本發(fā)明涉及用于免疫細(xì)胞培養(yǎng)的支原體檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
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背景技術(shù)：
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自20世紀(jì)80年代以來(lái)，免疫細(xì)胞療法備受關(guān)注，其系免疫療法的一個(gè)重要分支，而后者被美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院列為除手術(shù)、化療、放療以外的第四大癌癥治療模式。過(guò)繼細(xì)胞免疫療法(ACT)是從外周血中獲得淋巴細(xì)胞，在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，最后將致敏淋巴細(xì)胞回輸給腫瘤病人使其獲得抗腫瘤免疫力，以達(dá)到治療腫瘤的目的。
2010年衛(wèi)生部令79號(hào)《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》指出，對(duì)于免疫細(xì)胞治療這類方法需要有標(biāo)準(zhǔn)操作程序和產(chǎn)品的質(zhì)量控制。除細(xì)菌真菌、內(nèi)毒素外，支原體也是免疫細(xì)胞培養(yǎng)中一項(xiàng)重要的檢測(cè)指標(biāo)。支原體大小一般在0.3-0.5μm之間，感染后不易被覺(jué)察，且用常規(guī)的過(guò)濾手段無(wú)法去除。中國(guó)藥典2010版指出臨床治療用細(xì)胞進(jìn)行支原體檢查時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法(DNA染色法)，但這兩種方法操作比較繁瑣且需要較長(zhǎng)時(shí)間才能得到檢測(cè)結(jié)果。2006年歐洲藥典已將PCR作為常規(guī)檢測(cè)方法，PCR檢測(cè)方法應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增支原體基因組序列，具有靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，并且檢測(cè)周期短，當(dāng)天即可以看到檢驗(yàn)結(jié)果。因此建立一種免疫細(xì)胞培養(yǎng)體系中支原體污染的快速準(zhǔn)確PCR檢測(cè)方法，對(duì)于免疫細(xì)胞的臨床回輸顯得尤為重要。
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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于建立一種可靠穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便的利用PCR技術(shù)檢測(cè)免疫培養(yǎng)細(xì)胞中支原體污染的方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，提供一種用于免疫細(xì)胞培養(yǎng)的支原體檢測(cè)試劑盒，包括以下PCR擴(kuò)增用的引物對(duì)：
上游引物，其RNA序列如SEQ ID No.1所示，
下游引物，其RNA序列如SEQ ID No.2所示，
以及
DNase-free water，
2×Taq Master Mix。
本發(fā)明還于采用上述支原體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，檢測(cè)包括以下步驟：
a.支原體樣本收集，
b.將支原體與試劑盒中的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
c.對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳染色檢測(cè)，陽(yáng)性樣本將在270bp處出現(xiàn)特異性條帶。
支原體樣本收集的具體優(yōu)化步驟如下：
i.收取待檢樣品，取1mL至離心管，200g離心力室溫離心1min，將上層清液液轉(zhuǎn)至新管，待用，
ii.取上述上層清液作液為PCR模板，每25μL反應(yīng)體系加1μL。
PCR擴(kuò)增的具體優(yōu)化步驟如下：
i.融化2×Taq Master Mix和引物對(duì)，并放置在冰上，
ii.確定擴(kuò)增樣品的數(shù)目，其中包括陽(yáng)性、陰性對(duì)照和待檢樣品，
iii.計(jì)算PCR反應(yīng)所需各成分總含量，
iv.將PCR各反成分加到一無(wú)菌管中，振蕩混勻并置于冰上，
v.將干凈消毒的八聯(lián)管置于架上并正確標(biāo)記，
vi.將24μLPCR反應(yīng)混合液加到每一個(gè)八聯(lián)管中，并置于冰上，
vii.將每個(gè)樣品吸取1μL加到相應(yīng)的含有24μLPCR反應(yīng)混合液的管中。然后將反應(yīng)管快速離心后即可開(kāi)始PCR反應(yīng)，其中PCR反應(yīng)條件為：
預(yù)變性：94℃，2min，
循環(huán)：
94℃，30sec；
55℃，30sec，35cycles；
72℃，30sec，
延伸：72℃，10min，
保存：4℃。
電泳染色檢測(cè)的具體優(yōu)化步驟如下：
i.制膠：1.5％瓊脂糖凝膠，稱取0.375g瓊脂糖于三角燒杯中，加入25mL 1×TAE電泳緩沖液，水浴溶化瓊脂糖，稍冷后注入凝膠模中，冷卻凝固后，即可用于電泳，
ii.上樣：取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，直接點(diǎn)樣，
