì)植物修復(fù)自然As污染土壤時(shí)植物吸收As含量和效率的影響。該步篩選出的菌株即可用于實(shí)際As污染土壤的生物修復(fù)中。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，篩選出的菌株能改變土壤中As與礦物結(jié)合方式，使得土壤中As的遷移性增強(qiáng)，并通過(guò)產(chǎn)生IAA促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物對(duì)As的吸收。本發(fā)明的目的是篩選出的菌株用于植物修復(fù)As污染土壤時(shí)，能有利于植物生長(zhǎng)，更能促進(jìn)植物高效地吸收更多的As，提高植物修復(fù)As污染土壤的效率。
四

圖1為篩選菌株的技術(shù)路線圖；圖2、3為接種菌株對(duì)土壤中As形態(tài)的改變，不同字母表示不同接種處理土壤中As形態(tài)差異達(dá)到5％顯著水平；非專性吸附態(tài)的As代表著土壤中最能被生物利用、最具環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的As形態(tài)，且也代表著土壤溶液中含有的As，在土壤中該形態(tài)的As含量通常較低(Wenzel et al.，2001，2002)，如圖2所示，接種細(xì)菌B1、B2、B3和接種真F1、F2、F3均顯著促進(jìn)土壤中非專性吸附態(tài)As含量的升高(p＜0.05)，B1、B2、B3處理分別是CK的3.2、4.5、3.4倍，F(xiàn)1、F2、F3處理分別是CK的4.4、4.7、3.7倍，即接種菌株提高了土壤中生物可利用性As含量。專性吸附態(tài)As含量與非專性吸附態(tài)As的變化趨勢(shì)一致，接種處理均顯著促進(jìn)非專性吸附態(tài)As含量的升高(p＜0.05)(圖3)，與CK相比，B1、B2、B3分別提高土壤中該形態(tài)的As含量47％、48％、31％，F(xiàn)1、F2、F3則分別為26％、36％、18％。
圖4為不同菌株代謝產(chǎn)生的IAA含量；不同字母表示不同菌株產(chǎn)生IAA含量差異達(dá)到5％顯著水平；B1、B2、F1、F2產(chǎn)生的IAA含量見(jiàn)圖6，B2處理產(chǎn)生的IAA含量顯著最高，是B1處理的3.6倍；而F1處理產(chǎn)生的IAA含量同樣顯著高于F2處理?？梢?jiàn)，通過(guò)L-色氨酸誘導(dǎo)，篩選出的兩株細(xì)菌、兩株真菌都能產(chǎn)生IAA。Brows(1972)研究認(rèn)為根際微生物會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)的物質(zhì)，如IAA、赤霉酸等，并認(rèn)為植物有不同的根和地上部形態(tài)可能與植物根際微生物代謝的IAA有關(guān)。如把這些菌株接種到植株根際，將有利于植物在高As污染土壤這種脅迫環(huán)境中生長(zhǎng)，因此本研究中這些菌株應(yīng)該屬于根際促生微生物菌株。
如圖5所示，不同字母表示不同接種處理蜈蚣草生物量差異達(dá)到5％顯著水平；接種菌劑均不同程度地促進(jìn)蜈蚣草地上部和地下部生物量的增加。與對(duì)照相比，接種F2處理的蜈蚣草地下部和地上部生物量顯著高于對(duì)照，菌株B1對(duì)蜈蚣草地上部和地下部生物量均有促進(jìn)作用，但不顯著(p＜0.05)?？梢?jiàn)，接種B1和F2對(duì)蜈蚣草修復(fù)As污染土壤時(shí)有利于植株生長(zhǎng)。
圖6為接種B1、F2對(duì)蜈蚣草吸收As濃度的影響，不同字母表示不同接種處理蜈蚣草As濃度差異達(dá)到5％顯著水平；與對(duì)照相比，接種處理的蜈蚣草地上部和地下部As濃度均高于對(duì)照，尤其是對(duì)蜈蚣草地上部As濃度的促進(jìn)作用更顯著(p＜0.05)，B1、F2處理的地上部As濃度分別是對(duì)照的2.3、1.9倍。
圖7為接種B1、F2對(duì)蜈蚣草吸收As含量的影響，不同字母表示不同接種處理蜈蚣草As含量差異達(dá)到5％顯著水平；與對(duì)照相比，接種B1、F2均顯著促進(jìn)了地上部和地下部吸收的As含量(p＜0.05)，尤其是地上部As含量B1、F2處理分別是對(duì)照的2.5、2.7倍。蜈蚣草是超富集As植物，超量吸收的As主要轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部，而對(duì)As或其它重金屬污染土壤植物修復(fù)時(shí)，最希望的就是通過(guò)植物把土壤中的污染物轉(zhuǎn)運(yùn)到植株地上部，然后收割地上部以便于移除土壤中的污染物濃度。本研究中篩選的菌株B1、F2均促進(jìn)蜈蚣草地上部吸收的As含量的增加，尤其在高濃度As污染土壤中，接種菌株對(duì)蜈蚣草地上部吸收As的促進(jìn)作用更顯著。
