本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一個(gè)影響豬生長(zhǎng)和PRRSV抗性的分子標(biāo)記、檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一種高度傳染的病毒性疾病，主要以母豬繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病為特征，造成懷孕母豬的流產(chǎn)、死胎以及仔豬生長(zhǎng)緩慢、高死亡率等。該病于20世紀(jì)80年代末在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，隨后在荷蘭、西班牙、英國(guó)等養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家相繼爆發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1991年荷蘭科學(xué)家Wensvoort博士第一次從感染的豬體內(nèi)分離出這種病毒，并將其命名為L(zhǎng)elystad病毒(LV)。1992年美國(guó)科學(xué)家Collins等在CL2621細(xì)胞中分離到能夠?qū)е孪嗨婆R床癥狀的病毒，并將其命名為VR-2332毒株。1992年，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織正式將該病毒統(tǒng)一命名PRRSV。我國(guó)初次發(fā)生該病是在1995年，郭寶清等人在1996年首次分離到該病毒，命名為CH-1a株。2006年在我國(guó)爆發(fā)的豬高熱病其主要病原即為高致病性PRRSV。目前，PRRS嚴(yán)重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)，并給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于PRRSV具有高度變異性、抗體依賴性病毒復(fù)制增強(qiáng)等特征，現(xiàn)有的疫苗并不能很好地控制該疾病的流行，通過(guò)遺傳抗性的選擇，培育PRRSV抗性豬新品種(系)成為重要的方向?？共⌒誀顚儆陂撔誀?，生長(zhǎng)性狀屬于數(shù)量性狀，二者都是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，同時(shí)也是表型選擇準(zhǔn)確性差、遺傳進(jìn)展慢的性狀，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記，進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，可以實(shí)現(xiàn)超早期選種，提高選擇的準(zhǔn)確性，加快育種進(jìn)程。

豬白細(xì)胞抗原DRB1(Swine leukocyte antigen DRB1，SLA-DRB1)，又名主要組織相容性抗原DRB1(MHC-DRB1)。SLA定位于7p12-q12，按其抗原結(jié)構(gòu)和功能主要分為3大類，即I類、Ⅱ類和III類基因，其中Ⅱ類基因位于SLA-D區(qū)，主要包括DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、DPA、TAP、LMP等，控制著機(jī)體的免疫應(yīng)答與調(diào)控。其中，存在于DR亞區(qū)的DRB基因第2外顯子編碼區(qū)是SLA抗原分子最重要的功能區(qū)，即抗原結(jié)合區(qū)。SLA-DRB1與抗原遞呈中Ia分子相關(guān)的不變鏈(Ia-associated invariant chain,Ii鏈)、伴侶分子SLA-DM及TCR一起完成抗原的遞呈與識(shí)別。

研究顯示,DRB基因第2外顯子區(qū)具有高度多態(tài)性。如鞠慧萍等以藏豬為研究材料對(duì)SLA-DRB基因第2外顯子多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)藏豬SLA-DRB基因外顯子2存在著高度的多態(tài)性，在RsaⅠ-RFLP位點(diǎn)上存在7種基因型，以雜合子BC型居多，等位基因B的頻率最高，這一結(jié)果與談?dòng)浪傻妊芯课逯干?、二花臉和皮特蘭豬的SLA-DRB基因外顯子2多態(tài)性時(shí)僅檢測(cè)到4種帶型(AA，BB，AB和BD)，且A為優(yōu)勢(shì)等位基因有一定的差異。徐如海(2004)采用直接測(cè)序法研究表明，SLA-DRB外顯子2中的多態(tài)位點(diǎn)高達(dá)62個(gè),SLA-DRB外顯子2中位點(diǎn)29與仔豬大腸桿菌K88ad粘附表型存在顯著的關(guān)聯(lián)(p＜0.01),位點(diǎn)29,149,170對(duì)0-28日齡仔豬血清IgG含量有顯著影響(p＜0.05)；同時(shí)在SLA-DRB近端調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)了24個(gè)多態(tài)位點(diǎn),但這些多態(tài)位點(diǎn)與仔豬大腸桿菌K88ab,K88ac,K88ad粘附表型沒(méi)有顯著的關(guān)聯(lián)(p＞0.05)。另外，有報(bào)道SLA-DRB1編碼區(qū)多態(tài)性與免疫偽狂犬病毒疫苗產(chǎn)生的抗體滴度有關(guān)。但SLA-DRB1多態(tài)性與PRRSV抗性的關(guān)聯(lián)尚未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服豬育種中生長(zhǎng)和PRRSV抗性表型選擇準(zhǔn)確性低，成本高，遺傳進(jìn)展慢的缺點(diǎn)，提供一個(gè)影響豬體重和PRRSV抗性的分子標(biāo)記。

