本申請大體涉及抗體藥物領(lǐng)域，具體而言，本申請?zhí)峁┝诵滦碗p特異性抗體及其醫(yī)學(xué)和生物學(xué)用途。
背景技術(shù)：
：雙特異性抗體(bispecificantibody，BsAb)是一類人工抗體，其包含兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙特異性抗體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是腫瘤免疫治療方面應(yīng)用廣泛。雙特異性抗體從作用機(jī)制上可分為雙重信號阻斷型和介導(dǎo)細(xì)胞功能型。通常，介導(dǎo)細(xì)胞功能型雙特異性抗體指介導(dǎo)T細(xì)胞殺傷的抗CD3雙特異性抗體。1985年，利用T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的概念就已被提出(Stearzatal.Nature1985，314：628-631)。通常認(rèn)為有效激活T細(xì)胞需要雙重信號，第一信號來自抗原呈遞細(xì)胞上MHC-抗原復(fù)合物與T細(xì)胞受體TCR-CD3的結(jié)合，第二信號為T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子相互作用后產(chǎn)生的非抗原特異性共刺激信號。由于多數(shù)癌細(xì)胞表面MHC的表達(dá)下調(diào)甚至缺失，從而使癌細(xì)胞逃逸免疫殺傷。靶向CD3的雙特異性抗體則能夠分別結(jié)合T細(xì)胞表面CD3分子和癌細(xì)胞表面抗原，從而拉近細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTcell，Tc或CTL)與癌細(xì)胞的距離，引導(dǎo)T細(xì)胞直接殺傷癌細(xì)胞，而不再依賴于T細(xì)胞的雙重激活信號。雙特異性抗體可以是三功能抗體，即一條臂靶向腫瘤細(xì)胞上的抗原，另一條臂靶向T細(xì)胞的CD3分子，F(xiàn)c段結(jié)合Fc受體。這種抗體使得T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和結(jié)合抗體Fc結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)細(xì)胞形成復(fù)合體(MullerandKontermann，BioDrugs2010；24：89-98)。CD3分子有δ、ε、γ、ζ共4個(gè)亞基，分子量分別為18.9kDa、23.1kDa、20.5kDa、18.7kDa，各包括171個(gè)、207個(gè)、182個(gè)和164個(gè)氨基酸殘基。四種亞基組成的6條多肽鏈與T細(xì)胞受體(Tcellreceptor，TCR)緊密結(jié)合，形成包含8條多肽鏈的TCR-CD3復(fù)合物，該復(fù)合物傳導(dǎo)T細(xì)胞激活信號，穩(wěn)定TCR結(jié)構(gòu)。CD3的胞內(nèi)部分含有免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，ITAM)，TCR識別和結(jié)合MHC分子呈遞的抗原肽，使得T細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷酸化CD3分子中ITAM的酪氨酸殘基，之后募集含有SH2(Scrhomology2)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM磷酸化和結(jié)合ZAP-70是T細(xì)胞激活早期信號傳導(dǎo)過程的重要生化反應(yīng)之一。因此，CD3分子有傳導(dǎo)TCR識別抗原產(chǎn)生的激活信號的功能。抗CD3E抗體能結(jié)合T細(xì)胞表面TCR受體復(fù)合物中的CD3E亞基，能夠提供T細(xì)胞激活的第一信號(類似于抗原遞呈細(xì)胞上的MHC-肽復(fù)合物結(jié)合到TCR)，有利于T細(xì)胞的激活。而且包含針對CD3E的的抗原結(jié)合部的雙特異性抗體，可以實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞周邊的富集，提高T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率。由于早期在免疫原性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及抗體質(zhì)量控制等方面的不足，限制了雙特異性抗體的進(jìn)一步發(fā)展。近年來，上游基因工程抗體和下游生產(chǎn)工藝技術(shù)的改進(jìn)，克服了傳統(tǒng)雙特異性抗體的缺陷，從而推動了多類新型雙特異性抗體進(jìn)入臨床開發(fā)階段。為了解決將兩個(gè)不同的半抗體進(jìn)行正確裝配的問題，設(shè)計(jì)開發(fā)了多種結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體。一類雙特異性抗體不含F(xiàn)c區(qū)。這類結(jié)構(gòu)抗體的優(yōu)點(diǎn)是分子量小，可以在原核細(xì)胞中表達(dá)，不需要考慮正確裝配的問題；缺點(diǎn)是由于沒有抗體Fc段，不能介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)功能，而且半衰期短，因而臨床應(yīng)用受到一定限制。目前已有報(bào)道的此類雙特異性抗體包括BiTE、DART、TrandAbs、bi-Nanobody等。德國Micromet公司開發(fā)的BiTE(bispecificT-cellengager)系列產(chǎn)品是將抗CD3scfv與不同抗腫瘤細(xì)胞表面抗原scfv通過肽段進(jìn)行連接獲得的，可同時(shí)結(jié)合CD3+T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。此類抗體克服了穩(wěn)定性差、表達(dá)量低、溶解性低等生產(chǎn)問題，其中Blinatumomab已成功上市。另一類是保留抗體Fc結(jié)構(gòu)域的抗體。此類抗體形成IgG樣結(jié)構(gòu)，具有Fc介導(dǎo)的生物學(xué)功能。此類雙特異性抗體主要有Triomabs、kihIgG、Cross-mab、orthoFabIgG、DVDIgG、IgGscFv、scFv2-Fc等。這些包含F(xiàn)c段的雙特異性抗體，都具有體內(nèi)半衰期長，能夠介導(dǎo)ADCC和CDC等優(yōu)點(diǎn)。HER2基因位于人17q21染色體，編碼分子量185kD的跨膜蛋白，該蛋白有酪氨酸激酶活性，正常狀態(tài)下以無活性形式存在，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞正常分化，通常只在嬰兒期表達(dá)，成人只在少數(shù)組織中低水平表達(dá)。HER2基因在正常細(xì)胞中是雙拷貝基因，通過基因突變激活，其擴(kuò)增導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄上調(diào)，蛋白表達(dá)增加。HER2是人表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)家族的第二個(gè)成員，屬于I型受體酪氨酸激酶家族，在許多正常和異常表皮細(xì)胞的生長、分化和代謝過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和疾病狀態(tài)都與HER2相關(guān)。