由以上七幅附圖可以看出(1)單接B1、B2、B3、F1、F2、F3于含As土壤中，均顯著促進(jìn)土壤中非專性和專性吸附態(tài)As含量的升高，提高了土壤中As的生物可利用性。
(2)篩選出的三株細(xì)菌、三株真菌都能產(chǎn)生IAA。
(3)篩選的菌株B1、F2均顯著促進(jìn)蜈蚣草地下部和地上部吸收As含量的增加，接種菌株對(duì)蜈蚣草地上部吸收As的促進(jìn)作用更顯著，B1、F2處理分別是對(duì)照的2.5、2.7倍。
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.1供試土壤分離菌株的土壤取自湖南省石門縣As礦區(qū)附近的菜地中，土壤類型為黃壤，土壤理化性質(zhì)為pH 4.20(水土比，2.5∶1)，總As 412mg/kg，總P 0.45％，Al 7.8％，F(xiàn)e 4.65％。
自然風(fēng)干后的土壤研磨過(guò)100目尼龍篩，采用60Co滅菌，滅菌劑量率為1.138kGy/h，間歇滅菌兩次，總劑量為25kGy。滅菌后的土壤保存在-80℃冰箱中。
1.2供試菌株細(xì)菌和真菌的篩選和分離過(guò)程如下5g混勻的根際土直接接入121℃濕熱滅菌的100mL含500mg/kg As的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基中，28℃、120r/min搖床培養(yǎng)一周。以后每周轉(zhuǎn)接一次，以新鮮液體培養(yǎng)基體積的1％的接種量接入新鮮培養(yǎng)基中，如此重復(fù)五次，梯度稀釋法篩選菌株，細(xì)菌采用劃線分離法分離，真菌采用點(diǎn)狀法分離，得到純的單菌落。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細(xì)菌)牛肉膏3g/L、蛋白胨5g/L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2的范圍(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所微生物室編著，1985)。馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基(真菌)MgSO4·7H2O0.5g/L、KH2PO41.0g/L、葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5(中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所微生物室編著，1985)。上述兩種培養(yǎng)基中分別添加Na2HAsO4，使得培養(yǎng)基中含As濃度為500mg/kg。向液體培養(yǎng)基中加入2.0％瓊脂即可得相應(yīng)固體培養(yǎng)基。
1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)設(shè)置處理如下B1、F1以及1個(gè)不接種的對(duì)照(CK)，總計(jì)3個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，總計(jì)9瓶。分別接種配置好的菌懸液2mL于裝有50mL牛肉膏蛋白棟培養(yǎng)基(不加Na2HAsO4)的三角瓶中，在不接種的對(duì)照處理(CK)中同樣加入2mL無(wú)菌水，以確保培養(yǎng)溶液體積一致。接種完畢后，稱取5g60Co-γ射線滅菌后的土壤于上述培養(yǎng)液中，培養(yǎng)10天后，把溶液倒入燒杯中，測(cè)定pH，蒸餾水洗滌三角瓶中殘留物于燒杯中，60℃烘干至衡重，稱取1g土壤樣品進(jìn)行As形態(tài)的分析。
1.4測(cè)試項(xiàng)目土壤中As形態(tài)采用改進(jìn)的逐級(jí)提取法(Wenzel et al.，2001)①Ass，非專性吸附態(tài)，0.05mol/L(NH4)2SO4，20℃/4h；②Asp，專性吸附態(tài)，0.05mol/LNH4H2PO4，20℃/16h；③Aso，非晶態(tài)的水合Fe、Al氧化物態(tài)，0.2mol/L(NH4)2C2O4，pH 3.25，20℃/4h(黑暗條件下)；④Asc，晶態(tài)的水合Fe、Al氧化物態(tài)，0.2mol/L(NH4)2C2O4+抗壞血酸，pH 3.25，96℃/0.5h(伴有光照)。
