本發(fā)明涉及自組裝納米材料，具體地說，涉及一種高腫瘤特異性、溶酶體靶向的pH響應(yīng)形貌變換的多肽自組裝納米體系。

背景技術(shù)：

分子組裝過程在自然界中非常常見，蛋白質(zhì)的盤旋、折疊，DNA分子的雙螺旋，都是在自組裝控制下的生物化學(xué)過程，其精細(xì)、神秘的作用力甚至蘊含著生命起源的奧秘。分子自組裝的過程是一個不受外力影響的過程：其依賴于分子與分子或分子中某一片段與另一片段之間的分子識別，通過如氫鍵、范德華力、靜電力、疏水作用、π-π堆積作用等非共價的弱相互作用力形成具有特定排列順序的分子聚集體，分子有序排列的過程一旦開始，將自動進(jìn)行到某個終點，即使是形成復(fù)雜的功能體系也不需要外力的作用。近年來，自組裝技術(shù)已經(jīng)成為“自下而上”構(gòu)建納米材料的重要手段，得到了快速發(fā)展。利用自組裝技術(shù)制備納米材料具有以下幾方面的優(yōu)勢：尺寸可控，分散性好；純度高，廢物少；產(chǎn)物較穩(wěn)定，不易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象；操作儀器簡單，但對條件的控制要求精確。因此，組裝單體的設(shè)計顯得尤為重要，它有利于進(jìn)一步調(diào)控自組裝過程，得到功能性結(jié)構(gòu)。

由于其良好的生物相容性，多功能性，生物識別能力及可修飾性，多肽及多肽衍生物作為組成成分構(gòu)建的功能性材料被廣泛的用于各個領(lǐng)域，包括組織工程，藥物輸運等。大量的研究表明，通過合理設(shè)計序列或者修飾一些特殊的化學(xué)基團(tuán)，多肽不僅可以自組裝成各種各樣的納米結(jié)構(gòu)，還可以被賦予特殊的靶向性，環(huán)境響應(yīng)性或者治療活性。組成多肽的氨基酸殘基有著種類豐富的側(cè)鏈基團(tuán)，通過選擇不同側(cè)鏈的氨基酸，可精確調(diào)控組裝的發(fā)生，組裝體的形貌和尺寸；此外，氨基酸側(cè)鏈的基團(tuán)可以提供配體識別功能，是自組裝體能夠在各種各樣的條件下對外界環(huán)境產(chǎn)生響應(yīng)，廣泛存在的反應(yīng)活性基團(tuán)例如羧基，氨基，巰基等更是賦予了多肽的可修飾性。同時，多肽來源于生物體，可實現(xiàn)可控的降解過程，降解后的短肽和氨基酸還能被人體吸收，相對于其他自組裝體系，多肽自組裝有著更為廣闊的應(yīng)用前景。

溶酶體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器之一，為單層膜包被的囊狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含多種水解酶，專為分解各種外源和內(nèi)源的大分子物質(zhì)。比起正常細(xì)胞中的溶酶體，腫瘤細(xì)胞中的溶酶體數(shù)量更多，體積更大，組織蛋白酶活性更高。腫瘤細(xì)胞內(nèi)溶酶體的異常行為與腫瘤的侵襲，轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)以及不良預(yù)后有著巨大的關(guān)聯(lián)性。溶酶體在細(xì)胞死亡的過程中也扮演著重要角色。溶酶體可以釋放的組織蛋白酶到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)細(xì)胞凋亡或者細(xì)胞凋亡類似的過程。另外，腫瘤細(xì)胞中的溶酶體某些磷脂酶的缺少或者活性的降低使得溶酶體變得脆弱，對刺激敏感。因此，特異性地作用于腫瘤細(xì)胞的溶酶體以殺傷腫瘤細(xì)胞的腫瘤治療策略有著巨大的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞的多肽脂質(zhì)體，可在溶酶體酸性條件下發(fā)生形貌轉(zhuǎn)變形成納米纖維，對溶酶體產(chǎn)生擾動，釋放組織蛋白酶引發(fā)細(xì)胞凋亡，同時包載一些藥物于多肽脂質(zhì)體的親水內(nèi)腔中，進(jìn)一步加強細(xì)胞毒性作用。以此開發(fā)一種安全高效、特異性好、具有較高醫(yī)用價值的腫瘤治療策略。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供了一種多肽，其主體為6個丙氨酸形成的肽鏈，所述肽鏈的N端修飾有一個含苯環(huán)的基團(tuán)，所述肽鏈的C端連接有RGD多肽序列。

