本發(fā)明屬于藥物制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及一種靶向酸性環(huán)境的敏感性多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)，也稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomains，PTDs)或膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(membranetransductionpeptides，MTPs)，是一類由不多于30個氨基酸殘基組成的小分子多肽，自從1988的HIVTAT發(fā)現(xiàn)以來，通過蛋白結(jié)構(gòu)分析衍生，或通過構(gòu)效關(guān)系研究合成不斷地發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞穿膜肽，具有很強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，而且能夠攜帶比其分子質(zhì)量大100倍的外源性大分子(蛋白質(zhì)或者載體等)進(jìn)入細(xì)胞，是一系列具有高效介導(dǎo)入胞能力的短肽。而將細(xì)胞穿膜肽作為配體應(yīng)用于增強(qiáng)各種載藥系統(tǒng)胞內(nèi)傳遞的研究也層出不窮。通過在陽離子CPPs上共價結(jié)合一段聚陰離子結(jié)構(gòu)(polyanion，PA)，即PA-CPP，能夠?qū)崿F(xiàn)對CPPs正電荷的中和，從而有效抑制CPPs的穿膜活性。為了實(shí)現(xiàn)CPPs能夠在到達(dá)靶組織或病灶部位后被重新激活并發(fā)揮作用，研究人員嘗試多種途徑對PA-CPP進(jìn)行改造并實(shí)現(xiàn)CPPs的靶向性傳遞，如利用靶部位特異性蛋白酶(MMP等)水解實(shí)現(xiàn)PA和CPP的分離，通過光激活，氧化解離，脂鍵或者酰胺鍵的水解，或根據(jù)靶組織與其它組織在微環(huán)境上的差別，這種只有在特定條件下才能發(fā)揮穿膜效果的新型CPPs被稱為可活化細(xì)胞穿膜肽(Activatablecell-penetratingpeptides，ACPPs)。ACPP除了能夠?qū)Π屑?xì)胞發(fā)揮靶向穿膜作用之外，相比于CPP由于中和了CPP的正電荷具有使毒性降低的優(yōu)勢。而人體中，由于在生理和病理?xiàng)l件下，均存在酸性微環(huán)境，可以作為ACPP的響應(yīng)條件，主要包括腫瘤、炎癥或感染部位、細(xì)胞內(nèi)涵體或溶酶體等。其中，由于腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖分化能力，腫瘤部位氧供不足，使得腫瘤組織細(xì)胞外微環(huán)境含有較多乳酸，其細(xì)胞外的pH值(6.5～6.8)普遍低于正常組織和血液的pH值(7.2～7.4)。因此，近年來，針對腫瘤微環(huán)境的以上特點(diǎn)，利用腫瘤組織這一特殊的微環(huán)境構(gòu)建pH敏感型藥物傳遞系統(tǒng)成為中外學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種基于CPPs設(shè)計(jì)的可逆活化細(xì)胞穿膜肽材料并將其與兩親性聚合物偶聯(lián)制成混合膠束，使得該膠束載體在腫瘤微環(huán)境中表現(xiàn)出較高的細(xì)胞攝取和膜結(jié)合能力。技術(shù)方案：一種酸敏性多肽，包括凈電荷可逆變化的肽鏈HX、柔性肽鏈Y和細(xì)胞穿膜肽CPP三部分，其結(jié)構(gòu)為HX-Y-CPP或CPP-Y-HX。進(jìn)一步地，所述凈電荷可逆變化的肽鏈HX由谷氨酸E或天冬氨酸D的一種或兩種與組氨酸H組成。進(jìn)一步地，所述柔性肽鏈Y由單一氨基酸或混合氨基酸組成。進(jìn)一步地，所述細(xì)胞穿膜肽CPP為含有正電性氨基酸的肽鏈。上述酸敏性多肽在納米靶向遞藥系統(tǒng)中的應(yīng)用。一種納米靶向聚合物膠束遞藥系統(tǒng)，包括兩親性嵌段共聚物和酸敏性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物。進(jìn)一步地，所述兩親性嵌段共聚物和酸敏性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物的摩爾比為99∶1-0.9∶1，優(yōu)選9∶1。進(jìn)一步地，所述酸敏性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物是將酸敏性多肽與兩親性嵌段共聚物的親水段進(jìn)行共價連接。