本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種lunasin-多串聯(lián)多肽的制備方法。

背景技術(shù)：

Lunasin是一種含有43個(gè)氨基酸的新型多肽，具有抗癌、抗炎及降低膽固醇等生理功效。Lunasin多肽分子量為5kDa。目前，Lunasin多肽的生產(chǎn)方法主要可以通過化學(xué)合成法，也可以通過基因工程法。

然而，利用化學(xué)合成方法成本較高，成品價(jià)格昂貴，不適合大量生產(chǎn)；基因工程法則周期短、成本低，是多肽合成的主要方法之一。中國專利2016101827612公開了“一種重組lunasin多肽在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)、純化以及活性鑒定方法”，然而由于Lunasin多肽的分子量小，所以重組工程菌lunasin表達(dá)量偏低，且純化過程lunasin多肽損失較大。

因此，本發(fā)明提出一種lunasin-多串聯(lián)多肽的制備方法，從而解決現(xiàn)有的上述問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種lunasin-多串聯(lián)多肽的制備方法，其通過基因工程的方法，將四個(gè)lunasin基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后定向串聯(lián)；在C端融合組氨酸標(biāo)簽；將得到的基因構(gòu)建到酵母菌的表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化酵母菌；誘導(dǎo)表達(dá)串聯(lián)多肽。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種lunasin-多串聯(lián)多肽的制備方法，所述制備方法包括：通過基因工程的方法，將多個(gè)lunasin基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后定向串聯(lián)；在C端融合組氨酸標(biāo)簽；將得到的基因構(gòu)建到酵母菌的表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化酵母菌；誘導(dǎo)表達(dá)串聯(lián)多肽。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述制備方法包括以下步驟：

1)串聯(lián)多肽的多核苷酸序列設(shè)計(jì)

根據(jù)lunasin氨基酸序列，采用酵母偏愛密碼子人工合成lunasin-多串聯(lián)多肽基因，同時(shí)在5’端及3’端引入EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增；

2)重組工程菌的構(gòu)建

將步驟1)得到的編碼lunasin-多串聯(lián)多肽的完整基因連接到pPIC 9K質(zhì)粒中；再通過熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)擴(kuò)增，提取得到重組表達(dá)質(zhì)粒；

將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-lunasin經(jīng)Sac I線性化酶切，將經(jīng)酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒與感受態(tài)畢赤酵母GS115細(xì)胞按比例混合后，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子分別接種于MM培養(yǎng)基和MD培養(yǎng)基；經(jīng)過PCR鑒定及G418高抗性篩選，陽性克隆為重組工程菌GS115/pPIC9K-lunasin；

3)lunasin-多串聯(lián)多肽的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將步驟2)篩選得到的穩(wěn)定高產(chǎn)菌株，使用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，收集培養(yǎng)基上清，采用TCA沉淀蛋白，將蛋白重懸后利用SDS-PAGE及Western-blot鑒定；當(dāng)鑒定結(jié)果為陽性后，使用鎳瓊脂糖親和層析柱進(jìn)行純化，得到高純度lunasin-多串聯(lián)多肽。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，多個(gè)lunasin基因?yàn)樗膫€(gè)lunasin基因。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟1)中l(wèi)unasin氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，lunasin-多串聯(lián)多肽序列如SEQ ID No.2所示。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟2)具體為：

使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶切，將用相同限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶切的質(zhì)粒pPIC 9K與酶切后的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)擴(kuò)增，提取得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-lunasin；

將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-lunasin經(jīng)Sac I線性化酶切后，電擊轉(zhuǎn)化入感受態(tài)畢赤酵母GS115細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子分別接種于MM培養(yǎng)基和MD培養(yǎng)基，30℃倒置恒溫培養(yǎng)2-3d，在MD培養(yǎng)及生長良好而在MM培養(yǎng)基上不生長的菌落，挑取進(jìn)行PCR鑒定；

經(jīng)過PCR鑒定及G418高抗性篩選，陽性克隆為重組工程菌GS115/pPIC9K-lunasin。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，PCR鑒定使用的載體通用引物如下：

5’AOX引物序列：GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC

3’AOX引物序列：GGA TGT CAG AAT GCC ATT TGC。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟3)lunasin-多串聯(lián)多肽的誘導(dǎo)表達(dá)包括：

