本發(fā)明涉及一種基因組修飾系統(tǒng)及其用途，特別涉及一種用于檢測基因編輯水稻植株-E7的核酸序列及其檢測方法。

背景技術(shù)：

水稻是世界上最重要且廣泛種植的農(nóng)作物之一，改造水稻基因組對于農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。香米是一種特殊類型稻米，其在市場上具有很高的經(jīng)濟價值，這已為泰國的茉莉香型水稻所證實。目前香味已成為一項評價稻米品質(zhì)的重要指標。已有研究表明，水稻香味基因位于第8染色體上，并且由一對隱性基因控制，2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline，2-AP)是決定米飯香味最重要的化學(xué)成分。Louis等和Bradbury等研究最先發(fā)現(xiàn)，水稻香味是由于編碼甜菜醛脫氫酶(Betaine Aldehyde Dehydrogenase，BADH)的Badh2基因序列編碼區(qū)8bp的缺失和3bp突變導(dǎo)致BADH2原有功能喪失，從而使甜菜醛脫氫酶的作用底物2-AP的代謝途徑中斷，香味物質(zhì)不斷積累。自Lorieux等發(fā)現(xiàn)一個與2-AP相關(guān)的單隱性基因fgr控制香氣性狀后，一系列香味基因鑒定相關(guān)標記被開發(fā)，包括RFLP標記、SSR標記及RAPD標記等，但這些定位標記與基因的距離偏大易出現(xiàn)假陽性，使其利用也受到了一定限制。

現(xiàn)階段，香米育種主要依靠傳統(tǒng)的常規(guī)育種，通過多輪的雜交及回交將香稻種質(zhì)資源中的BADH2突變基因?qū)牍歉傻乃驹耘嗥贩N中。但利用現(xiàn)有的香稻種質(zhì)進行育種存在較大困難，傳統(tǒng)香稻種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀往往不盡如人意，如抗倒性、抗蟲性及抗病性較差，且產(chǎn)量不高。當(dāng)利用這些種質(zhì)通過傳統(tǒng)育種向待改良品種引入香味性狀的同時，由于連鎖累贅等原因，常常會帶來不良的負面性狀，導(dǎo)致無法獲得可用于實際生產(chǎn)的香米品種，或所育出的品種產(chǎn)量極低。因此，實際生產(chǎn)中需要開發(fā)具有香米性狀，且綜合農(nóng)藝性狀良好的香稻種質(zhì)作為香米育種種質(zhì)資源或直接作為親本生產(chǎn)雜交種。

TALENs(轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶)是近幾年出現(xiàn)的基因定點修飾新技術(shù)，在動物、植物和人類等領(lǐng)域都有廣泛的研究和應(yīng)用。轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription Activator-Like Protein Effector，TALE)是黃單胞菌屬病原菌分泌到宿主植物細胞中的一種毒性蛋白，可以識別植物DNA，驅(qū)動基因表達。TALENs就是利用TALE的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Fok I的DNA切割結(jié)構(gòu)域人工合成的核酸酶。兩個TALEN單體按照一定方式結(jié)合在DNA雙鏈上，形成有切割活性的二聚體將DNA切斷，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)，細胞啟動修復(fù)機制，通過非同源末端連接(NHEJ)這種不精確的修復(fù)方式可以產(chǎn)生基因定點突變，通過同源重組(HR)方式修復(fù)可以實現(xiàn)精確的基因定點插入或基因替換。

因此，通過TALENs技術(shù)可以直接將優(yōu)質(zhì)稻米(非香米)中BADH2基因定點突變或敲除，不僅可以滿足實際生產(chǎn)中創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)香米的需求，還可以大大縮短育種周期。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測基因編輯水稻植株-E7的核酸序列及其檢測方法，水稻植株-E7及其產(chǎn)生的稻米具有明顯的香味，且檢測方法可以準確快速的鑒定生物樣品中是否包含特定水稻植株-E7的DNA分子。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種具有以下核酸序列的核酸分子，所述核酸序列包含SEQ ID NO:1或其互補序列、和/或SEQ ID NO:2或其互補序列。

進一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互補序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847或其互補序列。

優(yōu)選地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:27或其互補序列。

進一步地，所述核酸序列包含SEQ ID NO:28或其互補序列。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，包括：

使待檢測樣品與用于擴增目標擴增產(chǎn)物的至少兩種引物在核酸擴增反應(yīng)中接觸；

進行核酸擴增反應(yīng)；

檢測擴增產(chǎn)物的存在；

所述目標擴增產(chǎn)物包含SEQ ID NO:1或其互補序列、和/或SEQ ID NO:2或其互補序列。

進一步地，所述目標擴增產(chǎn)物包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互補序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847位或其互補序列。

優(yōu)選地，所述目標擴增產(chǎn)物包含SEQ ID NO:27或其互補序列。

進一步地，所述目標擴增產(chǎn)物包含SEQ ID NO:28或其互補序列。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中水稻植株-E7的DNA存在的方法，包括：

使待檢測樣品與探針接觸，所述探針包含SEQ ID NO:1或其互補序列、和/或SEQ ID NO:2或其互補序列；

使所述待檢測樣品和所述探針在嚴格雜交條件下雜交；和

檢測所述待檢測樣品和所述探針的雜交情況。

進一步地，所述探針包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互補序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847位或其互補序列。