有益效果：增強(qiáng)膠束載體在腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞攝取和膜結(jié)合能力，從而增加膠束載體對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，降低對正常組織的毒性。附圖說明圖1為酸敏感性多肽的作用機(jī)制圖；圖2為實(shí)施例1中載紫杉醇的可逆活化細(xì)胞穿膜肽修飾的PEG-PLA和聚乙二醇單甲醚-聚乳酸混合膠束(PTX/CPP-HE-PM)的粒徑分布圖；圖3為實(shí)施例1中mPEG-PLA膠束(PM)和混合膠束(CPP-HE-PM)在不同pH的緩沖液里的Zeta電位；圖4為試驗(yàn)例1中不同濃度的CremophorEL：乙醇＝1∶1(v/v)溶媒、空白mPEG-PLA膠束(PM)和CPP-HE修飾的空白混合膠束(CPP-HE-PM)在不同pH下鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)的存活率；圖5為試驗(yàn)例1中不同濃度的PTX/PM和PTX/CPP-HE-PM在不同pH下4T1細(xì)胞的存活率；圖6(a)為試驗(yàn)例1中載香豆素的mPEG-PLA膠束(C6/PM)和CPP-HE修飾的混合膠束(C6/CPP-HE-PM)在不同pH下，攝取時間為2小時，Hela細(xì)胞攝取的平均熒光強(qiáng)度。圖6(b)為試驗(yàn)例1中載香豆素的mPEG-PLA膠束(C6/PM)和CPP-HE修飾的混合膠束(C6/CPP-HE-PM)在不同pH下，攝取時間為2小時，4T1細(xì)胞攝取的平均熒光強(qiáng)度。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)，也稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransductiondomains，PTDs)或膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(membranetransductionpeptides，MTPs)，是一類由不多于30個氨基酸殘基組成的小分子多肽，自從1988的HIVTAT發(fā)現(xiàn)以來，通過蛋白結(jié)構(gòu)分析衍生，或通過構(gòu)效關(guān)系研究合成不斷地發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞穿膜肽，具有很強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，而且能夠攜帶比其分子質(zhì)量大100倍的外源性大分子(蛋白質(zhì)或者載體等)進(jìn)入細(xì)胞，是一系列具有高效介導(dǎo)入胞能力的短肽。以其理化性質(zhì)為基礎(chǔ)，細(xì)胞穿膜肽可以簡單的劃分為三類：陽離子細(xì)胞穿膜肽、疏水性細(xì)胞穿膜肽和兩親性細(xì)胞穿膜肽。其中，陽離子細(xì)胞穿膜肽中的氨基酸殘基主要由精氨酸和賴氨酸組成。兩親性細(xì)胞穿膜肽則主要由賴氨酸組成，序列中還分布有親水或疏水性的其它氨基酸殘基，其空間構(gòu)象為α-螺旋結(jié)構(gòu)。CPP序列中富含精氨酸，有研究表明，胍基是細(xì)胞穿膜肽結(jié)構(gòu)中影響CPPs穿膜能力的關(guān)鍵因素。由于寡聚賴氨酸中不含有胍基，因此，含有等電荷的寡聚賴氨酸和寡聚精氨酸相比，寡聚精氨酸具有更強(qiáng)的穿膜能力。然而，細(xì)胞穿膜肽的應(yīng)用受到較大的局限性，一方面，細(xì)胞穿膜肽較強(qiáng)的正電性導(dǎo)致其在血液循環(huán)中極易與血漿蛋白或調(diào)理素結(jié)合后被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬；另一方面，細(xì)胞穿膜肽作為一種非特異性的“功能分子”，能夠非選擇性地介導(dǎo)穿透進(jìn)入所有細(xì)胞，這樣的特點(diǎn)限制了細(xì)胞穿膜肽在全身系統(tǒng)給藥中的應(yīng)用?；趯﹄逆滈L度、氨基酸組成及序列、氨基酸側(cè)鏈pKa、重組多肽等電點(diǎn)、不同pH條件下重組多肽凈電荷、多肽序列與其二級結(jié)構(gòu)的相關(guān)性等多種因素的考慮，構(gòu)建了一種酸敏性多肽。