本發(fā)明涉及腫瘤基因領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測胰腺癌的引物組及檢測方法。
背景技術(shù)：
：胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，位居美國癌癥死亡原因的第四位在世界范圍也是最致命的惡性腫瘤之一。在我國胰腺癌的死亡率在第7到第8位。近三十年來，胰腺癌的年生存率僅2％從提高至6％，而同一時期，所有部位腫瘤的5年生存率從49％提高到68％，一些癌癥的生存率能達(dá)到甚至90％以上。胰腺解剖部位隱匿，胰腺癌難以早期發(fā)現(xiàn)確診，病人出現(xiàn)臨床癥狀時己經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，難以手術(shù)切除。胰腺癌由于其本身的高度侵襲性和對化療藥物的耐藥性，傳統(tǒng)的手術(shù)及放化療手段難以進(jìn)行根治，因此具有較高死亡率。此外，胰腺癌的發(fā)生率呈逐年上升趨勢，近來一份報告預(yù)測，根據(jù)目前的趨勢，到年胰腺癌將成為美國癌癥相關(guān)死亡的第二大常見的原因。尋找參與胰腺癌發(fā)生發(fā)展，尤其是與胰腺癌早期診斷及預(yù)后相關(guān)的新的生物學(xué)指標(biāo)，對于早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌并改善胰腺癌患者的預(yù)后具有重要意義。近來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CirculatingTumorCells，CTCs)檢測的出現(xiàn)給患者的檢測帶來了新的希望。CTCs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學(xué)標(biāo)本如骨髓等相比，外周血標(biāo)本容易獲取，且對患者創(chuàng)傷小，是臨床上常規(guī)檢測較為理想的標(biāo)本來源。CTCs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個體化治療方案。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，CTCs檢測可更加敏感地發(fā)現(xiàn)疾病的變化，且對患者沒有副作用。CTC的檢測通常通過抽取一定體積的血液進(jìn)行。檢測分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測和先捕獲(富集)后檢測，其中后者為主流的檢測方法。先捕獲(富集)后檢測的方法也分為兩類，即正選和負(fù)選。正選主要是通過CTC表面標(biāo)志物或細(xì)胞的物理性質(zhì)(大小、密度)進(jìn)行捕獲；前者是基于免疫磁球技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，后者是基于過濾、離心的原理。負(fù)選則是通過白細(xì)胞表面標(biāo)志物間接捕獲CTC。然而基于先捕獲(富集)后檢測的方法有著明顯的缺陷。它嚴(yán)重依賴于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，因此無法捕獲未表達(dá)表面腫瘤標(biāo)記物的CTC細(xì)胞。采用RT-PCR的方法檢測CTC細(xì)胞的特異性基因是CTC細(xì)胞檢測的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過密度梯度離心的方式富集CTCs，然后通過RT-PCR的方式檢測特定基因的mRNA，以此判斷CTCs是否存在，并通過檢測CT值的變化給CTCs定量。這種方法檢測CTCs費用低，敏感度高，而且容易自動化。目前RT-PCR方法檢測胰腺癌CTCs的檢測標(biāo)準(zhǔn)還沒有建立。我們通過檢測胰腺癌患者的CTCs特征基因，確定胰腺癌CTCs的檢測方法和檢測標(biāo)準(zhǔn)。這些檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評估抗腫瘤藥物(包括NK和CAR-T免疫治療)的療效及制定個體化治療方案。針對上述問題，本發(fā)明開發(fā)一種高靈敏的多基因聯(lián)合檢測方法，通過聯(lián)合檢測CK18、CK20、CEA、Vimentin、MUC1、Epcam、Birc5、EGFR和C-met9個基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤的早期檢測。本發(fā)明設(shè)計和運用靶特異性引物組，大幅度提高檢測的靈敏度。該檢測方法的檢出率可達(dá)到95％，同時具備了靈敏度高，特異性好，快速準(zhǔn)確等優(yōu)點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測胰腺癌的引物組及檢測方法，本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種用于檢測胰腺癌的引物組，包含：本發(fā)明的引物組可通過以下兩種方法實現(xiàn)胰腺癌的檢測。方法1：PCR方法。(1)將權(quán)利要求1所述的9對引物分別加入到單個PCR反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反應(yīng)的每個循環(huán)的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測。方法2：熒光定量PCR方法(1)將權(quán)利要求1所述的9對引物分別加入到單個PCR反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；分別加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反應(yīng)的每個循環(huán)的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個循環(huán)；每管設(shè)立三個復(fù)孔；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，并實時檢測熒光；(3)根據(jù)熒光檢測結(jié)果計算出的Ct值，判斷是否有標(biāo)志物靶基因表達(dá)于樣品中。