優(yōu)選地，所述探針包含SEQ ID NO:27或其互補序列。

可選地，至少一個所述探針用至少一種熒光基團標記。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種DNA檢測試劑盒，包含至少一個DNA分子，所述DNA分子包含SEQ ID NO:1或其互補序列、和/或SEQ ID NO:2或其互補序列。

進一步地，所述DNA分子包含SEQ ID NO:27或其互補序列。

更進一步地，所述DNA分子包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互補序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847位或其互補序列。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種培育香味水稻植物的方法，包括：

種植至少一粒水稻植物種子，所述水稻植物種子的基因組中包含SEQ ID NO:1或其互補序列、和/或SEQ ID NO:2或其互補序列；

使所述植物種子長成植株。

進一步地，所述DNA分子包含SEQ ID NO:28第1-2881位或其互補序列、和/或SEQ ID NO:28第2877-5847位或其互補序列。

優(yōu)選地，所述水稻植物種子的基因組中包含SEQ ID NO:27或其互補序列。

進一步地，所述水稻植物種子的基因組中包含SEQ ID NO:28或其互補序列。

本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。

本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。

如本申請，包括權(quán)利要求中使用的，除非上下文中清楚地另有說明，否則單數(shù)和單數(shù)形式的術(shù)語，例如“一”、“一個”和“該”，包括復(fù)數(shù)指代物。因此，例如“植物”、“該植物”或“一個植物”也指示多個植物。并且根據(jù)上下文，使用術(shù)語“植物”還可指示該植物在遺傳上相似或相同的后代。類似地，術(shù)語“核酸”可以指核酸分子的許多拷貝。類似地，術(shù)語“探針”可以指代相同或相似的探針分子。

數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字，并明確地包括所限定的范圍內(nèi)的每個整數(shù)和非整數(shù)分數(shù)。除非另外指出，否則本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。

本發(fā)明中，術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”可互換使用，根據(jù)上下文含義，可指代DNA或RNA。其中DNA包括但不限于cDNA、基因組DNA、合成DNA(例如人工合成)和含核酸類似物的DNA(或RNA)。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)。核酸可為雙鏈或單鏈(既有義鏈或反義單鏈)。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物、以及核酸類似物。

本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運肽、終止子、增強子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶的調(diào)節(jié)序列。

所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的“植物中可表達的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細胞內(nèi)進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米Ubi啟動子、水稻GOS2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗進行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達模式的啟動子是指當(dāng)植物經(jīng)受機械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表達較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pinⅠ和pinⅡ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。

本發(fā)明中，術(shù)語“分離的”涉及核酸時還包括任何非天然產(chǎn)生的序列，因為所述非天然產(chǎn)生的序列未在天然情況下發(fā)現(xiàn)且其在天然產(chǎn)生的基因組中沒有緊鄰序列。

本發(fā)明中，術(shù)語“TALENs”是指轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like(TAL)effector nucleases)，TALENs是一種可靶向修飾特異DNA序列的酶。它借助于轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(Transcription Activator-Like Protein Effector，TALE)，一種由植物細菌分泌的天然蛋白來識別特異性DNA堿基對。理論上講，TAL效應(yīng)因子可被設(shè)計識別和結(jié)合目的DNA序列。TAL效應(yīng)因子N端一般有轉(zhuǎn)運信號(translocation signal)，TAL效應(yīng)因子C端有核定位信號(nuclear localization signal，NLS)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)，而中部則是介導(dǎo)其與DNA特異識別與結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。把TAL效應(yīng)因子中的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)替換成核酸內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域就生成了TALENs，所述切割結(jié)構(gòu)域通常來自于無序列特異性的FokI核酸內(nèi)切酶。TALENs可與DNA結(jié)合并在特異位點對DNA鏈進行切割，從而導(dǎo)入新的遺傳物質(zhì)。

本發(fā)明中，術(shù)語“基因組修飾”被用作生物體的基因組或染色體或染色體外DNA或細胞器DNA中產(chǎn)生的作為基因靶向或基因功能修飾的結(jié)果的任何修飾。

本發(fā)明中，“修飾”是指利用任何基因技術(shù)導(dǎo)致靶序列永久或臨時改變包括但不限于缺失、插入、突變、置換、切口、甲基化、乙?；⑦B接、重組、螺旋解旋、化學(xué)修飾、標記、活化、失活和靶序列中一個或多個核苷酸的抑制。

本發(fā)明中，“突變體”是指發(fā)生突變的個體，其具有與野生型不同的序列，可能會導(dǎo)致至少部分功能丟失例如，在啟動子或增強子區(qū)域中序列的變化將至少部分地影響生物體中編碼序列的表達。術(shù)語“突變”是指可由諸如缺失、添加、取代或重排引起的核酸序列中序列的任何變化。突變還可影響該序列參與的一個或多個步驟。例如，DNA序列中的變化可導(dǎo)致有活性的、有部分活性的或無活性的改變的mRNA和/或蛋白的合成。

本發(fā)明中，術(shù)語“核酸酶”意在包括外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶。

本發(fā)明中，術(shù)語“內(nèi)切核酸酶”指能催化DNA或RNA分子內(nèi)(優(yōu)選DNA分子)核酸之間水解(切割)的任何野生型或變體酶。內(nèi)切核酸酶的非限制性示例包括II型限制性內(nèi)切酶例如Fok I、Hha I、Hind III、Not I、BbvC I、EcoR I、Bg II和Alw I。