包括凈電荷可逆變化的肽鏈HX、柔性肽鏈Y和細(xì)胞穿膜肽CPP三部分，其結(jié)構(gòu)為HX-Y-CPP，其中，1)凈電荷可逆變化的肽鏈HX由組氨酸H與谷氨酸E、天冬氨酸D的一種或其組合組成，優(yōu)選谷氨酸E；HX序列可以為組氨酸和負(fù)電性氨基酸的任意組合和排列，優(yōu)選組氨酸和負(fù)電性氨基酸等比例的重復(fù)序列，即(HX)a；HX序列中含有負(fù)電性氨基酸的數(shù)量應(yīng)不少于細(xì)胞穿膜肽中正電性氨基酸的數(shù)量，且不大于細(xì)胞穿膜肽中正電性氨基酸的數(shù)量的3倍。2)柔性肽鏈Y由單一氨基酸或混合氨基酸組成；3)細(xì)胞穿膜肽CPP為含有正電性氨基酸的多肽鏈段。如圖1所示，HX-Y-CPP中，HX為凈電荷可逆變化的肽鏈，X為帶負(fù)電的氨基酸，H在正常生理pH條件下不帶電，在酸性pH條件下帶正電；CPP為含有正電性氨基酸殘基的多肽鏈段；Y為柔性連接將HX與CPP相連，使HX和CPP能夠通過靜電作用相互吸附。在正常生理pH條件下，即pH＝7.4時，CPP所帶正電被HX所帶負(fù)電荷吸附而呈“發(fā)卡結(jié)構(gòu)”，HX-Y-CPP凈電荷為零或負(fù)，表現(xiàn)為非激活狀態(tài)；在酸性條件下，即pH≤6.5時，H被質(zhì)子化干擾HX與CPP靜電結(jié)合的穩(wěn)定性，且HX-Y-CPP凈電荷變?yōu)檎蛄?，?dǎo)致HX與CPP分離使CPP發(fā)揮穿膜作用。而在腫瘤部位被特異性激活而未被腫瘤細(xì)胞及時攝取，重新進(jìn)入血液循環(huán)后依然表現(xiàn)為非激活狀態(tài)，此為可逆活化，有效保證了藥物遞送系統(tǒng)的特異性和安全性。作為上述的這些細(xì)胞穿膜肽CPP，只要能夠發(fā)揮其介導(dǎo)載體實(shí)現(xiàn)高效跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力的目的即可，沒有特別限定，可以舉出：核轉(zhuǎn)錄激活子Tat蛋白，Tat-(47-57)(YGRKKRRQRRR)，HIV-1Rev-(34-50)(TRQARRNRRRRWRERQR)，果蠅觸角控制基因蛋白，Antp(43-58)(RQIKIYFQNRRMKWKK)，F(xiàn)HV外殼蛋白(35-49)(RRRRNRTRRNRRRVR)，小分子寡聚精氨酸[(R)n]，小分子寡聚賴氨酸[(K)n]，MAP(KLALKLALKALKAALKLA)及其類似物，transportan等。作為上述的柔性肽鏈Y，只要能夠發(fā)揮其橋接HX與CPP且不影響HX與CPP相互作用的目的即可，沒有特別限定，可以舉出：(GGGGS)n，(G)n，KESGSVSSEQLAQFRSLD，EGKSSGSGSESKST，GSAGSAAGSGEF等。本發(fā)明的另外一個目的是提供了一種包含酸敏性多肽的納米靶向遞藥系統(tǒng)，可以為脂質(zhì)體、膠束、固體脂質(zhì)納米粒、聚合物納米粒、多肽-藥物偶聯(lián)納米載體等。VijayA.Sethuraman等制備TAT修飾的PEG-PLA膠束載體，并通過PSD(甲基丙烯?；前范籽踵奏?-b-PEG中的PSD在中性環(huán)境下的負(fù)電荷與TAT電荷中和，但在酸性環(huán)境(6.5-6.0)下不顯電性使得TAT發(fā)揮穿膜效果。pH敏感性多肽修飾的膠束在pH6.0的細(xì)胞攝取量相較pH7.4顯著增加，實(shí)現(xiàn)主動靶向作用。A.M.Hamilton等將iRGD修飾在納米粒上，表明修飾了iRGD的包載阿霉素的納米粒相比水溶性的iRGD能夠增加其防止腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。S.W.Chung等將阿霉素與四肽DEVD偶聯(lián)，可減少阿霉素在體內(nèi)的毒性，并通過篩選不同的敏感性連接鍵實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部敏感釋藥發(fā)揮作用。上述遞藥系統(tǒng)可以遞送抗癌藥物和抗生素等藥物，可選自烷化劑、抗生素、植物生物堿、鉑類化合物等，具體藥物如紫杉醇、多西他賽、去氧鬼臼毒素、阿霉素、吉西他濱、放線菌素D等。具體的，本發(fā)明提供了一種兩親性聚合物膠束，包括兩親性嵌段共聚物和酸敏性多肽修飾的兩親性嵌段共聚物。其制備方法是先將兩類兩親性嵌段共聚物制成膠束，再采用酸敏性多肽修飾其中一種兩親性嵌段共聚物。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，是以聚乙二醇單甲醚-聚乳酸共聚物(mPEG-PLA)兩親性載體材料作為主體、加入一定比例的丙烯酸酯-PEG-PLA(acrylate-PEG-PLA)制得膠束，再由巰基與含碳碳雙鍵的丙烯酸酯通過邁克爾加成將acrylate-PEG-PLA與酸敏性多肽(本發(fā)明實(shí)施例中使用R6G5(HE)10C，以下簡稱為CPP-HE)共價結(jié)合。