挑選7個(gè)抗生素篩選后的單克隆，于2.5ml YPD液體培養(yǎng)基，30℃，220r培養(yǎng)12h；

配制PH6.0的BMGY培養(yǎng)基，分別接種200ul菌液，30℃，220r培養(yǎng)到OD600為5.0，離心，換成PH 6.0的BMMY培養(yǎng)基，每12h加入0.5％甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度29℃，220rpm誘導(dǎo)表達(dá)72h；

搖瓶發(fā)酵結(jié)束后取樣進(jìn)行SDS-PAGE及Western-blot鑒定。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟3)的鎳瓊脂糖親和層析柱純化包括：

取15mL Ni-NTA，10倍柱床體積的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。將上清與柱料混勻，4℃孵育2h；

樣品上柱，流速為2mL/min，收集穿透液；

使用10倍柱床體積的Binding Buffer清洗柱子，流速10mL/min；

使用Wash Buffer洗雜，流速5ml/min，收集洗脫液；

使用Elution Buffer洗脫，流速2ml/min，收集洗脫液；

其中，Binding Buffer為20mMTris，pH＝7.4；Wash Buffer為20mMTris，10mM咪唑，pH＝7.4；Elution Buffer為20mMTris，500mM咪唑，pH＝7.4；

通過SDS-PAGE電泳分析后，將500mM咪唑洗脫組分透析到20mMTris，pH＝7.4的透析buffer中，過濾分裝，-80℃保存。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟3)所述的高純度lunasin-多串聯(lián)多肽的純度大于95％。

本發(fā)明上述技術(shù)方案，具有如下有益效果：

本發(fā)明通過基因串聯(lián)法能夠利用目的基因兩端的酶切位點(diǎn)或者PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)多拷貝串聯(lián)，從而提高小分子蛋白或多肽表達(dá)量。另外，在重組蛋白末端融合多個(gè)組氨酸成串的肽段(組氨酸標(biāo)簽)，憑借其與二價(jià)金屬離子的螯合作用，可提高重組蛋白的純化效率，并可使用針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的抗體來檢測該融合蛋白的表達(dá)。

本發(fā)明首次采用酵母偏愛密碼子，合成lunasin-多串聯(lián)基因片段，并融合組氨酸標(biāo)簽，將其整合進(jìn)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備lunasin-多串聯(lián)多肽，提高lunasin產(chǎn)量及純化效率。純化的lunasin-多串聯(lián)多肽經(jīng)HPLC檢測，其純度為95％以上。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒SacI線性化PCR圖。

圖2A為本發(fā)明的宿主菌GS115。

圖2B為本發(fā)明的宿主菌GS115轉(zhuǎn)化后的單克隆。

圖3為本發(fā)明的陽性克隆PCR鑒定結(jié)果。

圖4為本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白SDS-PAGE圖。

圖5為本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物Western-blot圖。

圖6為本發(fā)明的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物純化后SDS-PAGE圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述，以便于進(jìn)一步理解本發(fā)明。若本發(fā)明未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件以及常規(guī)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)規(guī)定的配方及方法進(jìn)行。本發(fā)明未特別指明的物質(zhì)均為來源于普通市面。

實(shí)施例1串聯(lián)多肽的多核苷酸序列設(shè)計(jì)

根據(jù)現(xiàn)已知的lunasin多肽氨基酸序列(如SEQ ID No.1所示：SKWQHQQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD)，采用酵母偏愛密碼子人工合成lunasin-多串聯(lián)多肽基因，同時(shí)在5’端及3’端引入EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)。該基因序列設(shè)計(jì)如下：

GAA TTC TCC AAA TGG CAG CAT CAG CAG GAC AGT TGC AGA AAG CAG CTG CAA GGT GTT AAT CTT ACA CCT TGC GAA AAG CAC ATC ATG GAA AAG ATA CAA GGC AGA GGC GACGAC GAC GAT GAT GAT GAT GAC GAC TCA AAG TGG CAA CAT CAG CAG GAT TCC TGT AGG AAA CAG TTA CAA GGT GTC AAC CTT ACT CCC TGC GAA AAA CAC ATT ATGGAA AAA ATA CAA GGA AGA GGT GAC GAC GAC GAC GAT GAC GAC GAC GAC AGT AAG TGG CAA CAT CAA CAA GAC TCT TGC AGA AAA CAG CTA CAA GGA GTC AAT TTAACC CCC TGC GAA AAA CAT ATC ATG GAA AAA ATA CAG GGA AGA GGT GAT GAT GAT GAC GAC GAT GAT GAC GAT AGT AAA TGG CAA CAT CAG CAA GAT AGT TGC AGAAAG CAA TTG CAG GGC GTG AAT CTA ACG CCA TGC GAG AAG CAC ATC ATG GAG AAG ATT CAA GGC AGG GGA GAC GAC GAT GAT GAT GAC GAC GAC GAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT TAA GCG GCC GC(SEQ ID No.2)。