在本發(fā)明中，“定位結(jié)構(gòu)域”可任選地添加為蛋白部分的部分，定位結(jié)構(gòu)域可將蛋白部分或編程的蛋白部分或組裝的復(fù)合物定位至活細胞中特定細胞或亞細胞定位。定位結(jié)構(gòu)域可通過將蛋白部分的氨基酸序列融合到摻入包括以下結(jié)構(gòu)域的氨基酸來構(gòu)建：核定位信號(NLS)；線粒體前導(dǎo)序列(MLS)；葉綠體前導(dǎo)序列；和/或被設(shè)計以將蛋白運輸或引導(dǎo)或定位至含有核酸的細胞器、細胞區(qū)室或細胞的任何細分部分的任何序列。在一些實施方案中，生物體是真核生物，且定位結(jié)構(gòu)域包括允許蛋白進入細胞核和基因組DNA內(nèi)的核定位結(jié)構(gòu)域(NLS)。所述NLS的序列可包括帶正電荷序列的任何功能NLS。在另一些實施方案中，定位結(jié)構(gòu)域可包括使蛋白部分或編程的核蛋白進入細胞器的前導(dǎo)序列，使細胞器DNA被修飾成為可能。

術(shù)語“探針”是一段分離的核酸分子，其上面結(jié)合有常規(guī)的可檢測標記或報告分子，例如，放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶類。這種探針與目標核酸的一條鏈是互補的，在本發(fā)明中，探針與來自水稻植株-E7基因組的一條DNA鏈互補，不論該基因組DNA是來自水稻植株-E7或種子還是來源于水稻植株-E7的植物或種子或提取物。本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，還包括特異性地與目標DNA序列結(jié)合并可用于檢測該目標DNA序列的存在的聚酰胺及其他探針材料。

術(shù)語“引物”是一段分離的核酸分子，其通過核酸雜交，退火結(jié)合到互補的目標DNA鏈上，在引物和目標DNA鏈之間形成雜合體，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下，沿目標DNA鏈延伸。本發(fā)明的引物對涉及其在目標核酸序列擴增中的應(yīng)用，例如，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或其他常規(guī)的核酸擴增方法。

探針和引物的長度一般是11個多核苷酸或更多，優(yōu)選的是18個多核苷酸或更多，更優(yōu)選的是24個多核苷酸或更多，最優(yōu)選的是30個多核苷酸或更多。這種探針和引物在高度嚴格雜交條件下與目標序列特異性地雜交。盡管不同于目標DNA序列且對目標DNA序列保持雜交能力的探針是可以通過常規(guī)方法設(shè)計出來的，但是，優(yōu)選的，本發(fā)明中的探針和引物與目標序列的連續(xù)核酸具有完全的DNA序列同一性。

本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴格條件下與目標DNA序列雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定樣品中來源于水稻植株-E7的DNA的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。如本發(fā)明使用的，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。如本發(fā)明使用的，當(dāng)一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。

如本發(fā)明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發(fā)生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45℃條件下用6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50℃條件下用2.0×SSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0×SSC、50℃到高度嚴格條件的約0.2×SSC、50℃。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22℃，升高到高度嚴格條件的約65℃。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明的一個核酸分子可以在中度嚴格條件下，例如在約2.0×SSC和約65℃下與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中一個或多個核酸分子或其互補序列，或者上述序列的任一片段發(fā)生特異性雜交。更優(yōu)選地，本發(fā)明的一個核酸分子在高度嚴格條件下與SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中一個或多個核酸分子或其互補序列，或者上述序列的任一片段發(fā)生特異性雜交。本發(fā)明中，優(yōu)選的標記物核酸分子具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其互補序列，或者上述序列的任一片段。SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2可以用作植物育種方法中的標記物以鑒定遺傳雜交的后代。探針與目標DNA分子的雜交可以通過任何一種為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進行檢測，這些方法包括但不限于，熒光標記、放射性標記、抗體類標記和化學(xué)發(fā)光標記。

關(guān)于使用特定的擴增引物對目標核酸序列進行的擴增(例如，通過PCR)，“嚴格條件”指的是在DNA熱擴增反應(yīng)中僅允許引物對目標核酸序列發(fā)生雜交的條件，具有與目標核酸序列相應(yīng)的野生型序列(或其互補序列)的引物，能夠與所述目標核酸序列結(jié)合，并且優(yōu)選產(chǎn)生唯一的擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物即擴增子。

術(shù)語“特異性結(jié)合(目標序列)”是指在嚴格雜交條件下探針或引物僅與包含目標序列的樣品中的目標序列發(fā)生雜交。

如本發(fā)明使用的，“經(jīng)過擴增的DNA”或“擴增子”是指作為核酸模板一部分的目標核酸序列的核酸擴增產(chǎn)物。例如，為了確定水稻植物是否由含有本發(fā)明水稻植株-E7通過有性雜交方式產(chǎn)生，或采集自田地的水稻樣品是否包含水稻植株-E7，或水稻提取物，例如稻米是否包含水稻植株-E7，從水稻植物組織樣品或提取物提取的DNA可以通過使用引物對的核酸擴增方法以產(chǎn)生對于水稻植株-E7的DNA的存在是診斷性的擴增子。擴增子具有一定長度和序列，所述序列對所述水稻植株-E7也是診斷性的。擴增子的長度范圍可以是引物對的結(jié)合長度加上一個核苷酸堿基對，優(yōu)選加上約五十個核苷酸堿基對，更優(yōu)選加上約兩百五十個核苷酸堿基對，最優(yōu)選加上約四百五十個核苷酸堿基對或更多。