所得膠束在腫瘤微環(huán)境中表現(xiàn)出較高的細(xì)胞攝取和膜結(jié)合能力，而在腫瘤部位被特異性激活而未被腫瘤細(xì)胞及時攝取，重新進(jìn)入血液循環(huán)后依然表現(xiàn)為非激活狀態(tài)，保證藥物遞送系統(tǒng)的特異性和安全性。該膠束的制備方法是先以聚乙二醇單甲醚(Methoxypolyethyleneglycol，mPEG)和D，L-丙交酯(D，L-LA)為原料，在無水、無氧、辛酸亞錫催化的條件下反應(yīng)，通過開環(huán)聚合法合成mPEG-PLA；再使用薄膜分散法將mPEG-PLA和acrylate-PEG-PLA制備為混合膠束；然后以可逆活化細(xì)胞穿膜肽CPP-HE對PEG-PLA進(jìn)行修飾，得到包含酸敏性多肽的納米靶向聚合物膠束遞藥系統(tǒng)。具體地，采用開環(huán)聚合法合成mPEG-PLA：mPEG和D，L-LA的質(zhì)量比例范圍為3∶2-2∶3，優(yōu)選1∶1；催化劑為辛酸亞錫催化劑加入質(zhì)量范圍為反應(yīng)物總重的0.8-0.2％，優(yōu)選0.5％；反應(yīng)溫度范圍為140-160℃，優(yōu)選150℃；氮?dú)獗Ｗo(hù)；反應(yīng)時間范圍為5-10h，優(yōu)選6h；冷卻至室溫，產(chǎn)物用相當(dāng)于反應(yīng)物重量之和0.1-0.5倍(體積)二氯甲烷溶解，優(yōu)選0.2倍；用相當(dāng)于反應(yīng)物重量之和5-20倍(體積)冰無水乙醚沉淀，優(yōu)選10倍，減壓抽濾，得白色固體。所得產(chǎn)物室溫或40℃真空干燥24h，優(yōu)選室溫干燥。采用薄膜分散法制備膠束：溶劑為甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿，優(yōu)選甲醇；水浴溫度范圍為35-55℃，優(yōu)選40℃，旋蒸至溶劑完全除去，加入pH7.5-8.5Hepes緩沖液水化10-30min，優(yōu)選pH8.0，15min；水化產(chǎn)物用0.22或0.45μm濾膜過濾，優(yōu)選0.22μm；加入CPP-HE的摩爾量與acrylate-PEG-PLA的比例范圍為1.5∶1-1∶1，優(yōu)選1.2∶1，氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)時間12-24h，優(yōu)選24h。本發(fā)明以多種疏水性小分子抗癌藥物(如紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素等)為模型，按照上述方法制備載藥膠束，載藥量為9％至16％。以下實(shí)施例所采用的CPP-HE由安徽國肽生物科技有限公司合成；丙烯酸酯-PEG-PLA由上海芃碩生物科技有限公司合成。實(shí)施例1mPEG-PLA嵌段共聚物的合成采用開環(huán)聚合法合成：取mPEG和DL-LA各5.0g，置于100mL三頸瓶中，緩慢升溫至140℃，待物料完全熔融后。加入反應(yīng)物總重的0.5％辛酸亞錫，磁力攪拌混勻后，真空殘留的水分至反應(yīng)液無氣泡產(chǎn)生，升溫至150℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)6h。冷卻至室溫后向反應(yīng)物中加入反應(yīng)物重量之和0.2倍(體積)二氯甲烷溶解，用相當(dāng)于反應(yīng)物重量之和10倍(體積)冰無水乙醚沉淀，減壓抽濾，得白色固體。所得產(chǎn)物室溫真空干燥24h。載紫杉醇的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸膠束(PTX/PM)，載紫杉醇的可逆活化細(xì)胞穿膜肽修飾的PEG-PLA和聚乙二醇單甲醚-聚乳酸混合膠束(PTX/CPP-HE-PM)制備及粒徑測定按質(zhì)量比(1∶9∶1)稱取acrylate-PEG-PLA、mPEG-PLA和PTX于茄形瓶中，用適量甲醇溶解，40℃旋蒸至溶劑完全除去，再加入4mLpH8.0Hepes緩沖液水化15min，并用0.22μm濾膜過濾后置于西林瓶中，加入1.2倍acrylate-PEG-PLA摩爾量的CPP-HE，攪拌反應(yīng)24h得到CPP-HE修飾的紫杉醇聚合物膠束。按質(zhì)量比(10∶1)稱取mPEG-PLA和PTX于茄形瓶中，用適量甲醇溶解，40℃旋蒸至溶劑完全除去，再加入4mLpH8.0Hepes緩沖液水化15min。并用0.22μm濾膜過濾。Malvern激光粒度儀測定PTX/CPP-HE-PM粒徑和多分散系數(shù)(polydispersityindex，PDI)，結(jié)果見圖2，CPP-HE修飾的聚合物膠束粒徑為25.3±0.4nm，多分散系數(shù)為0.10±0.03，粒徑分布較好。