該家族共有4種受體，分別命名為HER1、HER2、HER3和HER4，這些受體相互作用形成同源或異源二聚體，尤以HER2異二聚體為主，在細(xì)胞的信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。HER2激活抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；上調(diào)VEGF/VPF，加速腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，破壞組織抗侵襲功能(ArtufelMV，ValeroAC，LladoRR，etal.ClinTranslOncol，2005，7.(11)：504-511)。HER2蛋白過表達(dá)對誘導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖和轉(zhuǎn)化以及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲和粘附具有重要作用(HynesNE，StemDF.BiochemBiophysAcTa，1994，1198(2-3)：165-184.)。由于在20％的乳腺癌病例中過表達(dá)，而且與不良預(yù)后相關(guān)，因此HER2在乳腺癌中的作用格外受到關(guān)注(Reeseetal.，StemCells1997；15：1-8；Andrecheketal.，ProcNatlAcadSciUSA2000；97：3444-3449.Slamonetal.，Science1987；235：177-182)。因而，靶向CD3和/或HER2的雙特異性抗體會在腫瘤治療中有良好的應(yīng)用前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：第一方面，本申請?zhí)峁╇p特異性人IgG1抗體，其包含針對人CD3E的抗原結(jié)合部，所述針對人CD3E的抗原結(jié)合部包含：如SEQIDNO：3所示的HCDR1，如SEQIDNO：4所示的HCDR2，如SEQIDNO：5所示的HCDR3，如SEQIDNO：6所示的LCDR1，如SEQIDNO：7所示的LCDR2，和如SEQIDNO：8所示的LCDR3；其中HCDR和LCDR根據(jù)Kabat定義。第二方面，本申請?zhí)峁╇p特異性人IgG1抗體，其包含針對HER2的抗原結(jié)合部，所述針對HER2的抗原結(jié)合部包含：如SEQIDNO：9所示的HCDR1，如SEQIDNO：10所示的HCDR2，如SEQIDNO：11所示的HCDR3，如SEQIDNO：6所示的LCDR1，如SEQIDNO：7所示的LCDR2，和如SEQIDNO：8所示的LCDR3；其中HCDR和LCDR根據(jù)Kabat定義。第三方面，本申請?zhí)峁╇p特異性人IgG1抗體，其包含針對人CD3E的抗原結(jié)合部和針對HER2的抗原結(jié)合部，所述針對人CD3E的抗原結(jié)合部包含：如SEQIDNO：3所示的HCDR1，如SEQIDNO：4所示的HCDR2，如SEQIDNO：5所示的HCDR3，如SEQIDNO：6所示的LCDR1，如SEQIDNO：7所示的LCDR2，和如SEQIDNO：8所示的LCDR3；并且所述針對HER2的抗原結(jié)合部包含：如SEQIDNO：9所示的HCDR1，如SEQIDNO：10所示的HCDR2，如SEQIDNO：11所示的HCDR3，如SEQIDNO：6所示的LCDR1，如SEQIDNO：7所示的LCDR2，和如SEQIDNO：8所示的LCDR3；其中HCDR和LCDR根據(jù)Kabat定義。在第一和第三方面的一些實(shí)施方案中，針對人CD3E的抗原結(jié)合部包含如SEQIDNO：12所示的重鏈可變區(qū)和如SEQIDNO：13所示的輕鏈可變區(qū)。在第二和第三方面的一些實(shí)施方案中，針對HER2的抗原結(jié)合部包含SEQIDNO：14所示的重鏈可變區(qū)和如SEQIDNO：13所示的輕鏈可變區(qū)。在上述任一方面的一些實(shí)施方案中，針對HER2的抗原結(jié)合部為單鏈抗體(scfv)或Fab片段。在上述任一方面的一些實(shí)施方案中，針對人CD3E的抗原結(jié)合部為單鏈抗體(scfv)或Fab片段。在上述任一方面的一些實(shí)施方案中，雙特異性人IgG1抗體具有第一臂和第二臂，其中第一臂和第二臂具有選自以下的結(jié)構(gòu)：(1)第一臂包含單鏈抗體(scfv)形式的針對HER2的抗原結(jié)合部，第二臂包含單鏈抗體(scfv)形式的針對人CD3E的抗原結(jié)合部，其中第一臂包含如SEQIDNO：15所示的氨基酸序列并且第二臂包含如SEQIDNO：16所示的氨基酸序列，或者第一臂包含如SEQIDNO：21所示的氨基酸序列并且第二臂包含如SEQIDNO：22所示的氨基酸序列；(2)第一臂包含F(xiàn)ab片段形式的針對HER2的抗原結(jié)合部，第二臂包含單鏈抗體(scfv)形式的針對人CD3E的抗原結(jié)合部，其中第一臂包含如SEQIDNO：17的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，并且第二臂包含如SEQIDNO：16所示的氨基酸序列，或者第一臂包含如SEQIDNO：20的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，并且第二臂包含如SEQIDNO：16所示的氨基酸序列，或者第一臂包含如SEQIDNO：23的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，并且第二臂包含如SEQIDNO：22所示的氨基酸序列，或者第一臂包含如SEQIDNO：25的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，并且第二臂包含如SEQIDNO：22所示的氨基酸序列；(3)第一臂包含單鏈抗體(scfv)形式的針對HER2的抗原結(jié)合部，第二臂包含F(xiàn)ab片段形式的針對人CD3E的抗原結(jié)合部，其中第一臂包含如SEQIDNO：15所示的氨基酸序列并且第二臂包含如SEQIDNO：19的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，或者第一臂包含如SEQIDNO：21所示的氨基酸序列并且第二臂包含如SEQIDNO：24的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列；(4)第一臂包含F(xiàn)ab片段形式的針對HER2的抗原結(jié)合部，第二臂包含F(xiàn)ab片段形式的針對人CD3E的抗原結(jié)合部，其中第一臂包含如SEQIDNO：17的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的的氨基酸序列并且第二臂包含如SEQIDNO：19的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，或第一臂包含如SEQIDNO：20的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的的氨基酸序列并且第二臂包含如SEQIDNO：19的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，或第一臂包含如SEQIDNO：23的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的的氨基酸序列并且第二臂包含如SEQIDNO：24的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，或第一臂包含如SEQIDNO：25的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的的氨基酸序列并且第二臂包含如SEQIDNO：24的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列，或第一臂包含如SEQIDNO：26的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的的氨基酸序列并且第二臂包含如SEQIDNO：27的氨基酸序列和如SEQIDNO：18所示的氨基酸序列。