本發(fā)明屬于常見病原菌快速檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種抗萬古霉素腸球菌的引物對(duì)及檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

萬古霉素屬于糖肽類大分子抗生素，藥力較強(qiáng)，在其他抗生素對(duì)病菌無效時(shí)會(huì)被使用。主要用于葡萄球菌(包括抗青霉素和抗新青霉素株)和腸球菌引起的腸道感染，如心內(nèi)膜炎、敗血癥、偽膜性腸炎等。萬古霉素曾被認(rèn)為是抗感染的“最后底線”，但隨著萬古霉素的廣泛使用，各種抗萬古霉素的超級(jí)細(xì)菌已經(jīng)被陸續(xù)分離出來，其中最常見的就是抗萬古霉素腸球菌。這也為臨床診斷和治療提出了新的要求，即需要一種快速有效的方法來檢測(cè)病原菌是否對(duì)萬古霉素抗受，否則極有可能造成誤診，耽誤病情。

抗萬古霉素腸球菌是一種移生在腸道的革蘭氏陽(yáng)性球菌，腸球菌典型的排列為成對(duì)或短鏈狀，在顯微鏡下很難與肺炎雙球菌區(qū)別。腸球菌引起的泌尿道感染相當(dāng)常見，特別是在接受抗生素治療或是尿道手術(shù)的病患。同時(shí)，10％到20％的細(xì)菌性心內(nèi)膜炎，是由腸球菌引起的。

現(xiàn)有的腸球菌的檢測(cè)方法有菌培養(yǎng)法、顯微鏡檢法、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、普通PCR擴(kuò)增技術(shù)等。其中，菌培養(yǎng)法分離周期長(zhǎng)，過程繁瑣，不利于早期的快速診斷；顯微鏡檢法雖然快速方便，但容易漏檢，陽(yáng)性率不高，且部分菌種間不易區(qū)分；血清學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，對(duì)于輕度和局部感染的檢測(cè)不夠靈敏；普通PCR擴(kuò)增技術(shù)雖然特異性高，但不夠靈敏，且需要專門的PCR儀。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種抗萬古霉素腸球菌的引物對(duì)及檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，該試劑盒特異性好，靈敏度高，能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)抗萬古霉素腸球菌；該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、易操作。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種特異性抗萬古霉素腸球菌的引物對(duì)，該引物對(duì)是根據(jù)抗萬古霉素基因vanA保守序列設(shè)計(jì)的LAMP引物對(duì)，包括兩個(gè)內(nèi)引物，兩個(gè)外引物，以及兩條用于提高擴(kuò)增效率的環(huán)引物；其中：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

正向內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

反向內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

環(huán)引物L(fēng)F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

環(huán)引物L(fēng)B的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

一種檢測(cè)抗萬古霉素腸球菌的試劑盒，包括上述根據(jù)抗萬古霉素基因vanA保守序列設(shè)計(jì)的LAMP引物對(duì)，以及根據(jù)腸球菌ESP基因16S rDNA的保守序列設(shè)計(jì)LAMP引物對(duì)；其中：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

正向內(nèi)引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

反向內(nèi)引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

環(huán)引物L(fēng)B的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

試劑盒內(nèi)包括：

1)LAMP反應(yīng)緩沖液：共23μl，由以下組分組成：1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，4-10U Bst 2.0DNA Polymerase，dNTP 0.8-1.6mM，Mg²⁺2-14mM，甜菜堿0.6-1.2M，正反向內(nèi)引物FIP和BIP 0.8-1.6μM，正反向外引物F3和B30.15-0.3μM，正反向環(huán)引物L(fēng)F和LB 0.2-0.6μM，1μl指示劑；

2)陽(yáng)性對(duì)照：2μl陽(yáng)性模板，陽(yáng)性模板為含有vanA和16S rDNA基因的質(zhì)粒；

3)陰性對(duì)照：2μl ddH₂O；

4)待測(cè)樣品檢測(cè)管：盛裝2μl待檢測(cè)樣品。

1×Thermopol反應(yīng)緩沖液中各組分濃度分別為：20mM Tris-HCl、10mMKCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄及0.1％Triton X-100；Tris-HCl的pH為8.8。

本發(fā)明還公開了利用上述的檢測(cè)抗萬古霉素腸球菌的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括以下步驟：