PM和CPP-HE-PM在不同pH緩沖液里的Zeta電位取PM和CPP-HE-PM溶液適量，以不同pH的緩沖液稀釋，采用ZetaPlus電位粒徑分析儀測定Zeta電位。結(jié)果見圖3，普通聚合物膠束PM在不同pH環(huán)境中表面都帶負(fù)電荷，而pH敏感性的CPP-HE-PM在生理?xiàng)l件下，CPP的正電荷被HE的負(fù)電荷中和，表現(xiàn)出的電位為負(fù)，而在腫瘤的弱酸性微環(huán)境下，H被質(zhì)子化，HE的負(fù)電荷減弱，干擾HE與CPP靜電結(jié)合的穩(wěn)定性導(dǎo)致HE與CPP分離，使CPP恢復(fù)激活狀態(tài)，在內(nèi)涵體和溶酶體酸性更強(qiáng)的環(huán)境下，質(zhì)子化作用更強(qiáng)，CPP-HE-PM表面正電荷更強(qiáng)。試驗(yàn)例1膠束體外細(xì)胞評價(1)空白膠束毒性評價取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞以1×105個/孔接種于96孔板中，完全培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)24h，移去培養(yǎng)液，每孔加入200μL用不同pH(pH7.4和pH6.5)的不含血清的培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的CremophorEL：乙醇＝1∶1(v/v)溶媒、空白mPEG-PLA膠束(PM)和CPP-HE修飾的空白混合膠束(CPP-HE-PM)，于37℃孵育48h后，加入20μL的5mg/mL的MTTPBS溶液，37℃孵育4h。棄去上清液，加入150μLDMSO溶解藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶，采用酶標(biāo)儀于570nm測定吸光度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞存活率。以不含血清的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，相同操作作為對照。結(jié)果見圖4，紫杉醇的市售制劑為其中主要含有聚氧乙烯蓖麻油和乙醇兩種輔料，在250μg/mL以上表現(xiàn)出了一定的細(xì)胞毒性，大于1000μg/mL以上，有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。而空白PM和空白CPP-HE-PM與的聚氧乙烯蓖麻油和乙醇混合物相比，細(xì)胞毒性較小，具有較高的安全性。當(dāng)膠束濃度在0.5μg/mL～1mg/mL范圍內(nèi)時，空白PM和空白CPP-HE-PM在不同pH下(pH7.4和pH6.5)對4T1細(xì)胞生長沒有明顯毒性，表明，可以排除空白PM和空白CPP-HE-PM在載藥細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中對4T1細(xì)胞毒的干擾。。(2)載藥膠束毒性評價取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞以1×105個/孔接種于96孔板中，完全培養(yǎng)液37℃孵育24h后，移去培養(yǎng)液，每孔加入200μL用不同pH(pH7.4和pH6.5)的不含血清的培養(yǎng)液稀釋成不同PTX濃度的PTX/PM和PTX/CPP-HE-PM，于37℃孵育48h后，加入20μL的5mg/mL的MTTPBS溶液。37℃孵育4h后，棄去上清液，加入150μLDMSO溶解藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶，采用酶標(biāo)儀于570nm測定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。以不含血清的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，相同操作作為對照。結(jié)果見圖5，在0.5μg/mL-30μg/mL的PTX濃度范圍內(nèi)，幾乎在所有考察的PTX濃度下，PTX/CPP-HE-PM在pH6.5下對4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性都顯著大于其在pH7.4條件下對4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性。