吲哚乙酸(IAA)的測(cè)定(Vivas et al.，2006)把培養(yǎng)24h的細(xì)菌、真菌菌液在8000r/min下離心8min。直接加入3mL pH＝7.5的磷酸鹽緩沖液(含1％的葡萄糖)、2mL1％L-色氨酸溶液于離心后的菌體中，在37℃下培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入2mL5％三氯乙酸和1mL0.5MCaCl2，過(guò)濾，移出3mL濾液于測(cè)定管中，加入2mLSalper溶液(配方2mL0.5MFeCl3和98mL35％高氯酸混合)。該溶液在25℃的黑暗條件下培養(yǎng)30min，培養(yǎng)結(jié)束后在535nm下用722型分光光度計(jì)測(cè)定。
土壤樣品的理化性質(zhì)pH以土∶水(無(wú)CO2)＝1∶2.5法測(cè)定(魯如坤，2002)。用HNO3-HF-HClO4消化后，ICP-MS測(cè)定總P。采用1∶1王水消化后的溶液樣品與As形態(tài)分析樣品都采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HG-AFS)測(cè)定As。選用中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院地球物理化學(xué)勘探研究所的土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品(GBW07406)控制分析的準(zhǔn)確性，P、As的回收率均控制在誤差范圍內(nèi)。
1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS10.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Duncan多重比較各處理之間的差異顯著性。
實(shí)施例22.1供試土壤分離菌株的土壤取自湖南省慈利縣As礦區(qū)附近的土丘上，土壤類型為石灰(巖)土，土壤理化性質(zhì)為pH 5.97(水土比，2.5∶1)，總As 514mg/kg，總P618mg/kg，Al 3.18％，F(xiàn)e 2.77％。
2.2試驗(yàn)菌株供試菌株分離的方法為先從土壤中篩選能產(chǎn)生IAA的菌株，再?gòu)倪@些菌株中篩選能夠改變土壤中As形態(tài)的菌株，具體實(shí)施步驟同1.2中。
2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同1.3。
篩選菌株對(duì)土壤As形態(tài)影響實(shí)驗(yàn)中，選用的土壤以實(shí)施例1中60Co滅菌土壤為供試土壤。
2.4測(cè)試項(xiàng)目同1.4。
2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)同1.5。
實(shí)施例33.1供試土壤分離菌株的土壤取自湖南省桂陽(yáng)縣土法煉As廠區(qū)附近的土丘上，土壤類型為赤紅壤，土壤理化性質(zhì)為pH 3.91(水土比，2.5∶1)；總As 373mg/kg；總P225mg/kg，Al 2.64％，F(xiàn)e 1.76％。
3.2供試菌株供試菌株分離的方法為從土壤中篩選能產(chǎn)生IAA的菌株、并能夠改變土壤中As形態(tài)的菌株，具體實(shí)施步驟同1.2，從中挑選出效果最佳的菌株。
上述分離菌株經(jīng)初步鑒定，實(shí)例1、2篩選的細(xì)菌均為短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、實(shí)例3篩選的細(xì)菌為芽孢桿菌屬(Bacillus)(東秀珠等，2001)，以下簡(jiǎn)稱為B1、B2、B3；實(shí)例1、2、3篩選的真菌分別為(康氏)木霉屬(Trichoderma)、鐮孢霉屬(Fusarium)、單囊白粉菌屬(Sphaerotheca)(魏景超，1979)，以下簡(jiǎn)稱為F1、F2、F3。
3.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)同1.3。
篩選菌株對(duì)土壤As形態(tài)影響實(shí)驗(yàn)中，選用的土壤也以實(shí)施例1中60Co滅菌土壤為供試土壤。
3.4測(cè)試項(xiàng)目同1.4。