在上述任一方面的一些實(shí)施方案中，雙特異性人IgG1抗體包含兩種具有相同鉸鏈區(qū)的Fc片段，所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO：29、SEQIDNO：1或SEQIDNO：28所示，當(dāng)所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：28所示時(shí)，其替換天然人IgG1抗體恒定區(qū)的第216-230位序列，抗體恒定區(qū)氨基酸位置按照EUnumbering確定。第四方面，本申請?zhí)峁┧幬锝M合物，其包含第一至第三方面中任一方面所述的雙特異性人IgG1抗體。第五方面，本申請?zhí)峁┑谝恢恋谌矫嬷腥我环矫嫠龅碾p特異性人IgG1抗體或者第四方面所述的藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的用途。第六方面，本申請?zhí)峁┝祟A(yù)防或治療腫瘤的方法，包括向有需要的個(gè)體給予第一至第三方面中任一方面所述的雙特異性人IgG1抗體或者第四方面所述的藥物組合物。附圖說明圖1a-圖1d為本申請?jiān)O(shè)計(jì)的四種不同結(jié)構(gòu)雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2顯示了采用ELISA方法檢測各種雙特異性抗體同時(shí)結(jié)合CD3E和HER2兩種抗原的結(jié)果。圖3顯示了利用流式細(xì)胞術(shù)分析各種雙特異性抗體與MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞表面HER2結(jié)合的結(jié)果。圖4顯示了利用流式細(xì)胞術(shù)分析各種雙特異性抗體與PBMC表面CD3結(jié)合的結(jié)果。圖5a-5g顯示了不同雙特異性抗體對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用結(jié)果，其中圖5a顯示了雙特異性抗體對HER2陽性細(xì)胞的殺傷結(jié)果；圖5b顯示了雙特異性抗體對HER2陰性細(xì)胞的殺傷結(jié)果；圖5c-圖5e顯示了雙特異性抗體的不同鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)對殺傷活性的影響；圖5f和圖5g為雙特異性抗體的不同抗原結(jié)合部設(shè)計(jì)對殺傷活性的影響。圖6a-6c顯示了不同雙特異性抗體介導(dǎo)HER2陽性靶細(xì)胞(MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞)對T細(xì)胞的激活，其中圖6a和圖6b顯示了不同雙特異性抗體激活T細(xì)胞表達(dá)早期活化標(biāo)志分子CD69的結(jié)果；圖6c顯示了不同雙特異性抗體誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2的結(jié)果。序列說明SEQIDNO：1為本申請的示例性雙特異性抗體包含的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列，其為天然的人IgG2抗體的鉸鏈區(qū)。SEQIDNO：2為天然的人IgG1抗體恒定區(qū)CH1片段的氨基酸序列。SEQIDNO：3為本申請的示例性抗人CD3E單克隆抗體的HCDR1的氨基酸序列。SEQIDNO：4為本申請的示例性抗人CD3E單克隆抗體的HCDR2的氨基酸序列。SEQIDNO：5為本申請的示例性抗人CD3E單克隆抗體的HCDR3的氨基酸序列。SEQIDNO：6為本申請的示例性抗人CD3E單克隆抗體和抗HER2單克隆抗體的LCDR1的氨基酸序列。SEQIDNO：7為本申請的示例性抗人CD3E單克隆抗體和抗HER2單克隆抗體的LCDR2的氨基酸序列。SEQIDNO：8為本申請的示例性抗人CD3E單克隆抗體和抗HER2單克隆抗體的LCDR3的氨基酸序列。SEQIDNO：9為本申請的示例性抗HER2單克隆抗體的HCDR1的氨基酸序列。SEQIDNO：10為本申請的示例性抗HER2單克隆抗體的HCDR2的氨基酸序列。SEQIDNO：11為本申請的示例性抗HER2單克隆抗體的HCDR3的氨基酸序列。SEQIDNO：12為本申請的示例性抗人CD3E單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。SEQIDNO：13為本申請的示例性抗人CD3E單克隆抗體和抗HER2單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。SEQIDNO：14為本申請的示例性抗HER2單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。SEQIDNO：15為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗HER2scfv的臂(抗HER2scfv-Fc融合蛋白)的氨基酸序列。SEQIDNO：16為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗人CD3Escfv的臂(抗人CD3Escfv-Fc融合蛋白)的氨基酸序列。SEQIDNO：17為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗HER2Fab的臂的重鏈部分的氨基酸序列。SEQIDNO：18為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗HER2Fab或含抗人CD3EFab的臂的輕鏈部分的氨基酸序列。SEQIDNO：19為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗人CD3EFab的臂的重鏈部分的氨基酸序列。SEQIDNO：20為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗HER2Fab的臂的重鏈部分的氨基酸序列。SEQIDNO：21為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗HER2scfv的臂(抗HER2scfv-Fc融合蛋白)的氨基酸序列。SEQIDNO：22為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗人CD3Escfv的臂(抗人CD3Escfv-Fc融合蛋白)的氨基酸序列。SEQIDNO：23為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗HER2Fab的臂的重鏈部分的氨基酸序列。SEQIDNO：24為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗人CD3EFab的臂的重鏈部分的氨基酸序列。SEQIDNO：25為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗HER2Fab的臂的重鏈部分的氨基酸序列。SEQIDNO：26為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗HER2Fab的臂的重鏈部分的氨基酸序列。