本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)(又稱納米抗體技術(shù))，以及基因工程抗體技術(shù)，特別是針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體或多肽。
技術(shù)背景
c-Myc標(biāo)簽蛋白的發(fā)現(xiàn)源于1985年Evan制備獲得了一株針對(duì)人原癌基因產(chǎn)物Myc蛋白的單克隆抗體9E10，此后研究發(fā)現(xiàn)該抗體識(shí)別的表位由10個(gè)氨基酸殘基組成，其序列為Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，并且這10個(gè)氨基酸與其它蛋白融合表達(dá)后依然能夠保持很強(qiáng)的抗原活性，可以被相應(yīng)抗體識(shí)別，而且不受到蛋白框架的影響。因此，c-Myc標(biāo)簽系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞成像、親和純化以及蛋白質(zhì)工程等領(lǐng)域。
本發(fā)明公開(kāi)了一種可以與c-Myc標(biāo)簽特異性結(jié)合的單域重鏈抗體(即納米抗體，下同)，可用于c-Myc標(biāo)簽融合蛋白的檢測(cè)及純化。
目前市場(chǎng)上已經(jīng)有針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單克隆或多克隆抗體用于檢測(cè)，但單克隆抗體的研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程及其繁瑣和復(fù)雜，多克隆抗體來(lái)源有限。相比之下，單域重鏈抗體僅由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，具有耐酸堿、耐高溫、特異性高、分子量小和可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，用單域重鏈抗體作為配基制備的純化介質(zhì)具有成本低、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體，可以被用于制備檢測(cè)和純化c-Myc標(biāo)簽的試劑和工具。
本發(fā)明提供一個(gè)針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體(即本發(fā)明一種特異識(shí)別c-Myc標(biāo)簽的納米抗體，下同)，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的IMGT編號(hào)和結(jié)構(gòu)域的劃分包括四個(gè)框架區(qū)(Framework region,FR)和三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity-determining region,CDR)。
本發(fā)明提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.:1，通過(guò)遺傳密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。
本發(fā)明還提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.:1部分結(jié)構(gòu)域，通過(guò)遺傳密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列?？梢詾镾EQ ID NO.:2核酸分子。
本發(fā)明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過(guò)合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌，酵母菌，絲狀真菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞，或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡(jiǎn)并性，該核酸序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。
本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，包括所述蛋白質(zhì)或表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供一種檢測(cè)c-Myc標(biāo)簽的方法，含有本發(fā)明所述針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體?；诒景l(fā)明提供的針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體與c-Myc標(biāo)簽特異性結(jié)合的能力，建立c-Myc標(biāo)簽的檢測(cè)方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，熒光免疫法(Fluoroimmunoassay,FIA)，免疫芯片法，親和層析法和免疫層析法等。
本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過(guò)隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造，能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，該突變體能與c-Myc標(biāo)簽特異性結(jié)合。
本發(fā)明還涉及前述針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體在免疫檢測(cè)、富集以及純化中的應(yīng)用。這些免疫檢測(cè)指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測(cè)。
本發(fā)明還涉及針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的免疫親和吸附材料，包括載體，搭載在載體上的配基，其特征在于該材料以針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的納米抗體作為配基，所述針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的納米抗體具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用硅球、納米磁珠等。
本發(fā)明所敘述的一些術(shù)語(yǔ)具有如下含義：
結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
IMGT編號(hào)：IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)(The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一種已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法。具體編號(hào)方法可以參考文獻(xiàn)(Ehrenman,F.,Q.Kaas,et.al.(2010).IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign：a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF.Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,et al.(2003).IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains Dev comp Immunol 27(1):55-77.)中的描述。
