一種攜帶Notch-1 shRNA的靶向磁性熒光納米載體及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種集核磁共振成像、熒光成像、靶向基因治療于一體的Fe3O4SiO2(FITC)納米載體的制備及生物醫(yī)學應用。本發(fā)明采用低毒、生物相容性良好的硅烷為原料，通過改良法首先合成摻雜有熒光染料的Fe3O4SiO2納米粒子，并將具有提高轉染效率的聚乙烯亞胺(PEI)以及能夠靶向葉酸受體的葉酸(FA)通過酰胺反應聯(lián)接在一起形成PEI-FA聚合物。通過PEI-FA進一步修飾Fe3O4SiO2(FITC)納米粒子，吸附Notch-1的shRNA形成復合納米載體。該納米載體不僅具有核磁共振成像、熒光成像的功能，還能將基因靶向輸送到腫瘤部位，沉默目標基因的表達、抑制腫瘤的生長。
【專利說明】-種攜帶Notch-1 shRNA的靶向磁性熒光納米載體及其制 備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料領域、合成一種核磁共振造影劑，具體涉及一種攜帶Notch-I shRNA的靶向磁性熒光納米載體的制備方法，及其在核磁共振成像、熒光成像及靶向基因治 療等生物醫(yī)學中的應用。

【背景技術】
[0002] 核磁共振成像是目前生物醫(yī)學上應用廣泛的成像工具，具有空間分辨率高，生物 體侵襲性低，不產(chǎn)生電離輻射等優(yōu)點。核磁共振造影劑的使用可顯著提高成像的特異性和 敏感度，從而提高MRI的成像效果，目前廣泛應用的是以四氧化三鐵為主的一類T 2加權成 像的造影劑。四氧化三鐵納米粒子是磁性納米粒子的一種，具有藥物運輸、細胞分離、以及 作為核磁共振造影劑等多種用途。但在生物醫(yī)學的應用中，四氧化三鐵納米粒子又存在許 多無法避免的缺點，例如在粒子進入體液和細胞之后，容易在細胞內發(fā)生聚集而形成較大 的粒子簇，同時四氧化三鐵納米粒子相較于其他粒子而言，膠體穩(wěn)定性低，在細胞內環(huán)境 中，容易發(fā)生氧化作用而導致其失去原本的磁性?；谝陨显颍难趸F納米粒子必須 經(jīng)過表面改性之后才能被應用到生物醫(yī)學領域中，改性之后的四氧化三鐵納米粒子具備抗 氧化、不易發(fā)生聚集、同時具有較好的膠體穩(wěn)定性等特性。
[0003] 娃納米粒子具有很多優(yōu)點。首先娃納米粒子具有較高的親水性，相對容易地溶解 在溶液中；其次硅納米粒子具有一定的穩(wěn)定性，可以穩(wěn)定地存在于體液或細胞中，不會發(fā)生 降解或其他反應；同時硅納米粒子對生物體幾乎沒有毒副作用，具有較好的生物相容性； 硅納米粒子制備方法簡單易行，價格便宜。不僅如此，硅納米粒子容易與其他分子相連，在 使用二氧化硅對磁性四氧化三鐵納米粒子進行表面修飾之后，更容易對其進行其他功能化 的修飾，更增加了磁性納米粒子的應用范圍。
[0004] Notch信號通路是一條保守的信號通路，廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，對 細胞的分化、發(fā)育、增殖和凋亡有重要的調控作用。Notch信號通路與癌癥的發(fā)生有關首先 在人類急性T淋巴細胞白血病中被證實，其原因是染色體易位導致9號染色體上的Notch-I 基因斷裂，使其胞外段丟失，從而釋放胞內區(qū)NICD激活Notch信號通路產(chǎn)生致癌作用，研究 發(fā)現(xiàn)50%以上的人類急性淋巴細胞白血病都有變異的Notch-I基因被活化，隨后的研究表 明Notch-I基因在乳腺癌，前列腺癌，子宮頸癌等多種癌細胞中，均有異常過量表達。最新 的研究也發(fā)現(xiàn)下調Notch-I基因的表達可以通過抑制Akt，mT0R，和NF-κ B信號通路來抑 制前列腺癌細胞的生長、遷移和浸潤，并誘導細胞的凋亡。因此沉默Notch-I基因可以達到 廣泛的抗腫瘤的治療效果。