進(jìn)一步地，為了控制苯環(huán)與肽鏈N段的距離，以更好的實現(xiàn)所述多肽的自組裝，本發(fā)明利用苯甲酸、苯乙酸，苯丙酸，2-苯基丙酸，鄰甲基苯甲酸，對甲基苯甲酸，間甲基苯甲酸，鄰甲基苯乙酸，對甲基苯乙酸，間甲基苯乙酸，鄰甲基苯丙酸，對甲基苯丙酸，間甲基苯丙酸，對乙基苯甲酸，對乙基苯乙酸或?qū)σ一奖徇M(jìn)行所述肽鏈的N端修飾。

第二方面，本發(fā)明提供了一種可在腫瘤細(xì)胞溶酶體內(nèi)發(fā)生形貌轉(zhuǎn)換的多肽脂質(zhì)體，其由前述多肽自組裝形成。該多肽自組裝形成多肽脂質(zhì)體，生物兼容性好，自組裝過程中不生成共價健，沒有逆反應(yīng)，形成高度有序的納米結(jié)構(gòu)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

具體為，將所述多肽在室溫下溶于水中，調(diào)節(jié)溶液的pH至7.35-7.45使其自組裝，即得。

本發(fā)明利用固相合成制備所述多肽，在室溫下將其溶于水中，并用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4使其組裝，然后在電鏡下觀察其為脂質(zhì)體形貌。接下來將溶液pH調(diào)至5.0，在電鏡下觀察到其可發(fā)生形貌變換，形成納米纖維結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明所述多肽，在弱堿性生理pH下，可自組裝形成類似脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，在被腫瘤細(xì)胞識別通過內(nèi)吞作用進(jìn)入溶酶體后，多肽響應(yīng)溶酶體內(nèi)的酸性pH，自組裝形貌脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)變換成為納米纖維，這些納米纖維引起了溶酶體膜的透化作用，使得更多的組織蛋白酶被釋放到了細(xì)胞質(zhì)中。

本發(fā)明制備的自組裝多肽脂質(zhì)體可以特異性地靶向腫瘤細(xì)胞，并在腫瘤溶酶體內(nèi)形貌變換成納米纖維，破壞溶酶體，釋放組織蛋白酶，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

除了多肽本身具備毒性，多肽脂質(zhì)體的親水內(nèi)腔還可以載帶其他親水藥物，與多肽納米纖維協(xié)同作用，增強毒性；作為載體的多肽脂質(zhì)體，藥物釋放效率高。

作為優(yōu)選，所述藥物能夠抑制溶酶體修復(fù)，或加速溶酶體釋放組織蛋白酶。

更為優(yōu)選，將Hsp 70抑制劑分子包載到多肽脂質(zhì)體中。將多肽與腫瘤細(xì)胞孵育，制成細(xì)胞電鏡樣品，在透射電子顯微鏡下觀察多肽在細(xì)胞內(nèi)的組裝情況。然后將包載有Hsp 70抑制劑的多肽脂質(zhì)體與腫瘤細(xì)胞孵育，利用CCK-8試劑盒檢測其對細(xì)胞的毒性程度。

具體操作為：將所述多肽和Hsp70抑制劑按照1～2:0.1～0.8的質(zhì)量比溶于二甲基亞砜中，然后將其加入中性磷酸緩沖液中，100W超聲條件下超聲處理1分鐘使其分散，在室溫下孵育1小時，然后在10000g下離心15分鐘，收集上清，即得。