密碼子(codon)：又稱為三連體密碼子(triplet code)，指對(duì)應(yīng)于某種氨基酸的核苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過(guò)程中決定該種氨基酸插入生長(zhǎng)中多肽鏈的位置。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應(yīng)用，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，這些具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
實(shí)施例1：
抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體(即針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體)免疫文庫(kù)的構(gòu)建
將c-Myc標(biāo)簽與牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)共價(jià)偶聯(lián)，得到c-Myc人工抗原c-Myc-BSA，取300μg c-Myc-BSA與弗氏完全佐劑乳化后，對(duì)羊駝(Lama pacos)進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫。加強(qiáng)免疫采用150μg c-Myc-BSA與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進(jìn)行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)，選擇血清效價(jià)最高的樣品分離淋巴細(xì)胞，提取RNA。
RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說(shuō)明書進(jìn)行。以RNA為模板，oligo dT為引物，參照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書合成cDNA第一鏈。
采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經(jīng)巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因(采用的引物見(jiàn)表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴(kuò)增cDNA，反應(yīng)條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個(gè)循環(huán)，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。
將第一輪PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的DNA片段，作為第二輪PCR的模板，分別用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個(gè)循環(huán)，98℃，10s，68℃，40s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。經(jīng)DNA片段回收試劑盒回收、定量，于-20℃保存?zhèn)溆?。將噬菌粒pHEN1和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1∶3摩爾比，在16℃，過(guò)夜連接。
表1文庫(kù)構(gòu)建及鑒定所用的引物
注：下劃線表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列
連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10μL無(wú)菌水，分十次進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。取10μL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)板，計(jì)算庫(kù)容。其余部分全部涂布于24cm×24cm氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)13～16h。用10mL，2×YT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終濃度20～30％甘油，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
根據(jù)計(jì)算的庫(kù)容量結(jié)果，接種10倍庫(kù)容量的活細(xì)胞于20mL的2×YT(含2％葡萄糖，100μg/mL氨芐青霉素)，37℃，200r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5，按感染復(fù)數(shù)20∶1加入輔助噬菌體，37℃，200r/min，60min。將培養(yǎng)物離心，用50mL的2×YT(含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素)重懸沉淀，37℃，200r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，8000rpm離心取上清，加入5×PEG/NaCl溶液，冰上放置1.5h或4℃過(guò)夜，8000rpm離心30min，重懸沉淀于含10％甘油的磷酸緩沖液(PBS，0.01M，pH 7.4)，即得到抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體免疫文庫(kù)，取10μL測(cè)定滴度，其余分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2：
抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的淘選與鑒定
采用固相親和淘選的方法從實(shí)施例1所得抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體免疫文庫(kù)中淘選針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體。向每個(gè)酶標(biāo)孔中加入120μL用PBS稀釋的Myc-GST融合蛋白(Myc標(biāo)簽與谷胱甘肽融合的蛋白)，4℃，包被過(guò)夜，每輪淘選的包被濃度分別為100，75，50μg/mL；吸出包被液，PBS洗板5次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS，37℃，封閉2h；PBS洗板5次，加入100μL噬菌體抗體文庫(kù)(約含1×1011CFU)，37℃，孵育2.0h；吸出未結(jié)合的噬菌體，用PBST(含0.5％Tween-20)洗板3-5次(逐輪增加5次)，再用PBS洗板15-25次；以100μL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附在酶標(biāo)孔中的噬菌體，用35μL Tris-HCl(1mol/L，pH 8.0)中和洗脫物，取10μL用于滴度測(cè)定，其余125μL洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪淘選。
經(jīng)四輪淘選后，采用輔助噬菌體KM13對(duì)隨機(jī)挑取的單克隆進(jìn)行救援，分別得到展示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接phage-ELISA測(cè)定噬菌體顆粒的結(jié)合活性和特異性，實(shí)驗(yàn)設(shè)定對(duì)照，具體加樣步驟見(jiàn)表2。
表2間接phage-ELISA加樣表
將ELISA陽(yáng)性克隆送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到插入片段的DNA序列，其編碼針對(duì)c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體。
