1.一種用于免疫細胞培養(yǎng)的支原體檢測試劑盒,其特征在于包括PCR擴增用的引物對:
上游引物,其RNA序列如SEQ ID No.1所示,
下游引物,其RNA序列如SEQ ID No.2所示,
以及
DNase-free water,
2×Taq Master Mix。
2.一種用于免疫細胞培養(yǎng)的支原體檢測方法,其特征在于采用權(quán)利要求1任一所述的支原體檢測試劑盒,檢測包括以下步驟:
a.支原體樣本收集,
b.將支原體與試劑盒中的引物對進行PCR擴增,
c.對擴增后的產(chǎn)物進行電泳染色檢測,陽性樣本將在270bp處出現(xiàn)特異性條帶。
3.如權(quán)利要求2所述的用于免疫細胞培養(yǎng)的支原體檢測方法,其特征在于支原體樣本收集的步驟如下:
i.收取待檢樣品,取1mL至離心管,200g離心力室溫離心1min,將上層清液液轉(zhuǎn)至新管,待用,
ii.取上述上層清液作液為PCR模板,每25μL反應(yīng)體系加1μL。
4.如權(quán)利要求2所述的用于免疫細胞培養(yǎng)的支原體檢測方法,其特征在于PCR擴增的步驟如下:
i.融化2×Taq Master Mix和引物對,并放置在冰上,
ii.確定擴增樣品的數(shù)目,其中包括陽性、陰性對照和待檢樣品,
iii.計算PCR反應(yīng)所需各成分總含量,
iv.將PCR各反成分加到一無菌管中,振蕩混勻并置于冰上,
v.將干凈消毒的八聯(lián)管置于架上并正確標(biāo)記,
vi.將24μLPCR反應(yīng)混合液加到每一個八聯(lián)管中,并置于冰上,
vii.將每個樣品吸取1μL加到相應(yīng)的含有24μLPCR反應(yīng)混合液的管中。然后將反應(yīng)管快速離心后即可開始PCR反應(yīng),其中PCR反應(yīng)條件為:
預(yù)變性:94℃,2min,
循環(huán):
94℃,30sec;
55℃,30sec,35cycles;
72℃,30sec,
延伸:72℃,10min,
保存:4℃。
5.如權(quán)利要求2所述的用于免疫細胞培養(yǎng)的支原體檢測方法,其特征在于所述的電泳染色檢測的步驟如下:
i.制膠:1.5%瓊脂糖凝膠,稱取0.375g瓊脂糖于三角燒杯中,加入25mL 1×TAE電泳緩沖液,水浴溶化瓊脂糖,稍冷后注入凝膠模中,冷卻凝固后,即可用于電泳,
ii.上樣:取10μL PCR擴增產(chǎn)物,直接點樣,
iii.電泳:120V電泳20分鐘,
iv.浸染:電泳結(jié)束后,將膠放置在含0.5uM Ethidium bromide的TAE染液中,室溫7-10min,
vi.于紫外光凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察、拍照。