SEQIDNO：27為本申請的示例性雙特異性抗體的含抗人CD3EFab的臂的重鏈部分的氨基酸序列。SEQIDNO：28為本申請的示例性雙特異性抗體包含的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列，其為天然的人IgG2抗體的鉸鏈區(qū)的變體。SEQIDNO：29為本申請的示例性雙特異性抗體包含的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列，其為天然的人IgG1抗體的鉸鏈區(qū)。SEQIDNO：30為本申請的示例性雙特異性抗體包含的Fab片段中的CH1片段的氨基酸序列。SEQIDNO：31為本申請的示例性雙特異性抗體包含的Fc片段中的CH2片段的氨基酸序列。SEQIDNO：32為人CD3E胞外區(qū)(CD3E)的氨基酸序列。SEQIDNO：33為人CD3D胞外區(qū)(CD3D)的氨基酸序列。SEQIDNO：34為猴CD3E胞外區(qū)(mfCD3E)的氨基酸序列。SEQIDNO：35為猴CD3D胞外區(qū)(mfCD3D)的氨基酸序列。SEQIDNO：36為小鼠CD3E胞外區(qū)(mCD3E)的氨基酸序列。SEQIDNO：37為小鼠CD3D胞外區(qū)(mCD3D)的氨基酸序列。SEQIDNO：38為HER2胞外區(qū)D1D2D3部分(HER2)的氨基酸序列。SEQIDNO：39為His標(biāo)簽的氨基酸序列。SEQIDNO：40為鼠抗體IgG2a的Fc片段(mFc)的氨基酸序列。SEQIDNO：41為人IgG1抗體的Fc片段變體(FcK)的氨基酸序列。SEQIDNO：42為人IgG1抗體的Fc片段變體(FcH)的氨基酸序列。SEQIDNO：43為天然的人IgG1抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。SEQIDNO：44為人IgG1抗體重鏈恒定區(qū)的變體(IgG1Hn)的氨基酸序列。SEQIDNO：45為人IgG1抗體重鏈恒定區(qū)的變體(IgG1Kn)的氨基酸序列。SEQIDNO：46為人IgG1抗體重鏈恒定區(qū)的變體(IgG1Hn-m3)的氨基酸序列。SEQIDNO：47為人IgG1抗體重鏈恒定區(qū)的變體(IgG1kn-m3)的氨基酸序列。SEQIDNO：48為人IgG1抗體重鏈恒定區(qū)的變體(IgG1H3n-m3)的氨基酸序列。SEQIDNO：49為人IgG1抗體重鏈恒定區(qū)的變體(IgG1kn1-m3)的氨基酸序列。SEQIDNO：50為人IgG1抗體重鏈恒定區(qū)的變體(IgG1H3n1-m3)的氨基酸序列。SEQIDNO：51為人IgG1抗體κ亞型輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列。發(fā)明詳述定義除非另外指明，本申請中所用的術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義。在本文描述抗體結(jié)構(gòu)時(shí)，涉及氨基酸位置編號的描述參照人IgG1抗體的EUnumbering定義，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知且容易查詢到的。此外，在本文結(jié)合EUnumbering位置描述突變時(shí)，是指相對于天然抗體序列產(chǎn)生的突變。本文所用術(shù)語“Fc片段”、“Fc結(jié)構(gòu)域”、“Fc部分”或類似的術(shù)語是指抗體重鏈恒定區(qū)的一部分，包括鉸鏈區(qū)(hinge)、恒定區(qū)的CH2片段和CH3片段。參照人IgG1抗體的EUnumbering定義，F(xiàn)c片段是抗體恒定區(qū)中第216-447位的氨基酸序列。本文所用術(shù)語“Fab(fragmentantigenbinding)片段”、“Fab部分”或類似的術(shù)語是指完整的抗體用木瓜蛋白酶處理后產(chǎn)生的能夠與抗原結(jié)合的抗體片段，包括完整的輕鏈(VL-CL)、重鏈可變區(qū)和CH1片段(VH-CH1)。本文所用術(shù)語“單鏈抗體(scfv，singlechainfragmentvariable)”是指一般利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的單鏈結(jié)構(gòu)的抗體，包含重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的一條多肽鏈。在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間通常會設(shè)計(jì)一段柔性的連接肽(linker)以便重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以折疊成為能夠結(jié)合抗原的正確構(gòu)象。本文所用術(shù)語“抗原結(jié)合部”指抗體結(jié)構(gòu)中決定抗原結(jié)合能力的部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，抗體結(jié)構(gòu)中決定抗原結(jié)合能力的主要部分是CDR，因此CDR也是抗原結(jié)合部的核心組成部分。在雙特異性抗體構(gòu)建中，“抗原結(jié)合部”包括但不限于Fab片段的形式或單鏈抗體的形式。本文所用術(shù)語“雙特異性抗體”是具有結(jié)合兩種不同抗原能力的抗體，其可以由兩個(gè)Fc片段以及分別與其融合的兩個(gè)抗原結(jié)合部組成。本文所用術(shù)語“雙特異性人IgG1抗體”是指基于人IgG1抗體的雙特異性抗體，并且除了本文說明的改變結(jié)構(gòu)之外，其具備人IgG1抗體的基本特征和功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，互補(bǔ)決定區(qū)(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可變區(qū)中對抗體的親和力和特異性影響最大的區(qū)域。VH或VL的CDR序列有兩種常見的定義方式，即kabat定義和Chothia定義。(參閱例如Kabat，“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest”，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikanietal.，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；以及Martinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：9268-9272(1989))。對于給定抗體的可變區(qū)序列，可以根據(jù)Kabat定義或者Chothia定義來確定VH和VL序列中CDR區(qū)序列。在本申請的實(shí)施方案中，利用Kabat定義CDR序列。對于給定抗體的可變區(qū)序列，可以通過多種方式分析可變區(qū)序列中CDR區(qū)序列，例如可以利用在線軟件Abysis確定(http：//www.abysis.org/)。如本文所用術(shù)語“特異性結(jié)合”，是指兩個(gè)分子之間的非隨機(jī)結(jié)合反應(yīng)，例如抗體至抗原表位的結(jié)合。第一方面，本申請?zhí)峁╇p特異性人IgG1抗體，其包含針對人CD3E的抗原結(jié)合部，所述針對人CD3E的抗原結(jié)合部包含：如SEQIDNO：3所示的HCDR1，如SEQIDNO：4所示的HCDR2，如SEQIDNO：5所示的HCDR3，如SEQIDNO：6所示的LCDR1，如SEQIDNO：7所示的LCDR2，和如SEQIDNO：8所示的LCDR3；其中HCDR和LCDR根據(jù)Kabat定義。