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過設(shè)計特異性PCR引物，開發(fā)出用于胰腺癌早期檢測的多基因聯(lián)合檢測方法。此方法：(1)建立的PCR體系可對CK18、CK20、CEA、Vimentin、MUC1、Epcam、Birc5、EGFR和C-met基因進(jìn)行聯(lián)合檢測；(2)通過同時對多個基因進(jìn)行檢測胰腺癌檢出率可達(dá)到98％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達(dá)水平均可檢出；(4)特異性強，正常人或非胰腺癌病人樣本不會產(chǎn)生非特異性信號；(5)檢測速度快，操作簡單，費用低廉。附圖說明圖1為實施例中健康人外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖2為實施例中非胰腺癌患者外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖3為實施例中非胰腺癌患者癌組織檢測陰性PCR圖。圖4為實施例中胰腺癌患者外周血檢測陽性PCR圖。圖5為實施例中胰腺癌患者腫瘤組織檢測陽性PCR圖。圖中，M.100bpmarker；1.B2M；2.CK18；3.CK20；4.CEA；5.Vimentin；6.MUC1；7.Epcam；8.Birc5；9.EGFR；10.C-met。具體實施方式本發(fā)明針對目前胰腺癌中的腫瘤驅(qū)動基因，通過聯(lián)合檢測CK18、CK20、CEA、Vimentin、MUC1、Epcam、Birc5、EGFR和C-met9個基因?qū)崿F(xiàn)胰腺癌的早期檢測。針對目前檢測方法靈敏度低，檢測過程復(fù)雜繁瑣，檢測所需時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。針對上述問題，設(shè)計出用于檢測上述9個基因的一整套特異性引物組。根據(jù)上述9個基因的參考序列設(shè)計特異性擴增引物，其PCR產(chǎn)物長度最優(yōu)是在180-200bp之間，退火溫度不高于60度，GC含量在40-60％之間，符合一般引物設(shè)計軟件的要求。通過采用實時熒光PCR反應(yīng)檢測體系，實現(xiàn)多個基因聯(lián)合的高靈敏檢測，其檢測方法如下所述。本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進(jìn)一步的說明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實驗指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細(xì)胞實驗指南》(科學(xué)出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實驗技術(shù)手冊》(科學(xué)出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術(shù)》(科學(xué)出版社，北京，中國，1991)等實驗手冊以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來實施。其中，所用的(帶標(biāo)記的)探針、引物可以委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例1:基因選擇多項研究表明，單基因篩查敏感度約為20-60％，大部分用于腫瘤早期篩查的單個基因檢測，其檢測敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯(lián)合檢測可以有效解決敏感度低的問題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準(zhǔn)確度。ZhouJ等人(ZhouJ,HuL,YuZ,etal.Markerexpressionincirculatingcancercellsofpancreaticcancerpatients.JSurgRes2011；171:631–6.)同時檢測hTERT、CK20、C-met、CEA基因，結(jié)果表明聯(lián)合檢測四個基因用于胰腺癌早期診斷的敏感度遠(yuǎn)高于單基因檢測。為了提高早期腫瘤的檢出率，提高腫瘤患者的治愈率，改善病人預(yù)后，我們對胰腺癌和正常組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。我們通過大量比對實驗發(fā)現(xiàn)CK18、CK20、CEA、Vimentin、MUC1、Epcam、Birc5、EGFR和C-met組成的基因組對胰腺癌具有較高的檢出率，達(dá)到98％，相對于現(xiàn)有的檢測技術(shù)，產(chǎn)生了意想不到的技術(shù)效果，具有顯著的進(jìn)步。實施例2:引物篩選(1)設(shè)計引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具體為：利用生物信息學(xué)軟件對靶基因A-I序列進(jìn)行分析，利用序列分析軟件設(shè)計特異性引物組，利用NCBI引物搜索軟件檢測各配對引物在人基因組中的特異性，分別設(shè)計出3對特異性擴增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；表1：PCR檢測引物(2)外周血樣品的處理收集某醫(yī)院收治并經(jīng)病理證實的胰腺癌患者外周血，清晨7點，空腹，經(jīng)肘靜脈采集新鮮血液，存放于抗凝管中，搖勻，常溫下保存≤4hr。2.1將抗凝管中的全血樣本加入等體積PBS(pH7.0)，于室溫3000rpm離心5min，去除上層血漿；2.2加入等體積氯化銨紅細(xì)胞裂解液(可購自碧云天)，于室溫200rpm離心8min混勻后，以3000rpm室溫離心5min，棄去上清；2.3將下層血細(xì)胞和生理鹽水按照體積比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分離液，混合液與Ficoll分離液的體積比為1:2～2:1，離心力為700g，離心20～40min；2.4吸棄上清，取細(xì)胞沉淀，洗滌，即得到PBMC；2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保護劑重懸，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混勻；3.2將裂解液轉(zhuǎn)移至gDNA清除離心型柱中，8000×g(10,000rpm)離心30s。