本發(fā)明的另一目的是提供一種豬生長(zhǎng)性狀和PRRSV抗性性狀的SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)分子標(biāo)記選擇方法，用于豬分子育種，可以提高豬生長(zhǎng)性狀和PRRSV抗性性狀選擇的準(zhǔn)確性，降低育種成本，加快豬PRRSV抗性新品種(系)培育進(jìn)程。

本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一個(gè)影響豬體重和PRRSV抗性的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記位于豬SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58位點(diǎn)，且具有C/T多態(tài)性，CC型體重顯著高于CT型和TT型，仔豬感染PRRSV后CC型豬血液中病毒載量低于CT型和TT型。

本發(fā)明所述的分子標(biāo)記在豬分子育種中的應(yīng)用。

一種用于檢測(cè)本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的引物對(duì)，上游引物P1如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物P2如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明所述的引物對(duì)在豬分子育種中的應(yīng)用。

一種檢測(cè)本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的方法，包含PCR擴(kuò)增豬基因組中含有本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的一段序列，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，判讀豬SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58位點(diǎn)的C/T多態(tài)性。

一種檢測(cè)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記的方法，包括利用本發(fā)明所述的引物對(duì)PCR擴(kuò)增豬基因組中含有本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的一段序列，利用KpnⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳分型，獲得216bp、31bp兩個(gè)片段的定義為CC型，獲得247bp、216bp、31bp三個(gè)片段的定義為CT型，獲得247bp片段的定義為T(mén)T型。

一種篩選高生長(zhǎng)性狀和具有PRRSV抗性的豬品系的方法，包括檢測(cè)豬SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58位點(diǎn)的多態(tài)性，選擇CC型個(gè)體留種。

本發(fā)明所述的方法，優(yōu)選包括以下步驟：

1)提取豬基因組DNA；

2)利用本發(fā)明所述的引物對(duì)PCR擴(kuò)增SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)序列(序列NC_010449.4，20052～20298bp區(qū)域)，得到247bp擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)利用KpnⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切、電泳分型，獲得216bp、31bp兩個(gè)片段的定義為CC型，獲得247bp、216bp、31bp三個(gè)片段的定義為CT型，獲得247bp片段的定義為T(mén)T型；

4)CC型體重顯著高于CT型和TT型，仔豬感染PRRSV后CC型豬對(duì)PRRSV的抗性高于CT型和TT型，選擇CC型個(gè)體留種。

其中，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)總體系優(yōu)選為20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.5μL，引物P1和P2各5pmol，25mM的MgCl₂ 1.2-1.6μL，10×緩沖液2μL，加滅菌雙蒸水至20μL；所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

所述酶切的反應(yīng)體系優(yōu)選為10-16μL，PCR產(chǎn)物3-5μL，10U/μL KpnⅠ酶0.2-0.5μL，10×緩沖液1.0-1.6μL，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至10-16μL；37℃酶切3-5h。