第二方面，本申請?zhí)峁╇p特異性人IgG1抗體，其包含針對HER2的抗原結(jié)合部，所述針對HER2的抗原結(jié)合部包含：如SEQIDNO：9所示的HCDR1，如SEQIDNO：10所示的HCDR2，如SEQIDNO：11所示的HCDR3，如SEQIDNO：6所示的LCDR1，如SEQIDNO：7所示的LCDR2，和如SEQIDNO：8所示的LCDR3；其中HCDR和LCDR根據(jù)Kabat定義。第三方面，本申請?zhí)峁╇p特異性人IgG1抗體，其包含針對人CD3E的抗原結(jié)合部和針對HER2的抗原結(jié)合部，所述針對人CD3E的抗原結(jié)合部包含：如SEQIDNO：3所示的HCDR1，如SEQIDNO：4所示的HCDR2，如SEQIDNO：5所示的HCDR3，如SEQIDNO：6所示的LCDR1，如SEQIDNO：7所示的LCDR2，和如SEQIDNO：8所示的LCDR3；并且所述針對HER2的抗原結(jié)合部包含：如SEQIDNO：9所示的HCDR1，如SEQIDNO：10所示的HCDR2，如SEQIDNO：11所示的HCDR3，如SEQIDNO：6所示的LCDR1，如SEQIDNO：7所示的LCDR2，和如SEQIDNO：8所示的LCDR3；其中HCDR和LCDR根據(jù)Kabat定義。在第一和第三方面的一些實(shí)施方案中，針對人CD3E的抗原結(jié)合部包含如SEQIDNO：12(包含如SEQIDNO：3所示的HCDR1、如SEQIDNO：4所示的HCDR2和如SEQIDNO：5所示的HCDR3)所示的重鏈可變區(qū)和如SEQIDNO：13所示的輕鏈可變區(qū)(包含如SEQIDNO：6所示的LCDR1、如SEQIDNO：7所示的LCDR2和如SEQIDNO：8所示的LCDR3)。在第二和第三方面的一些實(shí)施方案中，針對HER2的抗原結(jié)合部包含SEQIDNO：14(包含如SEQIDNO：9所示的HCDR1、如SEQIDNO：10所示的HCDR2和如SEQIDNO：11所示的HCDR3)所示的重鏈可變區(qū)和如SEQIDNO：13所示的輕鏈可變區(qū)(包含如SEQIDNO：6所示的LCDR1、如SEQIDNO：7所示的LCDR2和如SEQIDNO：8所示的LCDR3)。在上述任一方面的一些實(shí)施方案中，針對HER2的抗原結(jié)合部為單鏈抗體(scfv)或Fab片段。在上述任一方面的一些實(shí)施方案中，針對人CD3E的抗原結(jié)合部為單鏈抗體(scfv)或Fab片段。由于雙特異性抗體具有針對兩種不同抗原的兩個(gè)不同抗原結(jié)合部，而抗原結(jié)合部可以為單鏈抗體(scfv)或Fab片段兩種形式，那么針對給定的兩種抗原時(shí)，雙特異性抗體的抗原結(jié)合部配置具有四種組合方式(例如，可參見圖1a-圖1d)。在本文中，還將雙特異性抗體描述為具有兩個(gè)“臂”，例如，在圖1a-圖1d所示的四種結(jié)構(gòu)中，以中間為界，可以將雙特異性抗體分為兩個(gè)臂。雙特異性抗體的臂可以由Fc片段和抗原結(jié)合部(Fab片段或單鏈抗體)組成。對于由Fc片段和Fab片段組成的臂，其結(jié)構(gòu)類似于通常的抗體，含有完整的重鏈和輕鏈，因此這樣的臂的結(jié)構(gòu)可以表示為Fc+Fab，也可以表示為重鏈(Fc+Fab中的重鏈可變區(qū)和CH1片段)+輕鏈(Fab中的輕鏈部分)。當(dāng)兩個(gè)臂都含有Fab片段形式的抗原結(jié)合部時(shí)，由此形成的雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)接近于天然抗體，是優(yōu)選的一種實(shí)施方案。在上述任一方面的一些實(shí)施方案中，雙特異性人IgG1抗體包含兩種具有相同鉸鏈區(qū)的Fc片段，所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO：29、SEQIDNO：1或SEQIDNO：28所示，當(dāng)所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：28所示時(shí)，其替換天然人IgG1抗體恒定區(qū)的第216-230位序列，抗體恒定區(qū)氨基酸位置按照EUnumbering確定。SEQIDNO：29為天然的人IgG1抗體的鉸鏈區(qū)。SEQIDNO：1為天然的人IgG2抗體的鉸鏈區(qū)，SEQIDNO：28為天然的人IgG2抗體的鉸鏈區(qū)的變體。本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在雙特異性人IgG1抗體中引入人IgG2抗體的鉸鏈區(qū)能夠改進(jìn)雙特異性抗體的一些功能和性質(zhì)。當(dāng)構(gòu)建保留抗體Fc結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體時(shí)，可以從以下兩個(gè)角度優(yōu)化雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)：一是重鏈異聚化，二是輕鏈和重鏈的正確裝配。在一些實(shí)施方案中，兩種Fc片段包含能夠確保重鏈異聚化的突變。KIH技術(shù)(knob-in-hole，KIH)是解決重鏈異聚化的一種策略。通常，KIH技術(shù)是指通過改造CH3區(qū)的氨基酸序列，形成有利于異種半抗體相互配對的結(jié)構(gòu)，可以在構(gòu)成雙特異性抗體的同時(shí)又盡可能地保持正常抗體的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，所利用的KIH技術(shù)包括，使一個(gè)Fc片段包含點(diǎn)突變S354C和T366W，另一個(gè)Fc片段包含點(diǎn)突變Y349C、T366S、L368A和Y407V。關(guān)于KIH技術(shù)的指導(dǎo)，例如可參見“AnefficientroutetohumanbispecificIgG”，A.MargaretMerchantetal.，NatureBiotechnology，Volume16，1998，通過引用的方式將該文獻(xiàn)全文并入本文。在一些實(shí)施方案中，識別不同抗原表位的Fab片段包含相同的輕鏈。該實(shí)施方案有利于輕鏈和重鏈的正確裝配，也是優(yōu)選的一種實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，一種Fab片段包含天然的人IgG1抗體恒定區(qū)CH1片段，另一種Fab片段包含突變的人IgG1抗體恒定區(qū)CH1片段，突變的人IgG1抗體恒定區(qū)CH1片段包含點(diǎn)突變G137E、N203D和R214T中的任意1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)，其中CH1片段的氨基酸序列為抗體恒定區(qū)第118-215位的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，天然的人IgG1抗體恒定區(qū)CH1片段的氨基酸序列為SEQIDNO：2。在一些實(shí)施方案中，突變的人IgG1抗體恒定區(qū)CH1片段的氨基酸序列為SEQIDNO：30。不被任何理論所束縛，在一種Fab片段中引入上述突變能在不改變抗體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)/功能以及免疫原性的前提下，改變含有該突變的重鏈的電荷特性(等電點(diǎn)，pI)，進(jìn)而有利于雙特異性抗體的后期純化。