專利名稱：一種區(qū)分土壤N₂O微生物排放源的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及土壤微生物分子生態(tài)學(xué)，具體的說是一種區(qū)分土壤N2O微生物排放源的方法。
背景技術(shù)：
氧化亞氮(N2O)是重要的三大溫室氣體之一，它的增溫潛勢是CO2的298倍(百年時間尺度上)，而且還參與了臭氧層的破壞。土壤被認(rèn)為是陸地生態(tài)過程中的主要N2O排放來源，土壤排放N2O過程的區(qū)分一直以來是一個棘手的難題。土壤中產(chǎn)生N2O的過程較多，主要涉及到硝化、反硝化、硝化細(xì)菌的反硝化作用等，而且這些過程在土壤中可能同時發(fā)生。另夕卜，土壤產(chǎn)生N2O的過程受到許多因子的影響，如溫度、水分含量、pH、可利用氮等，這些因子之間的相互作用、相互影響，使得土壤產(chǎn)生隊(duì)0的過程變得更為復(fù)雜。事實(shí)上所檢測到的土 壤排放的N2O是這些因子共同作用的結(jié)果。因此，準(zhǔn)確地區(qū)分土壤的N2O排放源是有針對性地制定合理的土壤N2O減排措施的前提與依據(jù)。前期的研究多采用C2H2對土壤中硝化過程或反硝化過程進(jìn)行抑制，測定土壤排放的N2O,可以估計(jì)硝化過程、反硝化過程對土壤排放N2O的相對貢獻(xiàn)。由于在培養(yǎng)過程中土壤微生物對C2H2的分解會導(dǎo)致C2H2濃度不斷下降，以至于不能完全抑制土壤的硝化作用，使實(shí)驗(yàn)的結(jié)果造成偏差。近年來，穩(wěn)定同位素技術(shù)已被證明是研究土壤N2O排放的不同微生物過程相對貢獻(xiàn)的有力工具。細(xì)菌的純培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示硝化細(xì)菌的硝化作用比反硝化細(xì)菌的反硝化作用對15N的同位素分餾作用大。這就意味著，假如當(dāng)?shù)孜锏耐凰刂迪嗤瑫r，硝化作用比反硝化作用產(chǎn)生的N2O的S 15N更偏向負(fù)值?；诖?，有些學(xué)者研究了不同時期土壤排放N2O過程的轉(zhuǎn)變。另外，有些研究對NH4+或N03_底物進(jìn)行了 15N或18O的同位素標(biāo)記，并施加到土壤中進(jìn)行培養(yǎng)，測定被標(biāo)記的N2O的排放，進(jìn)而判斷N2O的產(chǎn)生過程及其這些過程的相對貢獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種區(qū)分農(nóng)田土壤N2O排放源的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為一種區(qū)分土壤N2O微生物排放源的方法，將待分析土壤處理后測定其所排放N2O的同位素S 15N值以及土壤產(chǎn)生隊(duì)0過程中相關(guān)微生物基因的拷貝數(shù)，基因豐度與S 15N-N2O的豐度值間相關(guān)性檢驗(yàn)P〈0. 05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。所述土壤為農(nóng)田土壤、森林土壤和草地土壤。所述待分析土壤在不含N2O的人造空氣中培養(yǎng)。所述待分析土壤在不含N2O的人造空氣中以25 28°C條件下，培養(yǎng)l_45h。將待分析土壤處理后，采用穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀測定其排放的N2O的同位素，以熒光定量PCR測定土壤產(chǎn)生N2O過程中相關(guān)微生物基因的拷貝數(shù)，基因豐度與8 15N-N2O的豐度值間相關(guān)性檢驗(yàn)P〈0. 05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明提出了一種能夠精確區(qū)分土壤中產(chǎn)生N2O的主要微生物群體的技術(shù)，即應(yīng)用穩(wěn)定同位素測定法結(jié)合土壤微生物分子生態(tài)學(xué)手段分析土壤N2O排放的同位素特征值與土壤功能微生物群體數(shù)量的相關(guān)關(guān)系，從而尋找對土壤排放N2O貢獻(xiàn)較大的特定微生物群體。2.本發(fā)明采用土壤芯作為實(shí)驗(yàn)材料，減少了對土壤原來狀態(tài)的擾動，也不需添加同位素標(biāo)記物而擾動了土壤原有的狀態(tài)，因此對土壤的N2O產(chǎn)生過程影響極小。3.由于土壤中不同的微生物組成對N2O產(chǎn)生的同位素分餾效應(yīng)不同，所以可從微生物組成變化，結(jié)合N2O的同位素分餾效應(yīng)，來分析土壤產(chǎn)生N2O的過程或與N2O產(chǎn)生過程相關(guān)的微生物群體。