[0005] shRNA (short hairpin RNA)短發(fā)卡RNA，包括兩個反向重復序列，中間由一莖環(huán) 序列分隔形成的發(fā)卡結構。當shRNA表達載體進入動物細胞內，先在核內表達成shRNA， 在細胞質中shRNA被Dicer酶剪切成siRNA，隨后siRNA與體內一些酶結合形成RNA誘導 的沉默復合物RISC，該復合物能與目的基因 mRNAs同源區(qū)特異性結合并將其降解。利用 Notch-IshRNA能夠特異性地抑制Notch-I基因的過度表達，使Notch-I基因保持在沉默狀 態(tài)，從而達到抗腫瘤的作用。
[0006] 本發(fā)明通過改良StSber法首先合成摻雜有熒光染料的Fe3O4OSiO 2納米粒子，并將 具有提高轉染效率的PEI以及能夠靶向葉酸受體的葉酸（FA)，通過酰胺反應聯(lián)接在一起形 成PEI-FA聚合物。通過PEI-FA進一步修飾Fe 3O4OSiO2 (FITC)納米粒子，吸附Notch-I的 shRNA形成復合納米載體。該納米載體不僅具有核磁共振成像、突光示蹤成像的功能，還能 將基因靶向輸送到腫瘤部位，沉默目標基因的表達、抑制腫瘤的生長，使其成為診療一體化 的多功能納米平臺，為腫瘤的診斷和治療提供有力的保證。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于：開發(fā)一種集核磁共振成像、熒光成像、靶向基因治療于一體的 診療一體化的多功能納米載體，應用于腫瘤的早期診斷和治療。
[0008] 本發(fā)明以粒徑為10-15nm的Fe3O4為內核，采用改良Stdber法合成核殼結構的 Fe3O4OSiO2的納米載體，并且摻雜熒光燃料FITC，使其具有熒光示蹤的功能，納米載體表面 修飾具有靶向功能及高轉染效率的高分子聚合物PEI-FA，進而通過靜電吸附的方式吸附上 Notch-I的shRNA基因。該納米載體不僅能用于核磁共振成像、熒光成像，還能將基因靶向 高效地輸送到腫瘤部位，從而抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞的凋亡，為腫瘤的治療提 供一種新的治療模式。
[0009] 本發(fā)明還提供上述攜帶Notch-1 shRNA的祀向磁性突光納米粒載體的制備方法。 其制備方法包括以下步驟：
[0010] (1)將異硫氰酸熒光素（FITC)、氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS)溶于無水乙醇中，避 光置于搖床中進行震蕩。
[0011] (2)磁流體與氨水分散在無水乙醇中。置于搖床震蕩，并向其中迅速加入TE0S，避 光，置于搖床中震蕩。震蕩后向其中加入占總體積10%-50%的APTMS-FITC繼續(xù)震蕩。并 將反應產(chǎn)物反復用雙蒸水洗滌，4°C保存。
[0012] (3) DCC和NHS的體積比為0. 1-1:1，加入葉酸的量占總體積的20% -60%，搖床震 蕩。
[0013] (4)向上述葉酸溶液中加入PEI溶液，使其終濃度為0. 5% -5%，置于搖床中震蕩 反應，將反應物置于透析袋中透析。
[0014] (5)將上述透析袋中液體置于容器中冷凍干燥后，溶于雙蒸水中，制得的PEI-FA 懸液備用。
[0015] (6)將上述PEI-FA與Fe3O4OSiO2按質量比為1:1-10混合，磁力攪拌。反應結束后 用水反復洗3遍，最后所得固體溶于雙蒸水中。并且混合一定量的DNA，室溫孵育得到吸附 基因的靶向磁性熒光納米載體。
[0016] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0017] (1)本發(fā)明制備方法具有反應條件溫和、操作簡單、成本低、無毒無污染等優(yōu)點。