137、203和214這三個(gè)位點(diǎn)位于CH1結(jié)構(gòu)域的親水區(qū)(結(jié)構(gòu)域的表面)，對其進(jìn)行突變不會改變CH1的構(gòu)象，所涉及的突變是將堿性氨基酸改為中性氨基酸(如R214T)，或者將中性氨基酸改為酸性氨基酸(如G137E、N203D)，這樣的突變能導(dǎo)致含有突變的這條重鏈的等電點(diǎn)(pI)下降，低于未突變的另一條重鏈的等電點(diǎn)，這有利于后期純化過程中利用等電點(diǎn)不同將目的雙特異性抗體與例如KIH技術(shù)可能產(chǎn)生的同聚體進(jìn)行有效的分離。而且，上述突變也天然存在于其它亞型的抗體(如IgG2、IgG4)，預(yù)期不會導(dǎo)致明顯的免疫原性問題。在一些實(shí)施方案中，兩種Fc片段的CH2片段中均包含點(diǎn)突變L234F、L235E和P331S，其中CH2片段的氨基酸序列為抗體恒定區(qū)第231-340位的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，兩種Fc片段的CH2片段的氨基酸序列均為SEQIDNO：31。在CH2片段中引入上述突變能夠降低抗體Fc段介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)，從而可能減少雙特異性抗體在體內(nèi)導(dǎo)致的副作用。關(guān)于上述突變的指導(dǎo)，例如可參見“ThebindingaffinityofhumanIgGforitshighaffinityFcreceptorisdeterminedbymultipleaminoacidsintheCH2domainandismodulatedbythehingeregion”，StephenM.Canfieldetal.，J.Exp.Med.Volume173，1991，通過引用的方式將該文獻(xiàn)全文并入本文。本申請的雙特異性人IgG1抗體可以具有第一臂和第二臂，根據(jù)每個(gè)臂所含的抗原結(jié)合部是單鏈抗體(scfv)形式還是Fab片段形式，第一臂和第二臂可以具有選自以下的結(jié)構(gòu)：(1)第一臂包含單鏈抗體(scfv)形式的針對HER2的抗原結(jié)合部和Fc片段，第二臂包含單鏈抗體(scfv)形式的針對人CD3E的抗原結(jié)合部和Fc片段；(2)第一臂包含F(xiàn)ab片段形式的針對HER2的抗原結(jié)合部和Fc片段，第二臂包含單鏈抗體(scfv)形式的針對人CD3E的抗原結(jié)合部和Fc片段；(3)第一臂包含單鏈抗體(scfv)形式的針對HER2的抗原結(jié)合部和Fc片段，第二臂包含F(xiàn)ab片段形式的針對人CD3E的抗原結(jié)合部和Fc片段；(4)第一臂包含F(xiàn)ab片段形式的針對HER2的抗原結(jié)合部和Fc片段，第二臂包含F(xiàn)ab片段形式的針對人CD3E的抗原結(jié)合部和Fc片段。在一些具體的實(shí)施方案中，第一臂和第二臂的序列結(jié)構(gòu)可以如下表所示：因此，本申請公開了上表所示的任一類型的HER2相關(guān)臂與任一類型的人CD3E相關(guān)臂的全部可能組合方式。第四方面，本申請?zhí)峁┧幬锝M合物，其包含第一至第三方面中任一方面所述的雙特異性人IgG1抗體。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含藥學(xué)可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物用于治療腫瘤，例如表達(dá)雙特異性人IgG1抗體所針對的腫瘤表面抗原的腫瘤。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還可包含潤滑劑，如滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油；潤濕劑；乳化劑；懸浮劑；防腐劑，如苯甲酸、山梨酸和丙酸鈣；增甜劑和/或調(diào)味劑等。在一些實(shí)施方案中，可將本申請中的藥物組合物配制為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、酏劑、懸液、乳劑、溶液、糖漿、栓劑或膠囊等形式。在一些實(shí)施方案中，可以利用任何生理上可接受的給藥方式遞送本申請的藥物組合物，這些給藥方式包括但不限于：口服給藥、腸胃外給藥、經(jīng)鼻給藥、直腸給藥、腹膜內(nèi)給藥、血管內(nèi)注射、皮下給藥、經(jīng)皮給藥、吸入給藥等。在一些實(shí)施方案中，可以通過混合具有所需純度的試劑與視情況的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑等，以凍干制劑或水溶液的形式配制用于治療用途的藥物組合物用于存儲。第五方面，本申請?zhí)峁┑谝恢恋谌矫嬷腥我环矫嫠龅碾p特異性人IgG1抗體或者第四方面所述的藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的用途。第六方面，本申請?zhí)峁┝祟A(yù)防或治療腫瘤的方法，包括向有需要的個(gè)體給予第一至第三方面中任一方面所述的雙特異性人IgG1抗體或者第四方面所述的藥物組合物。在第四、第五或第六方面的一些實(shí)施方案中，腫瘤表達(dá)HER2。在第四、第五或第六方面的一些實(shí)施方案中，腫瘤選自乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及惡性淋巴瘤。應(yīng)當(dāng)理解，以上詳細(xì)描述僅為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地了解本申請的內(nèi)容，而并非意圖在任何方面加以限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)λ鰧?shí)施方案進(jìn)行各種改動和變化。以下實(shí)施例僅用于說明而非限制本申請范圍的目的。實(shí)施例實(shí)施例1單克隆抗體的制備和確認(rèn)作為展示本申請的雙特異性人IgG1抗體的一個(gè)實(shí)例，制備了靶向于人CD3E和HER2的雙特異性人IgG1抗體。作為制備該雙特異性人IgG1抗體的基礎(chǔ)，本申請的發(fā)明人首先制備了針對人CD3E和HER2的兩種單克隆抗體，該過程需要利用多種不同的重組蛋白，包括重組人CD3E的胞外區(qū)(CD3E，SEQIDNO：32)，人CD3D-胞外區(qū)(CD3D，SEQIDNO：33)，猴CD3E胞外區(qū)(mfCD3E，SEQIDNO：34)，猴CD3D胞外區(qū)(mfCD3D，SEQIDNO：35)，小鼠CD3E胞外區(qū)(mCD3E，SEQIDNO：36)，小鼠CD3D胞外區(qū)(mCD3D，SEQIDNO：37)，重組HER2胞外區(qū)D1D2D3部分(HER2，SEQIDNO：38)。在自然環(huán)境中，CD3E與CD3D形成異源二聚體，因此為了制備有天然構(gòu)象的CD3E抗原，我們將CD3E和CD3D同時(shí)表達(dá)，并利用FcK+FcH異源二聚體方法將CD3D和CD3E形成異源二聚體，用作本研究中的抗原。這些重組蛋白都有大量的翻譯后修飾(如：糖基化或二硫鍵等)，因而利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)將更有利于保持重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。此外，為了方便純化，非抗體類的重組蛋白在C端添加了His-tag(SEQIDNO：39)，或者鼠抗體IgG2a的Fc段(mFc，SEQIDNO：40)。