4.本發(fā)明使用不含N2O的人造空氣作為培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的背景氣體，避免了空氣中高濃度的N2O對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。


圖I為本發(fā)明土壤培養(yǎng)方法的示意圖(其中，I鋼瓶；2空氣減壓閥；3三通閥；4軟膠管；5空氣泵；6膠塞；7玻璃瓶；8 土芯)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明對土壤排放N2O主要過程的微生物功能群體進(jìn)行精確區(qū)分，可能為硝化過程的氨氧化細(xì)菌或氨氧化古菌，可能為反硝化過程的nirK型反硝化菌或nirS型反硝化菌等。土壤可以是玉米、大豆、高粱等作物的田間土壤。在作物的重要發(fā)育期采集作物田間土壤，如苗期、分枝(拔節(jié))期、開(揚(yáng))花期、結(jié)莢鼓粒(灌漿)期、成熟期等。對土壤樣品進(jìn)行瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)裝置如圖I所不，培養(yǎng)瓶7為體積為6. OL的玻璃瓶,8為用環(huán)刀米取的表層(TlOcm的土芯，用帶有導(dǎo)管4的軟膠塞6密封培養(yǎng)瓶。用真空泵5對瓶進(jìn)行抽真空，然后用鋼瓶I中不含N2O的人造空氣沖洗培養(yǎng)瓶，這一過程可以用空氣減壓閥2及三通3實(shí)現(xiàn)，直至瓶中的氣體中不含有N2O為止，然后將瓶置于室內(nèi)，25 28°C條件下，培養(yǎng)l_45h。培養(yǎng)結(jié)束后，用穩(wěn)定同位素比例質(zhì)譜儀測定瓶中土壤排放N2O的8 15N值，用實(shí)時熒光定量PCR檢測土壤中與N2O產(chǎn)生相關(guān)的功能基因豐度。這些基因主要為具有硝化或反硝化作用的細(xì)菌、古菌的功能基因，如硝化過程中氨氧化細(xì)菌、氨氧化古菌的編碼單氨加氧
酶的基因-amoA、反硝化細(xì)菌的編碼亞硝酸還原酶的基因-nirK和nirS等。不同功
能微生物群體對產(chǎn)生N2O過程中15N的分餾作用存在差異，因此通過分析功能微生物群體豐度與8 15N-N2O值的相關(guān)性，可以判斷出哪種微生物群體對土壤排放N2O起重要作用。實(shí)施例本次試驗(yàn)在遼寧省沈陽市蘇家屯區(qū)十里河鎮(zhèn)進(jìn)行，土壤為棕壤土，種植作物為大豆。N肥為尿素，種植時一次性施肥，施肥量為60kg N/ha。在整個大豆生長季的六個發(fā)育時期進(jìn)行了土壤樣品的采集，分別為種植后第19、35、52、66、99、115天，此時對應(yīng)的大豆的發(fā)育期為發(fā)芽出苗期、苗期、分枝期、開花期、鼓粒期、成熟期。每次采樣時間為上午9:00—11:00。具體采取方法為用木塊墊在環(huán)刀之上，用錘子將環(huán)刀敲進(jìn)土中直至環(huán)刀上沿與土壤齊平，后用鐵鍬將環(huán)刀從土壤中小心挖出，用一鐵片將環(huán)刀下沿的土壤切平，用一層薄塑料袋將環(huán)刀的下沿包裹住，再用橡皮套扎緊，以防土壤從環(huán)刀中漏出，立即拿回實(shí)驗(yàn)室待用于土壤的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將采集來的18個環(huán)刀土芯，6個一組分為3組并稱重(約2Kg 土)，然后分裝于3個6L的玻璃試劑瓶中。