[0018] (2)合成的Fe3O4OSiO2 (FITC)納米載體具有很好的穩(wěn)定性和分散性，納米載體具 有超順磁性,無頑磁剩磁現(xiàn)象產(chǎn)生,可用于核磁共振成像。
[0019] (3)納米載體殼層中摻雜有熒光染料，該納米載體可用于熒光示蹤和成像。
[0020] (4)聯(lián)接至納米載體表面的葉酸（FA)分子，對葉酸受體高表達的腫瘤細胞具有靶 向識別和高結合的能力，PEI分子能增強該納米載體進入細胞的能力，從而本發(fā)明合成的納 米載體具有很強的腫瘤細胞的靶向性特征。
[0021] (5)納米載體表現(xiàn)為低毒性，納米載體對所載基因有保護作用，進入腫瘤細胞后能 有效轉錄、沉默目的基因 Notch-I的表達，抑制腫瘤細胞生長。
[0022] (6)此種納米載體穩(wěn)定、保存時間長，便于在生物醫(yī)學領域應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1復合納米載體的合成示意圖
[0024] 圖 2Fe304@Si02 (FITC)納米粒子的透射電鏡圖⑷ Fe3O4OSiO2 (FITC) /PEI-FA/ Notch-1 shRNA的掃描電鏡圖（B)
[0025] 圖3納米載體的磁滯回線
[0026] 圖4核磁共振氫普（1HNMR)測試PEI-FA譜圖
[0027] 圖5多種納米載體作用人類乳腺癌細胞株（MDA-MB-231)不同時間后細胞增殖情 況對比圖
[0028] 圖6多種納米載體作用人類乳腺癌細胞株（MDA-MB-231)后Notch-I蛋白的表達 圖譜
[0029] 圖7不同濃度的納米粒子作用于人類乳腺癌細胞株（MDA-MB-231)的T2核磁共振 成像效果圖（A)及定量分析磁響應時間的R 2值（B) 具體實施例

【具體實施方式】 [0030] 是對本發(fā)明做進一步說明，并不用來限制本發(fā)明的保護范圍。
[0031] 實施例1 :靶向磁性熒光納米載體的合成
[0032] ①本納米粒子以Fe3O4為內核，以SiO2為外殼，并摻雜熒光染料FITC，載體表面修 飾有PEI-FA來吸附Notch-I的shRNA基因。其合成示意圖如圖1所示。
[0033] ②納米粒子粒徑均一，形態(tài)規(guī)則，成均勻的球型，粒徑約60_70nm左右，在水溶液 狀態(tài)下分散良好。
[0034] ③此種納米粒子不僅具有核磁共振成像、熒光成像的功能。通過表面修飾的 具有靶向功能的高分子聚合物PEI-FA，使其能靶向葉酸受體高表達的人類乳腺癌細胞 (MDA-MB-231)，釋放出所攜帶的基因，沉默相應蛋白的表達。
[0035] 實施例2 =Fe3O4OSiO2(FITC)納米粒子的制備
[0036] ①將Iml雙蒸水、l_5ml磁流體、5-10ml無水乙醇和200 μ 1氨水，置于搖床中 300rpm 震蕩 10_30min。
[0037] ②向上述反應體系中迅速加入5-10 μ 1正硅酸乙酯（TEOS)，避光，置于搖床中， 300rpm 震蕩 24h。
[0038] ③再向上述反應體系中加入l-5ml FITC-APTMS溶液，置于搖床中，300rpm繼續(xù)震 湯 48h。
[0039] ④將上述溶液均勻分裝在EP管中，12000rpm離心5min，棄上清，分別加入Iml雙 蒸水，超聲使其重懸，如此用雙蒸水反復清洗5次。最后所得Fe 3O4OSiO2 (FITC)固體溶于雙 蒸水中，4 C保存，待用。
[0040] 本實例所得納米粒子大小均一，并呈均勻的球型，分散性良好，粒徑在65nm左右。
[0041] 實施例 3 :Fe304@Si02 (FITC) /PEI-FA/Notch-1 shRNA 的制備
[0042] ①稱取葉酸粉末20mg，加入5ml DMS0,使葉酸完全溶解，濃度為4mg/ml。取5-10ml 葉酸溶液，分別加入4-10ml DCC和4-10ml NHS，置于搖床中300rpm，震蕩IOmin.