本發(fā)明中，“標記物”指可通過光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其它物理手段是可檢測的組合物。例如，有用的標記物包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(例如，在ELISA中常用的)、生物素、地高辛、或半抗原和可使其是可檢測的其他實體。標記物可被摻入核酸和蛋白的任何位置處。

本發(fā)明中，“試劑盒”可包括本發(fā)明描述的基因組修飾系統(tǒng)與以下的任一種或全部：測定試劑、緩沖液、探針和/或引物、和無菌鹽水或另一種藥學(xué)上可接受的乳劑和懸液基底。此外，試劑盒可包括含有用于實踐本發(fā)明描述的方法的用法說明(例如，操作方案)的說明性材料。

本發(fā)明中，將外源DNA導(dǎo)入植物，如將編碼所述基因組修飾系統(tǒng)的核苷酸序列或表達盒或重組載體導(dǎo)入植物細胞，常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。

本發(fā)明提供了一種基因組修飾系統(tǒng)及其用途，具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明提供的基因組修飾系統(tǒng)，可用于植物定向分子育種，通過本方法獲得的初代改良植株，經(jīng)過遺傳分離可獲得具有改良效果但不攜帶轉(zhuǎn)基因成分的子代植株，從而在獲得香味性狀的同時消除外源DNA片段插入帶來的植物基因組穩(wěn)定性風(fēng)險。

2、本發(fā)明提供的基因組修飾系統(tǒng)可在定點修飾作物內(nèi)源基因的基礎(chǔ)上定向進行作物分子改良，經(jīng)過靶向修飾后的基因可在后代中穩(wěn)定遺傳，克服了超表達、RNAi等技術(shù)容易產(chǎn)生的基因丟失、沉默等缺陷。

3、本發(fā)明所述基因組修飾系統(tǒng)培育的香味水稻，實現(xiàn)了人工培育不含轉(zhuǎn)基因成分的香味水稻，目的性強，基因組損傷小，能夠規(guī)避轉(zhuǎn)基因可能帶來的風(fēng)險。

4、本發(fā)明所述基因組修飾系統(tǒng)縮短了植物育種時間，加快育種進程，節(jié)省成本，高效精準。

5、本發(fā)明首次創(chuàng)制出新的BADH2基因的等位形式，即在第7外顯子發(fā)生1bp的插入，豐富了香味基因資源。

6、本發(fā)明首次創(chuàng)制出香型華占水稻材料-水稻植株-E7，除具有香味外，在植株形態(tài)、生育期等其他性狀方面與野生型華占水稻材料無明顯差異，因此其可以用作香稻育種種質(zhì)資源；由于本發(fā)明水稻植株-E7的BADH2基因處于雜合狀態(tài)時，其產(chǎn)生的稻米也具有明顯的香味，所以水稻植株-E7的純合材料可直接作為恢復(fù)系應(yīng)用于實際生產(chǎn)，以獲得雜交種，進而獲得具有香味的稻米。

下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的重組表達載體DBN-E7-L構(gòu)建流程圖；

圖2為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的重組表達載體DBN-E7-R結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的重組表達載體pDBN-BADH2E7結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的香味物質(zhì)2-AP的氣相色譜-質(zhì)譜圖；

圖5為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的在營養(yǎng)生長期的植株整體形態(tài)圖；

圖6為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的在成熟期的植株整體形態(tài)圖；

圖7為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的在成熟期的植株株高對比圖；

圖8為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的在成熟期的植株分蘗數(shù)對比圖；

圖9為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的對外源T-DNA區(qū)的66個片段進行殘留檢測的擴增區(qū)域示意圖；

圖10為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的對外源T-DNA區(qū)的66個片段中1個片段進行殘留檢測的擴增結(jié)果圖；

圖11為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的采用21對引物中3對引物對外源T-DNA區(qū)進行殘留檢測的擴增結(jié)果圖；

圖12為本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的對8個潛在脫靶位點中1個潛在脫靶位點進行脫靶效應(yīng)鑒定的測序結(jié)果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)及其用途的技術(shù)方案。

第一實施例、水稻材料華占的BADH2基因序列的獲得

1、DNA的提取

DNA提取按照常規(guī)采用的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法：取2g幼嫩的水稻品種華占(華占水稻材料由北京金色農(nóng)華種業(yè)有限公司提供)植株的葉片在液氮中研磨成粉后，加入0.5ml于溫度65℃預(yù)熱的CTAB緩沖液(20g/LCTAB、1.4M NaCl、100mM Tris-HCl、20mM EDTA(乙二胺四乙酸)，用NaOH調(diào)pH至8.0)，充分混勻后，于溫度65℃抽提90min；先后加入0.5倍體積苯酚和0.5倍體積氯仿，顛倒混勻；12000rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))轉(zhuǎn)速下離心10min；吸取上清液，加入2倍體積無水乙醇，輕柔晃動離心管，于溫度4℃靜置30min；12000rpm轉(zhuǎn)速下再離心10min；收集DNA到管底；棄上清液，用1ml質(zhì)量濃度為70％的乙醇，洗滌沉淀；12000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min；真空抽干或在超凈臺吹干；DNA沉淀溶解于適量的TE緩沖液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)中，保存在溫度-20℃條件下。