用帶有進(jìn)氣-出氣孔的橡膠塞塞緊瓶子，瓶塞的進(jìn)氣口、出氣口分別通過三通閥連接鋼瓶(內(nèi)含去除了 N2O的人造空氣)和真空泵，通過三次真空泵抽真空一鋼瓶充氣的循環(huán)過程后，經(jīng)氣相色譜檢測瓶中的氣體均為不含N2O的空氣(實(shí)驗(yàn)裝置見圖I)。將氣體置換過的培養(yǎng)瓶放于實(shí)驗(yàn)桌上，室內(nèi)環(huán)境下，平均溫度為25-28°C，放置約40h。用注射器抽取培養(yǎng)瓶中的氣體，注入預(yù)先抽真空的氣體采樣袋中。氣體樣品中的N2O濃度用配有電子捕獲檢測器(ECD)的氣相色譜儀測定。氣體樣品中N2O的同位素S15N值用穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀測定(參見表I)。提取土壤樣品的總DNA，運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR儀測定土壤中總細(xì)菌的16SrDNA、氨氧化細(xì)菌的單氨加氧酶基因amoA、氨氧化古菌的單氨加氧酶基因amoA、反硝化細(xì)菌的銅 離子型(Cu2+)亞硝酸還原酶基因nirK和反硝化菌的細(xì)胞色素型(cdl)亞硝酸還原酶基因nirS的拷貝數(shù)(參見表I)。統(tǒng)計(jì)分析表明，土壤排放N2O的同位素S 15N值與土壤中氨氧化細(xì)菌的豐度存在顯著相關(guān)性(r=0.80，p〈0.01)(表I )，而與其它菌群的豐度相關(guān)性不顯著，表明氨氧化細(xì)菌是本試驗(yàn)土壤中與N2O產(chǎn)生主要相關(guān)的微生物群體。表I 土壤排放N2O的同位素S 15N值與土壤中N2O相關(guān)微生物基因豐度
權(quán)利要求
1.ー種區(qū)分土壤N2O微生物排放源的方法，其特征在于將待分析土壤處理后測定其所排放N2O的同位素S 15N值以及土壤產(chǎn)生N2O過程中相關(guān)微生物基因的拷貝數(shù)，基因豐度與S 15N-N2O的豐度值間相關(guān)性檢驗(yàn)p〈0. 05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。
2.按權(quán)利要求I所述的區(qū)分土壤隊(duì)0微生物排放 源的方法，其特征在于所述土壤為農(nóng)田土壌、森林土壤和草地土壌。
3.按權(quán)利要求I所述的區(qū)分土壤隊(duì)0微生物排放源的方法，其特征在于所述待分析土壤在不含N2O的人造空氣中培養(yǎng)。
4.按權(quán)利要求I所述的區(qū)分農(nóng)田土壤隊(duì)0排放源的方法，其特征在于所述待分析土壌在不含N2O的人造空氣中以25 28°C條件下，培養(yǎng)l_45h。
5.按權(quán)利要求I所述的區(qū)分土壤N2O排放源的方法，其特征在于將待分析土壤處理后，采用穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀測定其排放的N2O的同位素，以熒光定量PCR測定土壤產(chǎn)生N2O過程中相關(guān)微生物基因的拷貝數(shù)，基因豐度與8 15N-N2O的豐度值間相關(guān)性檢驗(yàn)p〈0. 05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。
全文摘要
本發(fā)明涉及土壤微生物分子生態(tài)學(xué)，具體的說是一種區(qū)分土壤N2O排放源的方法。將待分析土壤處理后測定其所排放N2O的同位素δ15N值以及土壤產(chǎn)生N2O過程中相關(guān)微生物基因的拷貝數(shù)，基因豐度與δ15N-N2O的豐度值間相關(guān)性檢驗(yàn)p<0.05的功能微生物群體，即為對土壤N2O排放起重要作用的微生物群體。本方法適用于區(qū)分某種土壤中排放N2O的微生物群體。
文檔編號G01N27/62GK102758017SQ20121023948
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者夏宗偉, 孔雙, 徐慧, 董丹, 陳冠雄, 韓斯琴 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所