1)待檢樣品的富集或DNA的提取

經(jīng)過12000rpm室溫離心1-10min富集1ml血清樣本中的腸球菌，棄上清，將沉淀用50-100μl 0.1M PBS緩沖液重懸，經(jīng)過沸水煮10min然后立即放入冰上；或者，利用商業(yè)化試劑盒或傳統(tǒng)方法提取待檢樣品核酸；

2)進(jìn)行腸球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)

首先，將待檢測(cè)樣品置于95-100℃金屬浴中5-10min，然后立即置于冰上；然后，在裝有23μL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2μL待檢模板DNA，并于60-65℃水浴鍋中恒溫?cái)U(kuò)增45-90min；最后，放入另一個(gè)85℃水浴鍋中，5-10min鐘后取出進(jìn)行檢測(cè)；

3)顯色檢測(cè)

將步驟2)得到的反應(yīng)產(chǎn)物置于500nm藍(lán)光LED透射儀上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)后溶液呈綠色的為陽(yáng)性，若呈黃色則為陰性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明根據(jù)抗萬古霉素的基因vanA、腸球菌ESP基因16S rDNA的保守序列設(shè)計(jì)LAMP引物，能夠快速確定腸球菌是否對(duì)萬古霉素耐受,所涉及的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)使用6個(gè)區(qū)域4條引物，增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性，同時(shí)其檢測(cè)靈敏度是普通PCR擴(kuò)增技術(shù)的100倍以上。同時(shí)，本發(fā)明所使用的指示劑直接加在反應(yīng)緩沖體系中，能夠在反應(yīng)前判斷反應(yīng)緩沖液是否失效，反應(yīng)后無需開蓋，避免了氣溶膠引起的核酸污染，而且該反應(yīng)可以在恒溫條件下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，不需要昂貴的儀器設(shè)備，成本較低。在病原微生物檢測(cè)方面顯示出了極為廣闊的前景，而尚未報(bào)道使用LAMP方法檢測(cè)抗萬古霉素金黃色葡萄球菌。

附圖說明

圖1為vanA基因的引物檢測(cè)抗萬古霉素腸球菌的結(jié)果；

圖2為16S rDNA基因的引物檢測(cè)腸球菌的結(jié)果；

圖3為驗(yàn)證vanA基因靈敏度；

圖4為驗(yàn)證16S rDNA基因靈敏度。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明公開的抗萬古霉素腸球菌檢測(cè)試劑盒，包括：

a)LAMP反應(yīng)緩沖液，LAMP反應(yīng)緩沖液共23μl，由以下組分組成：1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，8U Bst 2.0DNA Polymerase，dNTP 1.5mM，Mg²⁺8mM，甜菜堿0.8M，正反向內(nèi)引物(FIP和BIP)1.2μM，正反向外引物(F3和B3)0.25μM，正反向環(huán)引物(LF和LB)0.5μM，1μl指示劑；

b)陽(yáng)性對(duì)照管：在LAMP反應(yīng)緩沖液的基礎(chǔ)上增加2μl陽(yáng)性模板，陽(yáng)性模板為含有vanA/16S rDNA基因的質(zhì)粒；

c)陰性對(duì)照管：在LAMP反應(yīng)緩沖液的基礎(chǔ)上增加2μl ddH₂O；

d)檢測(cè)管：在LAMP反應(yīng)緩沖液中加入2μl待檢測(cè)樣品；

使用上述試劑盒檢測(cè)腸球菌，其具體方法依次包括下列步驟：

1)待檢樣品的富集或DNA的提?。?/p>

經(jīng)過12000rpm室溫離心2min富集1ml血清樣本中的腸球菌，棄上清，將沉淀用50μl 0.1M PBS緩沖液重懸，經(jīng)過沸水煮10min然后立即放入冰上。

或利用商業(yè)化試劑盒或傳統(tǒng)方法提取待檢樣品核酸。

2)進(jìn)行腸球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：

a：將待檢測(cè)樣品置于95℃金屬浴中5min，然后立即置于冰上；

b：在裝有23μL LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2μL待檢模板DNA，并于63℃水浴鍋中恒溫?cái)U(kuò)增60min；

c：放入另一個(gè)85℃水浴鍋中，8min鐘后取出進(jìn)行檢測(cè)；

3)顯色檢測(cè)：

將反應(yīng)產(chǎn)物置于500nm藍(lán)光LED透射儀上進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)后溶液呈綠色的為陽(yáng)性，若呈黃色則為陰性。