有益效果

豬的生長(zhǎng)性狀是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)性狀，屬于數(shù)量性狀，傳統(tǒng)的表型選擇準(zhǔn)確性低，周期長(zhǎng)，無(wú)法進(jìn)行超早期選擇，遺傳進(jìn)展緩慢。而常規(guī)的PRRSV抗性選擇需要進(jìn)行PRRSV攻毒實(shí)驗(yàn)，需要建立專門(mén)的試驗(yàn)場(chǎng)所，攻毒實(shí)驗(yàn)嚴(yán)重影響豬生長(zhǎng)，部分攻毒豬死亡，代價(jià)很高，周期長(zhǎng)，選擇準(zhǔn)確性低，遺傳進(jìn)展緩慢。本發(fā)明采用PCR-RFLP方法檢測(cè)SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T KpnⅠ酶切位點(diǎn)的多態(tài)性，并將基因型與豬體重、豬對(duì)PRRSV的抗性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T位點(diǎn)的多態(tài)性與豬體重、豬對(duì)PRRSV的抗性相關(guān)，CC型豬群25、29、32、36、39、46、53、60、67日齡體重均極顯著高于CT型和TT型，CC型豬群接種PRRSV后不同時(shí)間點(diǎn)血液中PRRSV相對(duì)量均低于CT型和TT型，并且在接種PRRSV后第4、7天CC型顯著低于TT型，接種后第11天CC型顯著低于CT型(p＜0.05，表2)，表明CC型豬對(duì)PRRSV具有更高的抗性。該多態(tài)位點(diǎn)可用于豬生長(zhǎng)和PRRSV抗性的輔助選擇，提高選擇的準(zhǔn)確性，同時(shí)可以在豬出生時(shí)就通過(guò)檢測(cè)基因型進(jìn)行選擇，無(wú)需攻毒測(cè)試，加快育種進(jìn)程，降低育種成本，對(duì)PRRSV抗性新品種(系)培育具有重要的價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1豬SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T突變位點(diǎn)測(cè)序圖

圖2豬SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T突變位點(diǎn)電泳分型圖

如圖所示：泳道M為DL500marker，CC、CT、TT分別表示豬SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ酶切后分為CC、CT、TT基因型。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中提到的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，內(nèi)切酶和熒光定量PCR試劑購(gòu)自大連寶生物有限公司，高純總RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，其余試劑購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例1、豬生長(zhǎng)和PRRSV抗性的SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T SNPs分子標(biāo)記選擇方法

材料與方法：

(一)豬群

88頭健康的大白姜曲海雜交豬(不接種任何疫苗)來(lái)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，經(jīng)PCR檢測(cè)血液中無(wú)PRRSV，經(jīng)ELISA檢測(cè)血液中無(wú)PRRSV抗體。

(二)方法

1、豬對(duì)PRRSV抗性的測(cè)試方法

25日齡仔豬測(cè)體溫、稱重、采血，每頭豬耳根肌肉注射高致病性PRRSV NJGC株(TCID₅₀為10^-6.88/0.1mL)2mL，分別在29(接毒后4天)、32(接毒后7天)、36(接毒后11天)、39(接毒后14天)、46(接毒后21天)、53(接毒后28天)、60(接毒后35天)、67日齡(接毒后42天)測(cè)量體溫、體重、采集血液(肝素鈉抗凝)2mL，提取總RNA，以管家基因β‐actin為內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定PRRSV-N基因的絕對(duì)量或者相對(duì)量，本案例中以ln2^-△△CT表示病毒載量。

2、DNA的提取

采用常規(guī)酚、氯仿法提取DNA，采用電泳及測(cè)定OD₂₆₀/₂₈₀檢測(cè)DNA質(zhì)量。

3、總RNA提取

本案例中以全血提取總RNA，采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司高純總RNA快速提取試劑盒。提取方法參照試劑盒使用手冊(cè)，略作修改。200μL抗凝血加入600μL裂解液RL混勻，其余操作同試劑盒說(shuō)明書(shū)。采用電泳及測(cè)定OD₂₆₀/₂₈₀檢測(cè)RNA質(zhì)量。

4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)

總RNA參照RT Master Mix(TAKARA公司)試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中PRRSV NJGC株序列(EF534357)利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(序列為P3：TCGCCCAACAAAACCAGT(SEQ ID NO.3)，P4：TTACCCTCCCTGAATCTGACA(SEQ ID NO.4))，根據(jù)GenBank中β-actin序列(AY550069)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(序列為P5：CCAAAGCCAACCGTGAGAA(SEQ ID NO.5)，P6：CCAGAGGCGTACAGGGACA(SEQ ID NO.6))，使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(TAKARA公司)，以管家基因β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)PRRSV N基因的mRNA水平表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。