DNA序列(SEQ ID NO.:2)：
CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCGAGGTGCAGGCTGGAGGTTCTCTGAAGCTCTCCTGCGCAGCCTCTGGAAGCAACGTCCAGATCAGTGCCATGGGCTGGTACCGCCAGGTTCCAGGGAAGCAGCGCGAATTCGTTGCATCAGAGACGAATGGTGGCAGGATCGATTATGCGGACTTTGTGGAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACCGTGCCAAGAACACGGTGTACCTGCAAATGACCAGTCTGAGACCTGAAGACACGGCCGTGTATTACTGTAACGCCGCGCCGGGAGGCTGGTACGCGGACCTGCGAGAGGAGTATTGGGGCAAAGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
編碼具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列：
QLQLVESGGGEVQAGGSLKLSCAASGSNVQISAMGWYRQVPGKQREFVASETNGGRIDYADFVEGRFTISRDRAKNTVYLQMTSLRPEDTAVYYCNAAPGGWYADLREEYWGKGTLVTVSS。
實(shí)施例3：
抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的規(guī)模制備
編碼抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的DNA片段的獲?。?.采用限制性內(nèi)切酶SfiI/NotI，雙酶切噬菌粒pHEN-anti-c-Myc單域重鏈抗體基因，瓊脂糖凝膠電泳回收抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體基因；2.直接將抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體編碼序列送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行化學(xué)合成；3.設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)PCR技術(shù)從羊駝(Lama pacos)來(lái)源的cDNA庫(kù)中擴(kuò)增。
將得到的抗c-Myc標(biāo)簽標(biāo)簽單域重鏈抗體基因片段克隆至表達(dá)載體pET25-flag(已將載體本身所帶c-Myc標(biāo)簽替換為Flag標(biāo)簽：DYKDDDDK)，經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒。
將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌rosetta，挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將單菌落接入5mL LB-A(Luria-Bertani broth with 100μg/mL ampicillin)液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)12h；以1％培養(yǎng)基體積的接種量將其轉(zhuǎn)接到50mL LB-A液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5(約需3～3.5h)，加入終濃度0.1mM的IPTG，30℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)物8000r/min離心，在細(xì)胞沉淀中加入25mL磷酸緩沖液(pH 7.4)混勻，8000r/min離心，去上清，保留細(xì)胞沉淀；在細(xì)胞沉淀中加入15mL相同緩沖液，混勻，冰上超聲波細(xì)胞破碎處理，超聲破碎條件為200W，破碎2s，間歇5s，共250個(gè)循環(huán)，在4℃下對(duì)細(xì)胞破碎物8000r/min離心15min，取上清進(jìn)行親和層析純化和SDS-PAGE電泳分析，或在上清中加入終濃度20％的甘油，混勻，保存于-20℃冰柜待用。
通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件(如宿主菌、表達(dá)載體、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間、溫度以及IPTG濃度等)，可以進(jìn)一步提高目的蛋白(單域重鏈抗體)表達(dá)量，為大量制備抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體提供了途徑。
實(shí)施例4：
抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的融合表達(dá)
將本發(fā)明抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體基因克隆至融合表達(dá)載體pAP(含有堿性磷酸酶基因)，經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的堿性磷酸酶融合表達(dá)質(zhì)粒。
堿性磷酸酶可以非特異性催化磷酸單酯水解生成無(wú)機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖類化合物。該酶常作為信號(hào)元件用于ELISA、免疫印跡、組織化學(xué)等檢測(cè)方法。融合表達(dá)質(zhì)粒將抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體融合于堿性磷酸酶的N端，參考應(yīng)用實(shí)例3中的表達(dá)方法，可以在大腸桿菌中表達(dá)、純化出融合蛋白AP-anti-c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體。
實(shí)施例5：
抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體用于親和純化材料的制備
1)c-Myc標(biāo)簽免疫親和磁珠的小量制備
采用納米磁珠作為載體，偶聯(lián)抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體后，得到c-Myc標(biāo)簽免疫磁珠，具體制備方法如下：
取1mg羧基修飾的磁珠于離心管中，加入500μl活化緩沖液(10mM，NaH2PO4，pH 6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌3遍。分別加入2mg碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，渦旋混合后，靜置25min。用偶聯(lián)緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.4)洗滌磁珠3遍，加入溶于偶聯(lián)緩沖液的抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體1mg，室溫反應(yīng)3.5h，用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠5次，加入500μl含1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)或1％(w/v)卵清蛋白(OVA)的偶聯(lián)緩沖液封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)，室溫反應(yīng)35min。用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠5次，PBS溶液(10mM，pH 7.2，0.02％w/v，Na3N)重懸后保存于4℃。
2)c-Myc標(biāo)簽免疫親和吸附材料及親和柱的制備
采用瓊脂糖微球作為載體，偶聯(lián)抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體，具體制備方法如下：