第三方面，本發(fā)明提供了前述多肽或前述多肽脂質(zhì)體在制備抑制腫瘤/治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及到的原料或試劑均為普通市售產(chǎn)品，涉及到的操作如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明設(shè)計了一種高腫瘤特異性、溶酶體靶向的pH響應(yīng)形貌變化的自組裝多肽，在弱堿性生理pH下，該多肽可自組裝形成類似脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)，在被腫瘤細(xì)胞識別通過內(nèi)吞作用進(jìn)入溶酶體后，多肽響應(yīng)溶酶體內(nèi)的酸性pH，自組裝形貌脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)變換成為納米纖維，這些納米纖維引起了溶酶體膜的透化作用，使得更多的組織蛋白酶被釋放到了細(xì)胞質(zhì)中。抑制溶酶體自修復(fù)作用的分子Hsp 70抑制劑可被包載到多肽脂質(zhì)體的親水內(nèi)腔中，在多肽自組裝體形貌轉(zhuǎn)換的同時釋放藥物，抑制溶酶體自修復(fù)，增強組織蛋白酶的作用。除了Hsp 70抑制劑，其他親水性小分子藥物也可以被包載到多肽脂質(zhì)體的內(nèi)腔中，與組織蛋白酶協(xié)同作用，增強細(xì)胞毒性。本發(fā)明提出了一種新的腫瘤治療策略，同時還能結(jié)合傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物進(jìn)行協(xié)同治療，并且具有良好的特異性，高的藥物釋放效率以及良好的治療效果。

附圖說明

圖1顯示多肽在不同pH環(huán)境中自組裝納米結(jié)構(gòu)的形貌。

圖2顯示多肽在細(xì)胞內(nèi)形貌轉(zhuǎn)換形成納米纖維。

圖3顯示多肽自組裝體系對細(xì)胞的毒性；其中，A、沒有包載Hsp70抑制劑，B、包載了Hsp 70抑制劑。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

利用苯甲酸和Fmoc保護(hù)的L-氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，購自吉爾生化(上海)有限公司)為原料，在二氯三苯甲基氯樹脂(購自吉爾生化(上海)有限公司)上，在本領(lǐng)域常用的耦合試劑和裂解試劑存在的條件下，通過固相合成法在樹脂上制備多肽(主體為6個丙氨酸、主體C端連接腫瘤細(xì)胞靶向肽RGD、主體N端修飾有一個苯環(huán)的多肽)。再經(jīng)過簡單的裂解反應(yīng)，將多肽從樹脂上分離下來，經(jīng)后續(xù)的沉淀、洗滌、干燥處理后制得純白色多肽粉末。

具體的實驗過程如下：

首先，取1.01g二氯三苯甲基氯樹脂(購自吉爾生化(上海)有限公司)至多肽合成裝置(購自西格瑪奧德里奇公司)，加入無水的的N,N-二甲基甲酰胺(購自西格瑪奧德里奇公司)浸泡樹脂半小時，使之充分溶脹，最后排出溶劑N,N-二甲基甲酰胺。

稱取0.2g Fmoc-Asp(tBu)-OH用5mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后將該溶液轉(zhuǎn)入到含有處理過的樹脂的多肽合成裝置中，再加入2mL催化劑二異丙基乙胺(DIEA)，室溫下讓Fmoc-Asp(tBu)-OH與樹脂相互作用約1.5小時，使其充分固定在樹脂上。

用N,N-二甲基甲酰胺沖洗樹脂3次，加入甲醇攪拌30分鐘，封閉樹脂上未反應(yīng)的活性位點，并再次用N,N-二甲基甲酰胺溶脹樹脂。

然后用體積比為1:4的哌啶(購自西格瑪奧德里奇公司)：N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)進(jìn)行保護(hù)基的脫除，反應(yīng)3次，前兩次各持續(xù)3分鐘，第三次持續(xù)20分鐘。

之后再用5mL的N,N-二甲基甲酰胺重復(fù)洗滌樹脂5次，每次持續(xù)1分鐘，直到N,N-二甲基甲酰胺洗液的pH顯中性。

稱取0.5g Fmoc-Gly-OH，0.72g 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(購自吉爾生化(上海)有限公司)，0.27g 1-羥基苯并三唑(購自吉爾生化(上海)有限公司)，用10mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后將該溶液轉(zhuǎn)入到多肽合成裝置中，再加入2毫升催化劑二異丙基乙胺(DIEA)，室溫下讓Fmoc-Gly-OH與樹脂相互作用約2小時，使其充分連接到上一個氨基酸上，N,N-二甲基甲酰胺沖洗樹脂3次，取少許樹脂加入10％茚三酮的無水甲醇(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)中加熱至沸騰，觀察樹脂顏色變化，若樹脂顏色無明顯變化，則說明第二個氨基酸已完全同上一個氨基酸偶聯(lián)，若樹脂變藍(lán)甚至發(fā)黑，則說明第二個氨基酸沒有與前一個氨基酸完全反應(yīng)，需重復(fù)連接。