將上述提取的DNA稀釋10倍后作為PCR擴增模板。

2、擴增水稻材料華占的BADH2基因

從NCBI上獲取中花11號水稻材料的BADH2基因序列，如序列表SEQ ID NO:3所示。

根據(jù)中花11號水稻材料的BADH2基因序列(如序列表中SEQ ID NO:3所示)，設(shè)計引物

引物1-F：ACCTATCGCTTTCCACCTC，如序列表中SEQ ID NO:4所示；

引物1-R：CTCTCCGCTTGAACCCAT，如序列表中SEQ ID NO:5所示；

引物2-F：CCAAATCGATCGATATGGTCTAG，如序列表中SEQ ID NO:6所示；

引物2-R：CTATTTAGTACCATGCTTGGGTCAT，如序列表中SEQ ID NO:7所示；

引物3-F：GATGCTTTGAGTACTTTGCAGATC，如序列表中SEQ ID NO:8所示；

引物3-R：ATTGAGAGGAATATCATTTCCATTG，如序列表中SEQ ID NO:9所示；

引物4-F：CTGATGTGTGTAAAGAGGTTGGT，如序列表中SEQ ID NO:10所示；

引物4-R：AACATCATAGAGACATGGACACA，如序列表中SEQ ID NO:11所示；

引物5-F：TCTCTTTGGTTGCTTTTGGAC，如序列表中SEQ ID NO:12所示；

引物5-R：CAGCACCAGCCAGACCATAACT，如序列表中SEQ ID NO:13所示；

引物6-F：TGGCCAACGATACTCAGTGAGTT，如序列表中SEQ ID NO:14所示；

引物6-R：AATCAAACATCGATATGCACAA，如序列表中SEQ ID NO:15所示。

以華占水稻材料的BADH2基因序列為模板，按照下述條件進行PCR擴增：

上述反應(yīng)緩沖液為：200mM Tris-HCl(pH8.4)，200mM KCl，15mM MgCl₂。

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，然后進入下列循環(huán)：94℃變性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸2min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。

使用PCR清潔試劑盒(Axygen)對上述PCR產(chǎn)物進行純化，具體方法參考其產(chǎn)品說明書；直接進行測序驗證，并將各PCR產(chǎn)物序列使用ContigExpress Project軟件進行拼接，以獲得完整的拼接后的序列信息；確認水稻材料華占的BADH2基因序列如序列表中SEQ ID NO:16所示。

本發(fā)明以水稻材料華占的BADH2基因第七外顯子(E7)的序列為轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)的靶序列，如序列表中SEQ ID NO:16的第2844位至第2909位所示。

第二實施例、TALEN的設(shè)計及獲得

1、TALEN靶序列的篩選

靶序列E7靶向水稻材料華占BADH2基因的第七外顯子，序列如下:5’-gtTGCATTTACTGGGAGTTatgaaactggtaaaaagattaTGGCTTCAGCTGCTCCTatggt taag-3’(序列表中SEQ ID NO:16的第2844位至第2909位)；其中左右兩側(cè)大寫字母為TALEN模塊識別序列(分別命名為L-E7和R-E7)，中間的小寫字母為間隔序列。

2、TALEN編碼基因的設(shè)計與合成

將以靶序列E7中的L-E7為模塊識別序列的TALEN命名為E7-L，所述核酸酶E7-L的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:18所示，所述核酸酶E7-L的編碼基因序列如序列表SEQ ID NO:17所示，其中，序列表中SEQ ID NO:17的第1-465位編碼TAL效應(yīng)因子N端，第469-2214位編碼L-E7的識別蛋白，第2215-2856位編碼TAL效應(yīng)因子C端，第2857-3459位編碼內(nèi)切核酸酶Fok I；

將以靶序列E7中的R-E7為模塊識別序列的TALEN命名為E7-R，所述核酸酶E7-R的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:19所示，所述核酸酶E7-R的編碼基因序列如序列表SEQ ID NO:20所示，其中，序列表中SEQ ID NO:20的第1-465位編碼TAL效應(yīng)因子N端，第469-2214位編碼R-E7的識別蛋白，第2215-2856位編碼TAL效應(yīng)因子C端，第2857-3459位編碼內(nèi)切核酸酶Fok I；

序列表中SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:20所示的多核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

第三實施例、TALEN重組表達載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1、構(gòu)建TALEN重組表達載體pDBN-BADH2E7

用限制性內(nèi)切酶BsaI和BsmBI分別酶切所述E7-L多核苷酸序列片段和表達載體DBNBC-01(載體骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA機構(gòu)可以提供))，將切下的E7-L核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-01的BsmBI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達載體DBN-E7-L，其構(gòu)建流程如圖1所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S：花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子(SEQ ID NO:21)；E7-L：E7-L核苷酸序列(SEQ ID NO:17)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:22)；LB：左邊界)。