iii.電泳：120V電泳20分鐘，
iv.浸染：電泳結(jié)束后，將膠放置在含0.5uM Ethidium bromide的TAE染液中,室溫7-10min，
vi.于紫外光凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察、拍照。
本發(fā)明的有益效果是：從臨床實(shí)際應(yīng)用可行性出發(fā)，在考慮穩(wěn)定可靠性、便捷性、經(jīng)濟(jì)性的前提下，建立針對(duì)于臨床免疫細(xì)胞培養(yǎng)的支原體PCR檢測(cè)方法，以期為臨床回輸?shù)拿庖呒?xì)胞制劑在質(zhì)量可靠性上保駕護(hù)航。
[附圖說(shuō)明]
圖1是用本發(fā)明方法檢測(cè)不同免疫細(xì)胞培養(yǎng)樣本的瓊脂糖電泳圖，最左側(cè)泳道為DNA Marker，泳道1為陽(yáng)性對(duì)照，泳道2為陰性對(duì)照，泳道3-7為所檢測(cè)的樣品，其中泳道3、4、6、7為被支原體污染的樣品，其他樣品沒(méi)有。
[具體實(shí)施方式]
以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)于本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解實(shí)施例和附圖僅用于解釋說(shuō)明而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)驗(yàn)室設(shè)備：Bio-Rad C1000PCR儀、電泳儀及水平電泳槽、八聯(lián)管離心機(jī)(TomymicroONE)、凝膠成像系統(tǒng)
序列的引物對(duì)為：
CLS-MP5(5′-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3′)
CLS-MP3(5′-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3′)
PCR所用其他試劑：DNase-free water，2×Taq Master Mix
電泳所用試劑：瓊脂糖、溴化乙錠(ethidium bromide，EB)、TAE電泳緩沖液(迪申生物技術(shù)有限公司)
引物對(duì)是特異性擴(kuò)增支原體16s rRNA保守區(qū)域的引物對(duì)，實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)就可以覆蓋多種支原體的目的，可以覆蓋免疫細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的支原體感染種類。本PCR方法能夠檢測(cè)的支原體種類包括：Acholeplasmalaidlawii,M.arginini,Mycoplasma fermentans,M.hyorhinis,M.orale,M.pneumoniae,Mycoplasma gallisepticum,Mycoplasma synoviae and Spiroplasmacitri。以及Mycoplasma arthritidis,Mycoplasma genitalium,Mycoplasma hominis,Mycoplasma penetrans,Mycoplasma salivarium,Ureaplasmaurealyticum,Mycoplasma bovis,Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma pirum.
(1)收取5份不同的免疫細(xì)胞培養(yǎng)上清，各取1mL至離心管，200g室溫離心1min，將細(xì)胞殘骸沉淀至管底。將上清轉(zhuǎn)至新管作為PCR模板，每25μL反應(yīng)體系加1μL。
(2)融化2×Taq Master Mix，CLS-MP5，CLS-MP3primer，并放置在冰上。
(3)設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照各1份，待檢樣品5份。
(4)配制PCR反應(yīng)混合液：ddH2O 96μL，2×Taq Master Mix 80μL，CLS-MP5primer(10μM)8μL，CLS-MP3primer(10μM)8μL。將PCR各反應(yīng)成分的終體積加到一無(wú)菌管中，振蕩混勻，然后將24μL PCR反應(yīng)混合液加到每一個(gè)八聯(lián)管中，并置于冰上。
(5)將每個(gè)樣品吸取1μL加到相應(yīng)的含有24μL的PCR反應(yīng)混合液的管中。然后將反應(yīng)管快速離心后即可開(kāi)始PCR反應(yīng)。
(6)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。最左側(cè)泳道為DNA Marker，泳道1為陽(yáng)性對(duì)照，在270bp處出現(xiàn)了預(yù)期的條帶，泳道2為陰性對(duì)照，在270bp處沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明PCR體系正常工作，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。泳道3-7為所檢測(cè)的樣品，其中泳道3、4、6、7在270bp處出現(xiàn)條帶，說(shuō)明這4份為被支原體污染的樣品，對(duì)應(yīng)的免疫細(xì)胞出現(xiàn)了支原體污染。而泳道5在270bp處沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，說(shuō)明對(duì)應(yīng)的免疫細(xì)胞未出現(xiàn)支原體污染。