重組抗體制備時(shí)，抗體重鏈恒定區(qū)可以來自人IgG1抗體(SEQIDNO：43)，或者為IgG1恒定區(qū)的各種突變體，如：IgG1Hn(SEQIDNO：44)，IgG1Kn(SEQIDNO：45)，IgG1Hn-m3(SEQIDNO：46)，IgG1kn-m3(SEQIDNO：47)，IgG1H3n-m3(SEQIDNO：48)，IgG1kn1-m3(SEQIDNO：49)，IgG1H3n1-m3(SEQIDNO：50)，輕鏈恒定區(qū)是kappa亞型(SEQIDNO：51)。根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫的各種目的重組蛋白的氨基酸序列，設(shè)計(jì)并合成上述各種重組蛋白的基因(包含His-tag、mFc或者Fc編碼基因)。利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)將合成的各種重組蛋白基因克隆至合適的真核表達(dá)載體(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂質(zhì)體(如invitrogen公司的293fectin等)或其它轉(zhuǎn)染試劑(如PEI等)將制備的重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在無血清懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3-5天。然后通過離心等方式收獲培養(yǎng)上清。His-tag融合表達(dá)的重組蛋白利用金屬螯合親和層析柱(如GE公司的HisTrapFF等)對培養(yǎng)上清中的重組蛋白進(jìn)行一步純化。而mFc融合表達(dá)的重組蛋白和重組抗體用ProteinA/G親和層析柱(如GE公司的MabselectSURE等)進(jìn)行一步純化。然后利用脫鹽柱(如GE公司的Hitrapdesaulting等)將重組蛋白保存緩沖液置換為PBS(pH7.0)或者其它合適的緩沖液。必要時(shí)，可以對抗體樣品進(jìn)行過濾除菌，然后分裝保存于-20℃。利用重組抗體技術(shù)得到靶向于腫瘤抗原HER2的單克隆抗體(指定為C6G9+L1A7)和靶向于人CD3E的單克隆抗體(指定為H10B7+L1A7)。C6G9+L1A7的重鏈可變區(qū)序列為SEQIDNO：14，輕鏈可變區(qū)序列為SEQIDNO：13。H10B7+L1A7的重鏈可變區(qū)序列為SEQIDNO：12，輕鏈可變區(qū)序列為SEQIDNO：13。C6G9+L1A7和H10B7+L1A7具有相同的輕鏈。此外，C6G9+L1A7和H10B7+L1A7各自的抗體功能和性質(zhì)經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。實(shí)施例2不同結(jié)構(gòu)雙特異性抗體的設(shè)計(jì)和制備基于實(shí)施例1制備和驗(yàn)證的兩種單克隆抗體，設(shè)計(jì)了一系列針對人CD3E和HER2的雙特異性抗體。由于雙特異性抗體的每個(gè)臂可以包含F(xiàn)ab片段或scfv，因此根據(jù)不同的組合方式設(shè)計(jì)了四種結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體(參見圖1a-圖1d)。此外，為了促進(jìn)形成異源二聚體，使用了基于KIH(Knob-Into-Hole)技術(shù)的人IgG1抗體的Fc片段突變體(FcK，SEQIDNO：41或者FcH，SEQIDNO：42)，即，將針對人CD3E(源自H10B7+L1A7)的抗原結(jié)合區(qū)融合在含有Knob突變的Fc(FcK)的N端，將針對HER2(源自C6G9+L1A7)的抗原結(jié)合區(qū)融合在含有Hole突變的Fc(FcH)的N端。按照與實(shí)施例1類似的重組抗體技術(shù)，制備了表1中所示的雙特異性抗體(BsAb)和作為對照的單克隆抗體(Mab)。表1.不同結(jié)構(gòu)的人CD3E+HER2雙特異性抗體和對照單克隆抗體的結(jié)構(gòu)實(shí)施例3各種雙特異性抗體的親和力分析用GE的BiacoreX100plus進(jìn)行抗體親和力測定。胺基偶聯(lián)試劑(Aminecouplingkit)、人抗體捕獲試劑(humanantibodycapturekit)、His捕獲試劑(hiscapturekit)以及CM5芯片和pH7.4的10×HBS-EP等相關(guān)試劑和耗材均購自GEHealthcare公司。采用捕獲法測定不同雙特異性抗體的親和力。在測定實(shí)施例2中制備的單克隆抗體或者雙特異性抗體對CD3E的親和力時(shí)，將抗His的抗體偶聯(lián)至CM5芯片表面，將帶有His標(biāo)簽的CD3E抗原(CD3E-FcK-His/CD3D-FcH)捕獲到CM5芯片表面作為固定相，采用單循環(huán)的方法將各種抗CD3E抗體蛋白設(shè)置一系列的濃度梯度流經(jīng)固定相表面，測定各抗體蛋白的親和力。在測定實(shí)施例2中制備的單克隆抗體或者雙特異性抗體對HER2抗原的親和力時(shí)，將抗Fc的抗體偶聯(lián)至CM5芯片表面，稀釋各種抗HER2抗體蛋白至合適濃度，分別捕獲到CM5芯片表面作為固定相，采用單循環(huán)的方法將重組的HER2-His設(shè)置一系列的濃度梯度流經(jīng)固定相表面，測定不同抗體蛋白的親和力。本實(shí)施例中使用的人CD3E和HER2抗原的制備見實(shí)施例1的描述。如表2和表3的結(jié)果所示，各種雙特異性抗體均能夠分別有效結(jié)合CD3E和HER2兩種抗原。表2.對照單克隆抗體和雙特異性抗體結(jié)合CD3E的親和力常數(shù)抗體KaKdKDMAb11.615E+74.871E-33.016E-10BsAb13.161E+62.275E-27.189E-9BsAb28.260E+51.118E-21.353E-8BsAb34.346E+54.122E-29.486E-8BsAb43.221E+61.198E-23.718E-9BsAb51.276E+61.228E-29.622E-9BsAb62.2E+68.701E-33.954E-9BsAb76.573E+58.677E-31.320E-8BsAb83.111E+61.843E-25.924E-9表3.對照單克隆抗體和雙特異性抗體結(jié)合HER2的親和力常數(shù)抗體KaKdKDMAb21.194E+56.676E+-45.313E-9BsAb19.659E+46.846E+-47.088E-9BsAb27.427E+49.622E+-41.296E-8BsAb31.32E+59.474E+-47.175E-9BsAb48.231E+47.118E+-48.648E-9BsAb56.666E+-47.172E+-41.076E-8BsAb68.252E+46.984E+-48.463E-9BsAb79.533E+46.473E+-46.79E-9BsAb85.236E+45.071E-49.686E-9實(shí)施例4各種雙特異性抗體同時(shí)識別CD3E和HER2兩種抗原的能力鑒定利用常規(guī)ELISA方法檢測實(shí)施例2中制備的雙特異性抗體對CD3E和HER2兩種抗原的同時(shí)結(jié)合，ELISA流程如下：首先用CD3E-FcK/CD3D-FcH抗原包被ELISA板，4℃冰箱過夜；然后用含有1％BSA的封閉液37℃封閉1小時(shí)；洗滌后加入雙特異性抗體37℃孵育1小時(shí)；洗滌后加HER2-His抗原，37℃孵育1小時(shí)；洗滌后加入HRP-抗HisIgG，37℃孵育1小時(shí)；洗滌后加入HRP底物液進(jìn)行顯色分析。結(jié)果如圖2所示：構(gòu)建的各種雙特異性抗體均能夠同時(shí)識別CD3E和HER2兩種抗原。