用限制性內(nèi)切酶BsaI分別酶切所述E7-R多核苷酸序列片段和表達載體DBNBC-01(載體骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA機構(gòu)可以提供))，將切下的E7-R核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-01的BsaI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達載體DBN-E7-R，其載體結(jié)構(gòu)如圖2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S：花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子(SEQ ID NO:21)；E7-R：E7-R核苷酸序列(SEQ ID NO:20)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:22)；LB：左邊界)。

用限制性內(nèi)切酶SpeI、AscI和BamHI酶切基礎(chǔ)載體pG(載體骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA機構(gòu)可以提供))，回收Backbone-Hpt片段；用限制性內(nèi)切酶SpeI和SfiI酶切重組表達載體DBN-E7-L，回收E7-L cassette片段；和用限制性內(nèi)切酶SfiI和AscI酶切重組表達載體DBN-E7-R，回收E7-R cassette片段；用T4連接酶連接上述Backbone-Hpt片段、E7-L cassette片段和E7-Rcassette片段三個回收的片段，構(gòu)建成重組表達載體pDBN-BADH2E7，其載體結(jié)構(gòu)如圖3所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S：花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子(SEQ ID NO:21)；E7-L：E7-L核苷酸序列(SEQ ID NO:17)；tNos：胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID NO:22)；E7-R：E7-R核苷酸序列(SEQ ID NO:20)；Hpt：潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(SEQ ID NO:23)；t35S：花椰菜花葉病毒(CaMV35S)終止子(SEQ ID NO:24)；LB：左邊界)。然后將連接產(chǎn)物用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞(Transgen，Beijing，China；CAT：CD501)，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細胞、10μl連接產(chǎn)物，42℃水浴30秒；37℃培養(yǎng)1小時(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37℃條件下生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒：將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μl冰預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、50mM葡萄糖，pH8.0)懸浮；加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH、質(zhì)量濃度為1％SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(3M醋酸鉀、5M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用質(zhì)量濃度為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μl含RNA酶(Rnase，20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化RNA；于溫度-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取的質(zhì)粒經(jīng)SpeI、AscI和BamHI酶切鑒定后，挑選陽性克隆，進行測序驗證，獲得正確的重組表達載體pDBN-BADH2E7。

2、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達載體pDBN-BADH2E7用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μl農(nóng)桿菌LBA4404、3μl質(zhì)粒DNA(重組表達載體)；置于液氮中10min，37℃溫水浴10min；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2h，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶進行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達載體pDBN-BADH2E7結(jié)構(gòu)完全正確。

第四實施例、獲得轉(zhuǎn)化的水稻植株

對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化，簡要地，把水稻品種華占種子接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、肌醇100mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，從水稻成熟胚誘導(dǎo)出愈傷組織(步驟1：愈傷誘導(dǎo)步驟)，之后，優(yōu)選愈傷組織，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸愈傷組織，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)⑺龌蚪M修飾系統(tǒng)傳遞至愈傷組織上的至少一個細胞(步驟2：侵染步驟)。在此步驟中，愈傷組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD₆₆₀＝0.1，侵染培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、pH5.2))中以啟動接種。愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟3：共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在侵染步驟后在液體培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、肌醇100mg/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，有一個“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、肌醇100mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素150-250mg/L)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟4：恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復(fù)期。接著，接種的愈傷組織在含選擇劑(潮霉素)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟5：選擇步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、潮霉素50mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟6：再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(N6分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。

篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述N6分化培養(yǎng)基(N6鹽3.1g/L、N6維他命、干酪素300mg/L、麥芽糖30g/L、肌醇100mg/L、脯氨酸300mg/L、谷氨酸200mg/L、潮霉素10mg/L、6-芐氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸1mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25℃下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)。在溫室中，每天于28℃下培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化的T₀水稻植株。

第五實施例、檢測BADH2基因的突變結(jié)果

1、DNA的提取

按照第一實施例1中所述DNA提取的方法提取上述轉(zhuǎn)化的T₀水稻植株葉片的DNA，并將所述提取的DNA稀釋10倍后作為PCR擴增模板。

2、檢測BADH2基因的突變結(jié)果

按照上述第一實施例2中的擴增方法和條件，設(shè)計引物擴增包含靶序列E7在內(nèi)的區(qū)段：

引物7-F：CTGATGTGTGTAAAGAGGTTGG，如序列表中SEQ ID NO:25所示；

引物7-R：TTTCCACCAAGTTCCAGTG，如序列表中SEQ ID NO:26所示。

通過測序分析，獲得靶序列E7發(fā)生突變的T₀水稻植株-E7，突變后的靶序列E7如序列表中SEQ ID NO:27所示，其突變形式為在靶序列E7內(nèi)插入了一個堿基A。故突變后的BADH2基因序列如序列表中SEQ ID NO:28所示，其CDS序列如序列表中SEQ ID NO:29所示。

3、獲得突變的T₂水稻植株-E7的種子

在溫室(28℃左右)培養(yǎng)所述T₀水稻植株-E7至結(jié)實，收獲突變的T₁水稻植株-E7的種子。

在溫室(28℃左右)種植所述T₁水稻植株-E7的種子，獲得突變的T₁水稻植株-E7，剪取所述T₁水稻植株-E7的幼苗葉片(出苗后第7-10天)，按照上述提取DNA的方法，使用引物7-F和引物7-R擴增包含靶序列E7在內(nèi)的區(qū)段，測序分析后，將所述T₁水稻植株-E7區(qū)分為未發(fā)生突變的T₁水稻植株、純合的T₁水稻植株-E7和雜合的T₁水稻植株-E7三種類型，待其成熟后收獲上述未發(fā)生突變的T₁水稻植株的種子、純合的T₁水稻植株-E7的種子和雜合的T₁水稻植株-E7的種子。