重復(fù)以上步驟分別縮合Fmoc-Lys(Boc)-OH，六個Fmoc-Ala-OH。用體積比為1:4的哌啶：N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)進(jìn)行保護(hù)基的脫除之后，加入苯甲酸(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)/4mL吡啶(購自西格瑪奧德里奇公司)的混合液，反應(yīng)兩次、每次2小時。

做完茚三酮測試，確保苯甲酸已經(jīng)完全反應(yīng)完了多肽的N末端，再用5mL的二氯甲烷重復(fù)洗滌樹脂5次，每次持續(xù)1分鐘。最后，將多肽從樹脂上裂解下來，具體過程如下：首先配制裂解液：9.5mL三氟乙酸(購自西格瑪奧德里奇公司)+0.85mL 1,2-乙二硫醇(購自西格瑪奧德里奇公司)+0.5mL茴香硫醚(購自西格瑪奧德里奇公司)+0.5mL去離子水。將樹脂放入上述混合液中進(jìn)行裂解反應(yīng)3小時，之后過濾掉樹脂，在收集到的液體中加入乙醚(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)，立即出現(xiàn)白色沉淀。然后，離心分離上述懸濁液，轉(zhuǎn)速為5000rpm、離心時間5分鐘，除去上清液，進(jìn)行冷凍干燥，收集白色多肽粉末，制得多肽分子。

實施例2

將0.1mg實施例1所述多肽溶于1mL超純水，用0.1M HCl溶液和0.1M NaOH溶液將pH調(diào)到7.4，超聲1分鐘，靜置30分鐘，制備電鏡樣，在透射電子顯微鏡下觀察自組裝形貌，顯示為脂質(zhì)體類似的結(jié)構(gòu)(見圖1)。

然后將溶液pH調(diào)至5.0，靜置30分鐘，制備電鏡樣品，通過透射電子顯微鏡觀察，顯示為納米纖維形貌(見圖1)。

實施例3

透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自組裝納米纖維：將多肽與腫瘤細(xì)胞MCF-7孵育，6個小時后將細(xì)胞收集起來，4℃，1000r/min離心3分鐘，除去上層舊培養(yǎng)基。然后分別用2.5％戊二醛，1％鋨酸固定細(xì)胞，用不同濃度的乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋。然后用鉆石島將細(xì)胞切成60-90nm厚度的超薄切片，將切片置于銅網(wǎng)上，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在生物透射電子顯微鏡(HT7700)下觀察細(xì)胞內(nèi)纖維形成情況(見圖2)。

實施例4

親水藥物包載：將1.0mg實施例所得多肽和0.2mg Hsp70抑制劑溶于10μL二甲基亞砜中，然后將其加入1mL中性磷酸緩沖液中，超聲1分鐘使其分散，在室溫下孵育1小時。然后在10,000g下離心15分鐘，收集上清，即為包載了Hsp70抑制劑的多肽脂質(zhì)體。

實驗例1

1、實驗分組：

實驗組1：Hsp70抑制劑；

實驗組2：Hsp70抑制劑與未包載Hsp70抑制劑的多肽脂質(zhì)體；

其中，未包載Hsp70抑制劑的多肽脂質(zhì)體由實施例1所述多肽自組裝；將0.1mg實施例1所述多肽溶于1mL水，用0.1M HCl溶液和0.1M NaOH溶液將pH調(diào)到7.4，超聲1分鐘，在室溫下靜置孵育30分鐘，然后在10,000g下離心15分鐘，收集上清，即得。

實驗組3：包載Hsp70抑制劑的多肽脂質(zhì)體。

2、實驗方法：

將腫瘤細(xì)胞MCF-7接種到96孔板中，當(dāng)細(xì)胞長到70％左右時，分別加入不同濃度的實驗組1～3，孵育24小時。

然后用CCK-8試劑盒處理細(xì)胞1小時，用酶標(biāo)儀測定其在454nm出的吸光度，在抑制劑和多肽的協(xié)同作用大幅增強了多肽的毒性。

依據(jù)細(xì)胞生存活力與實驗組濃度的相關(guān)性繪制圖3，由圖3可知多肽脂質(zhì)體包載的Hsp 70抑制劑對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果比單獨的抑制劑或者多肽脂質(zhì)體和抑制劑分開作用更明顯。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。