3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)同1.5。
實(shí)施例4篩選的B1、F2菌株對(duì)蜈蚣草吸收As含量的效果4.1材料與方法4.1.1供試植物蜈蚣草(Pteris vittata L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，先把孢子播種于濕熱滅菌后的濕潤(rùn)土壤中，待長(zhǎng)出約2cm時(shí)移植到同樣滅菌后的濕潤(rùn)土壤中。蜈蚣草苗長(zhǎng)到約5cm高時(shí)即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
4.1.2供試土壤供試的土壤分別采自湖南省石門縣As采礦區(qū)山腳處。采集土壤時(shí)剔除表層植物凋落物，取表層0～20cm土壤，多點(diǎn)采集混勻。自然風(fēng)干，過(guò)2mm尼龍篩。
表1供試土壤基本性質(zhì)

土壤的基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1礦區(qū)山腳處農(nóng)田土壤已受As污染較嚴(yán)重，是國(guó)家土壤環(huán)境3級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(40mg/kg-1)4.63倍，而這些土壤現(xiàn)正在耕種中，可見(jiàn)，該區(qū)內(nèi)土壤中種植的農(nóng)產(chǎn)品將可能會(huì)對(duì)區(qū)內(nèi)居民構(gòu)成健康威脅。
4.1.3供試菌劑本試驗(yàn)僅選用B1、F2兩種菌株。接種菌劑制備方法接種B1、F1分別于上述牛肉膏蛋白棟培培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基(不加Na2HAsO4·7H2O)，培養(yǎng)3d后，在4℃下8000r/min離心菌株，傾去上清夜，用無(wú)菌蒸餾水洗滌菌株三次后，均以光吸收值OD600＝0.5為基準(zhǔn)，用無(wú)菌水制成菌懸液。
4.1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)以盆栽的方式進(jìn)行，土壤不滅菌，設(shè)定處理為接種B1、F2以及1個(gè)不接種的對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，共3個(gè)處理，總計(jì)9盆。試驗(yàn)采用1.5L塑料盆，每盆裝土1kg，接種菌懸液20mL，CK處理澆20mL蒸餾水，與土壤混勻。每盆播種移蜈蚣草苗3棵。所有盆隨機(jī)排列于中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所日光溫室中，澆蒸餾水，維持土壤最大持水量的80％。
蜈蚣草生長(zhǎng)14周后收獲，地上部和地下部分別于60℃烘干至恒重后分別稱取干重。根際土壤混合后，每盆取100g土樣，自然風(fēng)干后研磨過(guò)100目尼龍篩，樣品保存供測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。
4.1.5植物樣品測(cè)定植物樣品用HNO3∶HCl＝3∶1進(jìn)行消化后的樣品，采用氫化物發(fā)生器-原子熒光光譜法(HG-AFS)測(cè)定As。植物樣品采用濃HNO3和HClO4消化后，電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測(cè)定P。選用中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院地球物理化學(xué)勘探研究所的植物標(biāo)準(zhǔn)樣品(GBW07603)控制分析的準(zhǔn)確性，各元素測(cè)值均在準(zhǔn)確范圍內(nèi)。
4.1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS10.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，Duncan多重比較各處理之間的差異顯著性。
權(quán)利要求