第六實施例、突變材料的香味鑒定

1、突變的水稻植株葉片的香味鑒定

分別稱取所述未發(fā)生突變的T₁水稻植株、所述純合的T₁水稻植株-E7、所述雜合的T₁水稻植株-E7、無香味的華占水稻植株的幼苗葉片(三葉期)各2g，剪碎后放入50ml離心管中，加入10ml濃度為1.7％(m/v)的KOH溶液，加蓋密封后于溫度30℃下放置10min，打開蓋子，立即逐一聞其氣味，依據(jù)香味濃烈分類。本實驗采用五人分別評定的方法進行，且被鑒定材料的名稱采用隨機編碼的方式進行標注，如1、2、3、4以此類推。

上述實驗結(jié)果表明：五個人對上述材料的判斷結(jié)果完全一致，即純合的T₁水稻植株-E7有香味，雜合的T₁水稻植株-E7、未發(fā)生突變的T₁水稻植株和無香味的華占水稻植株均沒有香味。

2、突變的水稻植株種子的香味鑒定-氣味

分別取所述未發(fā)生突變的T₁水稻植株的種子、所述純合的T₁水稻植株-E7的種子、所述雜合的T₁水稻植株-E7的種子、無香味的華占水稻植株的種子各1000粒，籽粒脫殼，分別放入小碗內(nèi)，加入少許水，分別放入四個蒸鍋的蒸屜上，蓋上鍋蓋并將蒸鍋分別放置在四個獨立密閉的屋子里直接進行蒸煮。約40min后，首先聞屋子里是否有香味，然后掀開蒸鍋的蓋子，聞是否有香味，最后取出蒸煮好的籽粒，再聞是否有香味。逐一聞其氣味，依據(jù)香味濃烈分類。本實驗采用五人分別評定的方法進行，且被鑒定材料的名稱采用隨機編碼的方式進行標注，如1、2、3、4以此類推。

上述實驗結(jié)果表明：五個人對上述材料的判斷結(jié)果完全一致，即純合的T₁水稻植株-E7的種子有香味，未發(fā)生突變的T₁水稻植株的種子和無香味的華占水稻植株的種子沒有香味；由于雜合的T₁水稻植株-E7自交產(chǎn)生的種子中有25％的種子為具有香味的純合基因型種子，故雜合的T₁水稻植株-E7的種子也有香味。

3、突變的水稻植株種子的香味鑒定-氣相色譜-質(zhì)譜法

通過GC-MS(氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀)進行2-AP含量的測定，具體方法為：分別稱取0.5g所述純合的T₁水稻植株-E7的種子和所述雜合的T₁水稻植株-E7的種子，脫殼后分別放入2ml離心管中，使用高速振蕩器充分磨成粉末，將粉末轉(zhuǎn)移到5ml鉗口瓶中，加入2ml提取液(無水乙醇:二氯甲烷＝1:1(體積比)，并且含0.5mg/L的2,4,6-三甲基吡啶作為內(nèi)參)。鉗口瓶密封好后，于溫度80℃下處理3小時，然后冷卻至室溫，13800rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘，取上清液至樣品瓶，使用GC-MS儀器(GC7890A-5975C MS；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)進行2-AP含量的測定。DB-5MS毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm，J&W)的初始溫度為50℃，保持2分鐘，而后以5℃/分鐘的速度升溫至120℃，然后再以15℃/分鐘的速度升溫至280℃，并保持3分鐘。GC-MS儀器處于電子沖擊模式，電離電壓為70eV，離子源溫為230℃。同時以華占水稻植株的種子和日本晴水稻植株的種子(由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)贈送)作為陰性對照，以稻花香水稻植株的種子(市場上購買)作為陽性對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

如圖4所示，上述實驗結(jié)果表明：野生型華占水稻植株的種子和野生型日本晴水稻植株的種子中未檢測到香味物質(zhì)2-AP的存在；所述純合的T₁水稻植株-E7的種子和所述雜合的T₁水稻植株-E7的種子均具有一定量的2-AP，且純合的T₁水稻植株-E7的種子的2-AP含量與稻花香水稻植株的種子相當(dāng)。

第七實施例、分析突變的水稻植株

1、植株整體形態(tài)的鑒定

針對植株整體形態(tài)對所述未發(fā)生突變的T₁水稻植株、所述純合的T₁水稻植株-E7和華占水稻植株分別在營養(yǎng)生長期和成熟期進行總體的表型觀察和評估，并在成熟期進行株高和分蘗數(shù)調(diào)查。

如圖5-8所示，除香味性狀外，在營養(yǎng)生長期和成熟期，在所述未發(fā)生突變的T₁水稻植株、所述純合的T₁水稻植株-E7和華占水稻植株之間沒有觀察到其它形態(tài)不同，具體包括植株長勢、株型、株高和分蘗數(shù)。且所述純合的T₁水稻植株-E7的葉片有香味，所述未發(fā)生突變的的T₁水稻植株和華占水稻植株的葉片均沒有香味。