將CNBr活化的干膠用0.1M HCl洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯(lián)緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.2)洗滌10次，加入抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂糖微球)，室溫反應(yīng)3.5h，使抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝膠微球共價(jià)偶聯(lián)。用偶聯(lián)緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.2)洗滌3次后，加入封閉液室溫反應(yīng)2.5h以封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)。用6倍膠體積的磷酸緩沖液(10mM，pH 7.2)和醋酸緩沖液(0.1M，pH 4.5)交替洗滌3次，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱，8～10倍柱床體積的PBS(10mM，pH 7.2)洗滌后，加入20％乙醇溶液，4℃保存。
3)c-Myc標(biāo)簽免疫親和吸附材料及親和柱的制備
采用硅膠微球作為載體，偶聯(lián)抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體，具體制備方法如下：
取2g硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(PBS，10mM，pH 6.5)交替洗滌6～10次，用10ml PBS緩沖液懸浮硅膠微球，加入5mg抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體，混勻，加入終濃度5mg/ml的碳二亞胺(EDC)，迅速混勻，4℃攪拌反應(yīng)12～20h，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗c-Myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱，58～10倍柱床體積的PBS(10mM，pH 6.5)洗滌后，加入含0.02％(w/v)Na3N的PBS(10mM，pH 6.5)，4℃保存。
4)c-Myc標(biāo)簽親和層析柱的吸附量、重復(fù)使用測(cè)定
用6倍柱床體積PBS(10mM，pH 7.2)清洗柱子，加入蛋白樣品溶液，流出液重新過(guò)柱。然后用3倍柱床體積純水淋洗，再用甘氨酸鹽酸(pH 2.2)洗脫特異性吸附的含c-Myc標(biāo)簽重組蛋白，收集的洗脫液，即為純化后的蛋白溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，裝填有1mL1)、2)、3)制備的親和柱/磁珠可以特異性吸附目的蛋白。重復(fù)使用10次之后，回收率仍然大于80％?？梢酝ㄟ^(guò)生物學(xué)方法大量培養(yǎng)生產(chǎn)配基為單域重鏈抗體，避免了人工抗體等繁瑣生產(chǎn)方法，大大降低了生產(chǎn)成本，并且可重復(fù)使，應(yīng)用前景廣闊。
實(shí)施例6：
抗c-Myc標(biāo)簽的納米抗體的耐熱實(shí)驗(yàn)
通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)納米抗體熱穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)方法如下：
取濃度為5μg/mL Myc-GST蛋白，以每孔100μL加入96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜；0.05％PBST洗板3次；3％的脫脂牛奶37℃封閉l h；加入稀釋后的c-Myc納米抗體，每孔100μL，37℃，孵育1h；加入1：2000工作濃度HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽二抗，每孔加入100μL，37℃，孵育1h；加入TMB顯色液，每孔加入100μL；在多組不同在溫度下孵育30min；反應(yīng)結(jié)束后，加入2M硫酸終止反應(yīng)，每孔加入50μL，混勻終止反應(yīng)后測(cè)定450nm吸光值。
結(jié)果顯示即使溫度高達(dá)70℃、80℃、90℃，蛋白活性依然具有生物活性，OD450值分別為1.5、1.2、1.1，具有較好的耐熱性。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大學(xué)
<120> 一種特異識(shí)別c-Myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體
<130> 2017
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asn Val Gln Ile Ser
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Glu Thr Asn Gly Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Phe Val Glu
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Thr Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Ala Pro Gly Gly Trp Tyr Ala Asp Leu Arg Glu Glu Tyr Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 363
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 2
cagttgcagc tcgtggagtc agggggaggc gaggtgcagg ctggaggttc tctgaagctc 60
tcctgcgcag cctctggaag caacgtccag atcagtgcca tgggctggta ccgccaggtt 120
ccagggaagc agcgcgaatt cgttgcatca gagacgaatg gtggcaggat cgattatgcg 180
gactttgtgg agggccgctt caccatctcc agagaccgtg ccaagaacac ggtgtacctg 240
caaatgacca gtctgagacc tgaagacacg gccgtgtatt actgtaacgc cgcgccggga 300
ggctggtacg cggacctgcg agaggagtat tggggcaaag ggaccctggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttggtggtc ctggctgc 18
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(47)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
tcgcggccca gccggccatg gcccagktgc agctcgtgga gtcnggngg 49
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgagtgcggc cgcggggtct tcgctgtggt gcg 33
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgagtgcggc cgcttgtggt tttggtgtct tggg 34
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agcggataac aatttcacac agga 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gccccattca gatcctcttc 20