實(shí)施例2重組工程菌的構(gòu)建

為了獲得大量的基因，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。

設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物為(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)：

上游引物：5’-GGAATT CTC CAA ATG GCA GCAC-3’；

下游引物：5’-TTG GCC GCG TCG TCG TCA TCA TC-3’。

PCR條件為：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min。

使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶切，將用相同限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K與酶切后的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接。

將得到的編碼lunasin-多串聯(lián)多肽的完整基因連接到pPIC 9K質(zhì)粒后，再通過熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)擴(kuò)增，提取得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-lunasin。

將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-lunasin經(jīng)Sac I線性化酶切，將經(jīng)酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒與感受態(tài)畢赤酵母GS115細(xì)胞按比例混合后，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子分別接種于MM培養(yǎng)基和MD培養(yǎng)基；經(jīng)過PCR鑒定及G418高抗性篩選，陽性克隆為重組工程菌GS115/pPIC9K-lunasin。

上述酶切體系為：10*buffer 2uL,EcoR I 0.5uL,Not I 0.5uL,載體10uL/目的基因6uL，ddH₂O補(bǔ)足20uL,37℃反應(yīng)2h。

上述連接體系為：2*buffer 5uL，載體1uL，目的基因3.5ul，T4連接酶0.5uL，4℃反應(yīng)過夜。

上述畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化的方法具體為：

挑取YPD平板上GS115菌株接種進(jìn)入50ml YPD培養(yǎng)基，30℃，220rpm培養(yǎng)至OD＝1.3-1.5，然后冰浴30min。4℃，1500rpm，離心5min沉淀細(xì)胞，于10ml冰冷的無菌去離子水懸浮。4℃，1500rpm，離心5min沉淀細(xì)胞，于5ml冰冷的無菌去離子水懸浮。4℃，1500rpm，離心5min沉淀細(xì)胞，于2ml冰冷的無菌1M山梨醇懸浮。4℃，1500rpm，離心5min沉淀細(xì)胞，于200ul冰冷的無菌1M山梨醇懸浮。分裝80ul/管。取8ul線性化的單拷貝質(zhì)粒加入200ul GS115感受態(tài)細(xì)胞并輕輕混勻，轉(zhuǎn)入2mm預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，冰上放置5min，放入電轉(zhuǎn)儀，電擊，電壓：1500V，電擊時(shí)間4.5ms，電擊完成后，立即加入1ml 1M預(yù)冷的山梨醇，混勻后轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，30℃，靜止1-2h，每100ul涂含500ug/ml G418的MD平板。培養(yǎng)后，將菌用無菌水吹下，稀釋1000倍后，再每100ul分別涂含1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、G418的YPD平板，30℃培養(yǎng)36h觀察。

上述陽性重組菌PCR鑒定具體為：

使用載體通用引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)

5’AOX引物序列：GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC

3’AOX引物序列：GGA TGT CAG AAT GCC ATT TGC

陽：以pPIC9k-LUNASIN質(zhì)粒為模板

pPIC9k-LUNASIN轉(zhuǎn)化子分別記為：GS115/pPIC9k-LUNASIN L-1--L-7(L1-7是隨機(jī)篩選得到的7個(gè)菌株)

采用標(biāo)準(zhǔn)PCR體系擴(kuò)增，各15ul體系。

PCR程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30S；52℃退火1min45S；72℃延伸50S；循環(huán)30次；72℃延伸10min；4℃保存。

實(shí)施例3lunasin-多串聯(lián)多肽的誘導(dǎo)表達(dá)