收集流穿液，棄離心柱；3.3加入1倍體積的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混勻；3.4將樣品轉(zhuǎn)移至RNeasyMinElute離心柱，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.5在RNeasyMinElute離心柱中加入700μLBufferRW1，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.6在RNeasyMinElute離心柱中加入500μLBufferRPE，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.7將RNeasyMinElute離心柱置于新的2mL收集管中，打開蓋子，全速離心5min，使乙醇揮發(fā)；3.8將RNeasyMinElute離心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，蓋緊蓋子，全速離心1min洗脫RNA。(4)模板cDNA的獲得4.1準(zhǔn)確測得樣品RNA濃度；4.2嚴(yán)格按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在冰上制備反轉(zhuǎn)錄體系；成分體積5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL4.3輕柔混勻以上反應(yīng)體系，并利用離心機短暫離心，55度20min，85度2min，獲得模板cDNA；(5)普通PCR擴增用TaqDNA聚合酶配置反應(yīng)體系，用引物為a-i和人內(nèi)參基因(B2M)進(jìn)行PCR擴增各樣品，產(chǎn)物用1％凝膠檢測；擴增體系成分體積2×Mix10μLcDNA1μL引物-F0.8μL引物-R0.8μLRNase-freeH2O7.4μLPCR反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性3分鐘，1個循環(huán)；95℃變性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。(6)熒光實時定量PCR擴增根據(jù)設(shè)計的特異引組a-i，通過熒光定量PCR進(jìn)行擴增，體系如下：成分體積2×ChamQSYBRqPCRMasterMix10μLcDNA2μL引物-F0.4μL引物-R0.4μLRNase-freeH2O7.2μLTotal20μL95℃預(yù)變性20s，1個循環(huán)；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)；每管設(shè)立三個復(fù)孔；根據(jù)步驟5和6的pcr結(jié)果，篩選出以下引物組，作為本發(fā)明用于檢測胰腺癌的引物組。實施例3：效果驗證根據(jù)實施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對200個腫瘤樣本進(jìn)行檢測。其中，CK8的正向引物為CGCCTGGAAGGGCTGACCGA，反向引物為GTTGGCAATATCCTCGTACT；N-cadherin的正向引物為CCTTAACTGAGGAGTCAGTG，反向引物為CAGACCTGATCCTGACAAGC；VEGF的正向引物為GTGCCCGCTGCTGTCTAATG，反向引物為CACATCTGCAAGTACGTTCG；VEGFR2的正向引物為GAGAAGCAGAGCCATGTGGT，反向引物為GCACTCTTCCTCCAACTGCC。1～9號引物組的檢出率如上表所示，從表中可以看出，引物組中，隨著引物數(shù)量的增加，在一定程度上可以提高其檢出率。進(jìn)一步地，通過比較5～9號引物組可以發(fā)現(xiàn)，引物組內(nèi)的組合對于檢出率的高低有重要影響。同時在相同的檢測基因數(shù)量情況下，5號引物組的檢出率高于6～9號引物組。因此，我們優(yōu)選5號引物組的基因組合用于胰腺癌的檢測。進(jìn)一步通過研究發(fā)現(xiàn)，5號引物組中，CK18、CK20的表達(dá)可提示上皮細(xì)胞來源的腫瘤；表皮生長因子受體(EGFR)在眾多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，成為目前腫瘤研究新熱點之一；C-met作為受體酪氨酸激酶與腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡相關(guān)；Vimentin是正常間葉細(xì)胞及其來源的腫瘤標(biāo)記物，與參與到EMT過程中，且發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用；EPCAM屬于上皮細(xì)胞粘附分子，在上皮癌變過程中發(fā)揮著作用；Birc5是凋亡抑制蛋白，在腫瘤中異常表達(dá)；MUC1在炎癥和腫瘤的進(jìn)展中起著重要的作用；CEA是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物。由上可知，本發(fā)明并不是將9對引物進(jìn)行簡單疊加組合，9對引物相鋪相成，在功能上彼此支持，使得檢出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技術(shù)效果。綜上所述，本發(fā)明中選擇的基因涉及腫瘤的代謝、增殖、侵襲等方面，可較為全面的檢測出胰腺癌的細(xì)胞生物學(xué)特征。實施例4：特異性分析根據(jù)實施例2的篩選結(jié)果，采用上表所述的引物組對正常人外周血樣本(圖1)、非胰腺癌病人的外周血(圖2)和腫瘤組織樣本(圖3)、胰腺癌病人的外周血(圖4)和腫瘤樣本(圖5)進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖1-5所示，從圖中可見所述的引物組在正常人外周血(圖1)、非胰腺癌病人的外周血(圖2)和腫瘤組織樣本(圖3)中檢測到基因的低表達(dá)或不表達(dá)。在胰腺癌病人的外周血(圖4)和腫瘤組織中(圖5)可檢測到多個基因的表達(dá)，分別為5/9和6/9，說明本發(fā)明中所述引物組具有高度的特異性。當(dāng)前第1頁1 2 3