并且在20μg/mL的PTX濃度以下，PTX/CPP-HE-PM和PTX/PM對4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性都大于對4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性，只有在高PTX濃度(20μg/mL和30μg/mL)才能表現(xiàn)出對4T1細(xì)胞較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。而在所用考察的PTX濃度下，PTX/CPP-HE-PM對4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性都大于PTX/PM對4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性。與在pH7.4下相比，和PTX/PM在pH6.5下對4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性都沒有提高。表明，pH敏感性的CPP-HE在pH6.5下由于H被質(zhì)子化干擾HE與CPP靜電結(jié)合的穩(wěn)定性導(dǎo)致HE與CPP分離使CPP恢復(fù)激活狀態(tài)，與pH7.4條件下的較強(qiáng)負(fù)電荷相比，促進(jìn)了4T1對PTX/CPP-HE-PM的攝取，增加了PTX/CPP-HE-PM細(xì)胞的細(xì)胞毒性。并且CPP-HE能夠更有效的在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)PTX，相較于市售制劑和非pH敏感的普通PM，能夠在相對低的PTX濃度下，對4T1細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。。(3)細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)以熒光物質(zhì)香豆素6(C6)模擬藥物，分別制備mPEG-PLA膠束(C6/PM)和CPP-HE修飾的混合膠束(C6/CPP-HE-PM)。取對數(shù)生長期的Hela、4T1細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板中，完全培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)48h，移去培養(yǎng)基，用PBS(pH7.4)洗3次，每孔加入2mL用不同pH(pH6.0、6.5、7.0和7.5)的不含血清的培養(yǎng)液稀釋成一定C6濃度的C6/PM和C6/CPP-HE-PM，于37℃孵育2h后，棄去含制劑的培養(yǎng)液，用4℃PBS洗滌3次，加入500μL胰蛋白酶消化，加入1mL4℃PBS終止消化，輕吹打細(xì)胞10次后轉(zhuǎn)移至離心管，再用1mL4℃PBS洗滌6孔板，轉(zhuǎn)移后合并，1000r×5min離心后棄掉上清液，再用1mLPBS洗滌1次，最后加入500uLPBS重懸，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定分析(Ex＝488nm；Em＝530nm)，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，結(jié)果見圖6(a)、圖6(b)，C6/PM在不同pH下兩種細(xì)胞的攝取量沒有顯著的差別，而C6/CPP-HE-PM在Hela和4T1兩種細(xì)胞中的攝取量存在pH依賴性，在pH6.0、6.5、7.0條件下Hela和4T1兩種細(xì)胞中的攝取量分別是pH7.5的2.65倍、2.15倍、1.47倍和2.92倍、2.38倍1.77倍。表明pH敏感性的CPP-HE-PM在腫瘤弱酸微環(huán)境發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)，即在正常生理pH條件下，CPP所帶正電被HE的負(fù)電荷中和，表現(xiàn)為非激活狀態(tài)，降低聚合物膠束的細(xì)胞攝取和膜結(jié)合能力；在腫瘤弱酸性微環(huán)境中，H被質(zhì)子化，HE的負(fù)電荷減弱，干擾HE與CPP靜電結(jié)合的穩(wěn)定性導(dǎo)致HE與CPP分離使CPP恢復(fù)激活狀態(tài)，此時聚合物膠束系統(tǒng)的細(xì)胞攝取和膜結(jié)合能力均處于較高水平。聚合物膠束表面負(fù)電荷變?yōu)檎姾?，促進(jìn)了與帶負(fù)電荷的腫瘤細(xì)胞膜表面靜電吸附，增加了腫瘤細(xì)胞對聚合物膠束的攝取。而非pH敏感的PM表面電荷不隨pH的改變而改變，始終為負(fù)電荷，在不同pH下，細(xì)胞攝取量沒有顯著的變化。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3