實(shí)施例1：本發(fā)明試劑盒的特異性檢

采用發(fā)明中的LAMP引物和試劑盒中的LAMP反應(yīng)緩沖液進(jìn)行特異性檢測(cè)，具體方法如下：

以抗萬古霉素腸球菌ATCC51858作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，2株腸球菌(ATCC700425，ATCC49532)作為參考菌株，并選擇其他4株非腸球菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。所有菌株活化于LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。取1ml菌體，經(jīng)過12,000rpm離心2min，用50μl PBS重懸，然后置于100℃金屬浴中10min，立即置于冰上，作為模板。

取2μl制備好的模板，分別加入到檢測(cè)vanA基因和16S rDNA基因的試劑盒中，65℃反應(yīng)60min。然后85℃反應(yīng)10min，終止反應(yīng)。

反應(yīng)結(jié)果參見圖1和圖2，圖1中，1:抗萬古霉素腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51858；2：腸球菌ATCC700425；3：腸球菌ATCC49532；4：大腸桿菌；5：金黃色葡萄球菌；6：艱難梭狀芽胞桿菌；7：肺炎鏈球菌；8：ddH₂O。圖2中，1:抗萬古霉素腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51858；2：腸球菌ATCC700425；3：腸球菌ATCC49532；4：大腸桿菌；5：金黃色葡萄球菌；6：艱難梭狀芽胞桿菌；7：肺炎鏈球菌；8：ddH₂O。

結(jié)果顯示：本發(fā)明的vanA引物和LAMP反應(yīng)體系只對(duì)抗萬古霉素腸球菌的DNA有擴(kuò)增，對(duì)其他腸球菌和非腸球菌菌株均無擴(kuò)增；而16S rDNA基因的引物則對(duì)抗萬古霉素腸球菌和普通腸球菌的DNA模板均有擴(kuò)增，對(duì)非腸球菌則無擴(kuò)增。說明本發(fā)明的試劑盒在檢測(cè)過程中不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。

若vanA基因和16S rDNA基因同時(shí)呈陽(yáng)性，則說明檢測(cè)菌株為抗萬古霉素腸球菌；若vanA基因陰性，16S rDNA基因陽(yáng)性，則說明檢測(cè)菌株為萬古霉素敏感腸球菌；若vanA基因陽(yáng)性，16S rDNA陰性，則說明檢測(cè)反應(yīng)體系失效。

實(shí)施例2：本發(fā)明試劑盒靈敏度檢測(cè)

通過PCR擴(kuò)增vanA基因和16S rDNA基因保守序列，經(jīng)過DNA凝膠回收后，酶切連接到pUC57載體上，然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過氨芐抗性平板篩選培養(yǎng)后，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確的克隆經(jīng)過LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，并測(cè)定濃度。

將質(zhì)粒濃度梯度稀釋為10ng/μl，1ng/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl，0.1fg/μl，0.01fg/μl，陰性對(duì)照組為ddH₂O。

具體操作同實(shí)施例1，結(jié)果參見圖3和圖4，圖3中，1：10ng/μl；2：1ng/μl；3：100fg/μl；4：10fg/μl；5：1fg/μl；6：0.1fg/μl；7：0.01fg/μl；8:ddH₂O。圖4中，1：10ng/μl；2：1ng/μl；3：100fg/μl；4：10fg/μl；5：1fg/μl；6：0.1fg/μl；7：0.01fg/μl；8:ddH₂O。

結(jié)果顯示，本發(fā)明的引物和LAMP反應(yīng)體系，可以檢測(cè)到1fp/μl，在試劑操作中能夠滿足臨床需求，且不會(huì)造成假陽(yáng)性。

實(shí)施例3：臨床樣本檢測(cè)

取30例病人血清樣本，進(jìn)行檢測(cè)，具體操作同實(shí)施例1，結(jié)果如表1：

表1

結(jié)果顯示，本發(fā)明的試劑盒能夠快速準(zhǔn)確的檢測(cè)抗萬古霉素腸球菌，檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR擴(kuò)增的結(jié)果一致，不存在假陽(yáng)性和漏檢。