在避光環(huán)境、冰上進(jìn)行操作，20μL Real-time PCR反應(yīng)體系為：10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、0.8μL上游引物(10μM)、0.8μL下游引物(10μM)、0.4μLROX Reference Dye II(50×)、2μL cDNA模板、6μL ddH₂O。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)。每個(gè)樣本三次重復(fù)取平均值，使用ln2^-△△CT法計(jì)算PRRSV N基因的相對(duì)量作為病毒載量。

5、SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T位點(diǎn)序列的擴(kuò)增

根據(jù)genebank序列NC_010449.4，利用Primer Primer 5設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(序列為P1：TTCGGTATGTGGGTGGAGGAGGGCCACGGTA(SEQ ID NO.1)，P2：TGGCAACTCCCCTCCTTCCCCACCC(SEQ ID NO.2))，PCR擴(kuò)增SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)序列(序列NC_010449.4，20052～20298bp區(qū)域)。

PCR反應(yīng)總體系20μL，模板DNA 15-100ng，5U/μL Taq聚合酶0.2μL，10mM的dNTP0.5μL，引物P1和P2各5pmol，25mM的MgCl₂ 1.4μL，10×緩沖液2μL，加滅菌雙蒸水至20μL；所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

6、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的KpnⅠ酶切分型。酶切的反應(yīng)體系為10-16μL，PCR產(chǎn)物3-5μL，10U/μL KpnⅠ酶0.2-0.5μL，10×緩沖液1.0-1.6μL，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至10-16μL；37℃酶切3-5h。3％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

7、SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T位點(diǎn)不同基因型豬群間體重、PRRSV抗性的差異顯著性分析，采用SPSS 10中的One-way ANOVA方法進(jìn)行。

(三)結(jié)果與分析

1、SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T位點(diǎn)KpnⅠ酶切多態(tài)性

88個(gè)樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ酶切出現(xiàn)3種基因型，獲得216bp、31bp(圖1，31bp片段由于分子量太小，電泳圖未顯示)兩個(gè)片段的定義為CC型；獲得247bp、216bp、31bp(同上)三個(gè)片段的定義為CT型，獲得247bp片段的定義為T(mén)T型。

2、SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T位點(diǎn)不同基因型豬群間體重差異顯著性分析

采用單因素方差分析比較不同基因型豬群間體重的差異發(fā)現(xiàn)，CC型豬群25、29、32、36、39、46、53、60、67日齡體重均極顯著高于CT型和TT型(p＜0.01，表1)。

表1 SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58bp位點(diǎn)不同基因型雜交豬群體重變化

注:同行不同大寫(xiě)字母上標(biāo)表示差異極顯著(p<0.01)。

3、SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58C/T位點(diǎn)不同基因型豬群間PRRSV抗性的差異顯著性分析

采用單因素方差分析比較不同基因型豬群接毒后血液中PRRSV相對(duì)量的差異發(fā)現(xiàn)，CC型豬群接種PRRSV后不同時(shí)間點(diǎn)血液中PRRSV相對(duì)量均低于CT型和TT型，并且在接種PRRSV后第4、7天CC型顯著低于TT型，接種后第11天CC型顯著低于CT型(p＜0.05，表2)，表明CC型豬對(duì)PRRSV具有更高的抗性。

表2 SLA-DRB1基因啟動(dòng)子區(qū)-58bp位點(diǎn)不同基因型雜交豬群接毒后血液中PRRSV相對(duì)量

注:同行不同小寫(xiě)字母上標(biāo)表示差異顯著(p＜0.05)。

綜合分析以上結(jié)果可以看出，CC型豬在體重和對(duì)PRRSV的抗性方面均具有優(yōu)勢(shì)，可以作為豬生長(zhǎng)和PRRSV抗性性狀選擇的分子標(biāo)記，在留種時(shí)選擇CC型個(gè)體。