2、突變的水稻植株的外源T-DNA殘留檢測

按照第五實施例中1的方法提取所述純合的T₁水稻植株-E7的葉片DNA，設(shè)計引物8-F(如序列表中SEQ ID NO:30所示)分別與引物8-R-1(如序列表中SEQ ID NO:31所示)、引物8-R-2(如序列表中SEQ ID NO:32所示)組配成兩對引物，按照第一實施例的擴增方法和條件，進行外源T-DNA區(qū)目標片段擴增檢測(擴增區(qū)域覆蓋外源T-DNA區(qū)域的10％)，并獲得多株殘留檢測為陰性(即外源T-DNA區(qū)目標片段無殘留)的所述純合的T₁水稻植株-E7。

引物8-F：CTCCGTGACCGAGTTCAAGT，如序列表中SEQ ID NO:30所示；

引物8-R-1：GACCGGGTCACGCTGCAC，如序列表中SEQ ID NO:31所示；

引物8-R-2：TGCTTTGAAGACGTGGTTGGAA，如序列表中SEQ ID NO:32所示。

利用上述獲得的多株殘留檢測為陰性的所述純合的T₁水稻植株-E7的葉片DNA，按照上述方法設(shè)計引物9-74(如序列表中SEQ ID NO:33-164所示)，按照第一實施例的擴增方法和條件，對外源T-DNA區(qū)的66個片段進行擴增檢測，同時以野生華占水稻植株作為陰性對照，以含有外源T-DNA區(qū)的華占水稻植株作為陽性對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)。如圖9所示，擴增區(qū)域覆蓋外源T-DNA區(qū)域的96％。獲得5株殘留檢測均為陰性(即外源T-DNA區(qū)66個片段無殘留)的所述純合的T₁水稻植株-E7，如圖10(+：含有外源T-DNA區(qū)的華占水稻植株；-：表示野生華占水稻植株；1、2、3、4、5表示所得到的5株殘留檢測均為陰性的所述純合的T₁水稻植株-E7)所示，圖10僅展示了其中1個片段的擴增結(jié)果，其它65個片段的擴增結(jié)果與其一致。

依據(jù)國家轉(zhuǎn)基因檢測方法，采用21對國家轉(zhuǎn)基因檢測部門所用的引物(引物75-95，如序列表中SEQ ID NO:165-206所示)，對上述獲得的5株所述純合的T₁水稻植株-E7進行外源T-DNA區(qū)的21個片段進行擴增檢測，同時以野生華占水稻植株作為陰性對照，以含有含有待檢測元件的轉(zhuǎn)化事件DNA樣品作為陽性對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)。如圖11(+：含有含有待檢測元件的轉(zhuǎn)化事件DNA樣品；-：表示野生華占水稻植株；1、2、3、4、5表示所得到的5株無外源T-DNA殘留的新的所述純合的T₁水稻植株-E7)所示，最終獲得了5株無外源T-DNA殘留的新的所述純合的T₁水稻植株-E7(BADH2基因的突變體)；圖11僅展示了其中3對引物的擴增結(jié)果，其它18對引物的擴增結(jié)果與上述3對引物一致。

3、突變的水稻植株的脫靶效應(yīng)鑒定

將本發(fā)明所使用的TALEN模塊識別序列L-E7(TGCATTTACTGGGAGTT)和R-E7(AGGAGCAGCTGAAGCCA)在康奈爾大學(xué)網(wǎng)站(https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talef-off-paired)上進行分析，得到8個潛在的脫靶位點，具體信息如表1所示。利用上述獲得的5株無外源T-DNA殘留的新的所述純合的T₁水稻植株-E7的葉片DNA，分別設(shè)計引物，擴增上述8個潛在的脫靶位點區(qū)域，同時以華占水稻植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)。測序后，將5株無外源T-DNA殘留的新的所述純合的T₁水稻植株-E7的序列與華占水稻植株的序列進行比對。

表1、8個潛在的脫靶位點的具體信息表

如圖12(1、2、3、4、5表示所得到的5株無外源T-DNA殘留的新的所述純合的T₁水稻植株-E7)所示，上述8個潛在脫靶位點均未發(fā)生突變，即沒有發(fā)生脫靶效應(yīng)，圖12僅展示了其中1個潛在脫靶位點的測序結(jié)果，其它7個潛在脫靶位點的測序結(jié)果與其一致。

綜上所述，本發(fā)明基因組修飾系統(tǒng)可用于植物定向分子育種，經(jīng)過遺傳分離可獲得具有改良效果但不攜帶轉(zhuǎn)基因成分的子代植株，且可在后代中穩(wěn)定遺傳，同時縮短了植物育種時間，加快育種進程，節(jié)省成本，高效精準；本發(fā)明首次創(chuàng)制出新的BADH2基因的等位形式，由此獲得的香味水稻，實現(xiàn)了人工培育不含轉(zhuǎn)基因成分的香味水稻，目的性強，基因組損傷小，能夠規(guī)避轉(zhuǎn)基因可能帶來的風(fēng)險，且香型華占水稻材料-水稻植株-E7，除具有香味外，在植株形態(tài)、生育期等其他性狀方面與野生型華占水稻材料無明顯差異，在實際生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。