挑選7個(gè)抗生素篩選后的單克隆，于2.5ml YPD液體培養(yǎng)基，30℃，220r培養(yǎng)12h。配制BMGY(PH＝6.0)培養(yǎng)基，分別接種200ul菌液(包括GS115/pPIC9k空載)，30℃，220r培養(yǎng)到OD600＝5.0，,離心，換成培養(yǎng)基BMMY(PH＝6.0)，每12h加入0.5％甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度29℃，220rpm誘導(dǎo)表達(dá)72h。搖瓶發(fā)酵結(jié)束后取樣進(jìn)行SDS-PAGE。樣品制備如下：取600ul菌懸液離心收獲上清，取200ul上清，采用生工TCA沉淀試劑盒沉淀蛋白(BSP012)。最終蛋白重懸液體積為20ul，各上樣20ul。

12％SDS-PAGE：準(zhǔn)備12％的SDS-PAGE，Tris-Gly電泳緩沖液，上樣量20μL，濃縮膠80V 20min，分離膠120V 60min，凝膠電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色20min，脫色。

實(shí)施例4lunasin-多串聯(lián)多肽的Western-blot鑒定

首先制備聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠5％，分離膠12％)。以20μL上樣，調(diào)節(jié)電泳儀條件：80V，30min；120V,60min。電泳結(jié)束后，半干法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA,52min。將脫脂奶粉5％濃度溶解于PBS中，37℃震蕩1h。加入His標(biāo)簽一抗，震蕩60min。PBS清洗后，加入二抗，震蕩60min。最后使用TMB顯色。

制膠：制備聚丙烯酰胺凝膠：濃縮膠5％，分離膠12％。

制樣：上樣量：20μl。

電泳：濃縮膠80V，30min；分離膠120V，60min。

轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)，250mA 52min。

封閉：5％的脫脂奶粉，37℃緩慢振蕩1h。

孵育一抗：一抗為兔抗his標(biāo)簽，抗體公司：Sangon Biotech，編號(hào)：D110002，1:500稀釋，37℃緩慢振蕩60min。

孵育二抗：二抗為羊抗兔，抗體公司：Sangon Biotech，編號(hào)：D110058，1:8000稀釋，37℃緩慢振蕩60min。

顯色：TMB顯色。

實(shí)施例5lunasin-多串聯(lián)多肽的純化

根據(jù)小試表達(dá)結(jié)果，培養(yǎng)基BMMY，甲醇誘導(dǎo)濃度0.5％，發(fā)酵溫度29℃，接種量為1.5％，220rpm誘導(dǎo)表達(dá)72h。搖瓶培養(yǎng)1L進(jìn)行純化，8000rpm離心30min，收集上清透析到20mMTris，pH＝7.4，準(zhǔn)備做鎳柱親和層析。

鎳柱親和層析步驟為：

取15mLNi-NTA，用10倍柱床體積的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/min。將上清與柱料混勻，4℃孵育2h。

樣品上柱，流速為2mL/min，收集穿透液。

使用10倍柱床體積的Binding Buffer清洗柱子，流速10mL/min。

使用Wash Buffer洗雜，流速5ml/min，收集洗脫液。

使用Elution Buffer洗脫，流速2ml/min，收集洗脫液。

其中：Binding Buffer(20mMTris，pH＝7.4)

Wash Buffer(20mMTris，10mM咪唑，pH＝7.4)

Elution Buffer(20mMTris，500mM咪唑，pH＝7.4)

通過SDS-PAGE電泳分析后，將500mM咪唑洗脫組分透析到20mMTris，pH＝7.4的透析buffer中。

過濾分裝，-80℃保存。

純化的lunasin-多串聯(lián)多肽經(jīng)HPLC檢測，其純度為95％以上。

HPLC檢測條件為：分離柱為C18(4.6mm*250mm，5um)，檢測器為UV檢測器，檢測波長為215nm，流速為1mL/min，A相0.1％三氟乙酸水溶液，B相為0.1％三氟乙酸乙腈，線性梯度：B相15％～35％，20min。

本發(fā)明首次采用酵母偏愛密碼子，合成lunasin-多串聯(lián)基因片段，并融合組氨酸標(biāo)簽，將其整合進(jìn)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備lunasin-多串聯(lián)多肽，提高lunasin產(chǎn)量及純化效率。純化的lunasin-多串聯(lián)多肽經(jīng)HPLC檢測，其純度為95％以上。

雖然本發(fā)明已以實(shí)施例公開如上，然其并非用于限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，均可作各種不同的選擇和修改，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。