實(shí)施例5各種雙特異性抗體識別細(xì)胞表面的CD3E和HER2的能力鑒定通過流式細(xì)胞術(shù)分析實(shí)施例2中制備的雙特異性抗體與MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞上表達(dá)的人HER2或人PBMC上表達(dá)的人CD3的結(jié)合能力。MDA-MB-453細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，并培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中。PBMC利用Ficon密度梯度離心法從志愿者全血中分離，并培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中。采集正常志愿者的血液(各50mL)，其中所采集的血液由發(fā)明人及其同事作為志愿者提供，所有志愿者均已簽署知情同意書。志愿者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：1.年齡大于18周歲；2.無HIV、HBV感染；3.血常規(guī)檢測正常；4.非孕婦或哺乳期婦女。收集培養(yǎng)的細(xì)胞，并使用臺盼藍(lán)染色評估細(xì)胞活力。然后將活細(xì)胞在含有0.1％BSA的PBS緩沖液中調(diào)整至3×106個(gè)細(xì)胞/ml，向圓底96孔板中每孔加入90μl的細(xì)胞懸浮液。向含細(xì)胞的孔中加入10μl的雙特異性抗體或相應(yīng)的兩種單克隆抗體(MAb1和MAb2)以獲17.8nM(MDA-MB-453結(jié)合研究)或者53.3nM(PBMC結(jié)合研究)的終濃度。于4℃下孵育30分鐘后，將細(xì)胞離心(5分鐘，350g)，利用150μl/孔含BSA的PBS染色緩沖液洗滌，重懸浮并與100μl/孔熒光染料綴合的羊抗人IgG抗體于4℃下孵育額外的30分鐘。然后通過加入150μl/孔PBS染色緩沖液并在350g下離心5分鐘來洗滌細(xì)胞。利用150μl/孔PBS染色緩沖液進(jìn)行第二個(gè)洗滌步驟。將樣品重懸浮在100μl/孔PBS染色緩沖液中，使用流式細(xì)胞儀(BDBiosciences)獲得并分析所述樣品。結(jié)果如圖3和圖4中所示：實(shí)施例2中制備的雙特異性抗體均能夠分別識別MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞上表達(dá)的人HER2和PBMC上表達(dá)的人CD3。實(shí)施例6各種雙特異性抗體介導(dǎo)T細(xì)胞對HER2陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷收集MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞(HER2陽性細(xì)胞)或MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞(HER2陰性細(xì)胞，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)，計(jì)數(shù)，并使用臺盼藍(lán)評估細(xì)胞活力。調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，每孔100μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后加入起始濃度為3.3nM，10倍梯度稀釋的實(shí)施例2中制備的CD3+HER2雙特異性抗體。為了方便比較，將不同的CD3+HER2雙特異性抗體或者對照單克隆抗體(MAb1和MAb2)調(diào)整至相同的摩爾濃度。最后向孔中加入人PBMC細(xì)胞(效應(yīng)物)以獲得5∶1的最終E∶T比例。同時(shí)設(shè)置單獨(dú)靶細(xì)胞(MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞或MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞)對照、單獨(dú)PBMC細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)對照、單獨(dú)培養(yǎng)基做空白對照。孵育20小時(shí)后，取上清，參照非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書(Non-RadioactiveCytotoxicityAssay，promega，G1780)檢測和分析雙特異性抗體介導(dǎo)的T細(xì)胞對靶細(xì)胞MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞的殺傷率。檢測結(jié)果如圖5a-圖5g和表4所示：本申請構(gòu)建的各種雙特異性抗體(BsAb)均能有效介導(dǎo)T細(xì)胞對HER2陽性靶細(xì)胞的殺傷，不能介導(dǎo)T細(xì)胞對HER2陰性靶細(xì)胞的殺傷，雙特異性抗體中抗原結(jié)合部的形式或鉸鏈區(qū)的序列的不同選擇帶來的雙特異性抗體的活性存在一定差異。當(dāng)采用SEQIDNO：1或者SEQIDNO：28所示的鉸鏈區(qū)時(shí)，雙特異性抗體能夠介導(dǎo)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)的殺傷能力。表4.不同雙特異性抗體介導(dǎo)T細(xì)胞對靶細(xì)胞MDA-MB-453殺傷的EC50實(shí)施例7各種雙特異性抗體介導(dǎo)的T細(xì)胞激活收集表達(dá)HER2的MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞，計(jì)數(shù)并使用臺盼藍(lán)評估細(xì)胞活力。調(diào)整MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞密度為2×105/ml，每孔100μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后加入系列稀釋的實(shí)施例2制備的各種CD3+HER2雙特異性抗體。為了方便比較，將不同的CD3+HER2雙特異性抗體或者對照單克隆抗體(MAb1和MAb2)調(diào)整至相同的摩爾濃度。最后向孔中加入人PBMC(效應(yīng)物)以獲得5∶1的最終E∶T比例。同時(shí)設(shè)置單獨(dú)靶細(xì)胞(MDA-MB-453人乳腺癌細(xì)胞)對照。孵育20小時(shí)后，通過離心(5分鐘，350g)沉淀細(xì)胞并利用150μl/孔PBS緩沖液洗滌兩次。加入抗人CD3和人CD69的抗體(eBioscience，11-0037-42，12-0699-42)，于4℃下避光孵育30分鐘。然后利用150μl/孔PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，重懸浮于100μl/孔PBS緩沖液中，并使用流式細(xì)胞儀(BDBiosciencesC6)對細(xì)胞樣品進(jìn)行分析并比較不同樣品處理后CD3陽性細(xì)胞群中激活標(biāo)志物CD69的表達(dá)差異?；蛘咴诜跤?0小時(shí)后，取培養(yǎng)上請，利用ELISA分析上清中IL2水平(人IL-2ELISA試劑，DAKEWE，DKW12-1020-096)。結(jié)果如圖6a-圖6c所示：本申請構(gòu)建的多種雙特異性抗體均能夠?qū)崿F(xiàn)HER2陽性靶細(xì)胞對T細(xì)胞的特異性激活。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3