1.一種用于As污染土壤修復(fù)的微生物菌株的篩選方法，其特征在于篩選步驟為a.將混勻的植物根際新鮮土直接接入滅菌的含As的細(xì)菌和真菌液體培養(yǎng)基中，其中，細(xì)菌液體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，用NaOH溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0-7.2的范圍，真菌液體培養(yǎng)基為馬丁氏培養(yǎng)基，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至約6.5，兩種液體培養(yǎng)基中添加有Na2HAsO4，使得兩種培養(yǎng)基的As濃度為50-1000mg/kg，兩種培養(yǎng)基在28℃、120r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)一周，每周轉(zhuǎn)接一次，每次轉(zhuǎn)接時(shí)以新鮮液體培養(yǎng)基體積的1～5％的接種量接入新鮮培養(yǎng)基中，如此重復(fù)三～五次；然后，用梯度稀釋法分離菌株得到純的細(xì)菌和真菌單菌落；b.將上步所得單菌落分別接種于不含Na2HAsO4的液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和液體馬丁氏培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，將兩種培養(yǎng)液分別在4℃下離心后，傾去上清液，用無(wú)菌蒸餾水洗滌沉淀物，再用無(wú)菌水制成細(xì)菌和真菌的菌懸液；c.接種上述菌懸液于不含Na2HAsO4的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，再加入γ-射線滅菌As污染土壤，培養(yǎng)結(jié)束后，把溶液倒入燒杯中，用水洗滌三角瓶中殘留物于燒杯中，烘干至衡重，通過(guò)逐級(jí)提取法對(duì)殘留物進(jìn)行As形態(tài)的分析，從而篩選出能改變土壤中As形態(tài)的細(xì)菌和真菌菌株；d.將上步篩選出的細(xì)菌、真菌菌株分別接種于不含Na2HAsO4的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和馬丁氏液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，將上述兩種培養(yǎng)液分別離心，離心后所得沉淀物中直接加入3mL pH＝7.5含質(zhì)量濃度1％的葡萄糖的磷酸鹽緩沖液中，再加入2mL質(zhì)量濃度1％的L-色氨酸后，在37℃下培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后，加入2mL質(zhì)量濃度5％三氯乙酸和1mL 0.5mol/LCaCl2，過(guò)濾，移出3mL濾液于測(cè)定管中，向管中加入2mL Salper溶液后在25℃的黑暗條件下培養(yǎng)30min，培養(yǎng)結(jié)束后在用722型分光光度計(jì)波長(zhǎng)535nm下測(cè)定吲哚乙酸含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線使用吲哚乙酸0-20mg/L的范圍，測(cè)定菌株產(chǎn)IAA的能力，從而篩選出利于植物生長(zhǎng)的細(xì)菌菌株、真菌菌株。
全文摘要
一種用于As污染農(nóng)田土壤植物修復(fù)的微生物菌株的篩選方法。從As污染土壤中先篩選能耐As的菌株，通過(guò)逐級(jí)提取方法分析這些菌株是否能改變?chǔ)茫渚€滅菌的As污染土壤中的As形態(tài)、以及是否產(chǎn)生能促進(jìn)植物生長(zhǎng)的吲哚乙酸(IAA)，從而篩選出能夠改變土壤中生物可利用態(tài)As含量的菌株，并通過(guò)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證通過(guò)此方法篩選菌株能利于植物生長(zhǎng)和增加植物吸收的As量和效率。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便，操作環(huán)境友好，且用于植物修復(fù)時(shí)不會(huì)帶來(lái)二次污染，處理成本降低，而植物修復(fù)As污染土壤的效率提高。
文檔編號(hào)B09C1/10GK101067115SQ200710023489
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日
發(fā)明者白建峰, 林先貴, 尹睿, 王一明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所