[0043] ②加入適量的PEI (20mg/ml)繼續(xù)震蕩12h,反應完成后,將反應物置于透析袋中， 透析48h。并將透析袋中的液體置于玻璃瓶中，冷凍干燥。
[0044] ③取干燥后的固體2g，溶于雙蒸水中，制得20mg/ml的PEI-FA懸液
[0045] ④按實施例2方法先制備得到Fe3O4OSiO2 (FITC)。
[0046] ⑤將上述PEI-FA與Fe3O4OSiO2 (FITC)按質量比為1:5-10混合，磁力攪拌2h轉速 為300rpm。反應結束后用水反復洗3遍，最后所得固體溶于雙蒸水中。
[0047] ⑥實驗前按10:1質量比把合成好的Fe3O4OSiO 2 (FITC)/PEI-FA與質粒DNA混合， 室溫靜止30min以上即可使用。
[0048] 本實例所得的納米粒子電鏡圖如圖2所示，納米粒子呈現(xiàn)明顯的核殼結構，粒徑 均一，分散性良好。
[0049] 實施例4 :量子干涉儀對納米粒子超順磁性的分析
[0050] Fe3O4納米粒子具有超順磁性，在外加磁場的作用下粒子能夠在向磁場方向聚集， 具有磁靶向性。因此我們使用量子干涉儀對Fe 3O4IgSiO2(FITC)、Fe3O4OSiO 2 (FITC)/PEI-FA、 Fe3O4OSiO2 (FITC)/PEI-FA/shRNA三種納米載體進行磁性分析，結果如圖3所示，三種納米 粒子都具有超順磁性，無頑磁剩磁現(xiàn)象產(chǎn)生，證明合成的納米載體都具有超順磁性，可以用 于后期的核磁共振成像。
[0051] 實施例5 :葉酸與PEI連接確認
[0052] 用DCC和NHS活化葉酸上的羧基，然后與PEI上的氨基發(fā)生酰胺反應，形成PEI-FA 復合物。PEI-FA的核磁共振氫譜圖如圖4所示，化學位移2. 0-3. O代表PEI亞甲基氫的信 號，在化學位移6. 5-9. O處表示葉酸苯環(huán)上特征性氫的信號。由此可說明PEI和FA成功的 偶聯(lián)在一起。葉酸分子對葉酸受體高表達的腫瘤細胞具有靶向識別和高結合的能力，PEI分 子能增強該納米載體進入細胞的能力。PEI-FA對納米載體的修飾，不僅提供了基因轉運的 功能，還同時具備了細胞靶向性和提高細胞轉染效率的雙重優(yōu)勢。
[0053] 實施例6 :攜帶基因的靶向磁性熒光納米粒子Fe3O4IgSiO2(FITC)/PEI-FA/Notch shRNA對腫瘤細胞增殖的影響
[0054] ①將人類乳腺癌細胞MDA-MB-231培養(yǎng)、消化后，按每孔8X IO3個細胞的密度接種 到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0055] ②棄去舊的培養(yǎng)基，更換為無血清培養(yǎng)基，按照以下分組向每孔加入不同的粒子 各10 μ g (每組重復3個復孔），充分混勻，繼續(xù)孵育6h。
[0056]第一組：Fe304@Si02 ;
[0057] 第二組：Fe304@Si02/PEI/SC shRNA ;
[0058] 第三組：Fe304@Si02/PEI/Notch-l shRNA ;
[0059] 第四組：Fe304@Si02/PEI-FA/SC shRNA
[0060] 第五組：Fe304@Si02/PEI-FA/Notch-l shRNA
[0061] ③培養(yǎng)6h后，吸出培養(yǎng)基，用PBS沖洗3遍，更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h、 48h、72h。
[0062] ④向每孔中加入含20 μ I CCK-8溶液的培養(yǎng)基孵育lh，用酶標儀檢測在450nm處 的OD值。按以下公式計算細胞存活率，細胞存活率=(A實驗組-As自組）AAms-A s自組），每 組實驗重復三次。
[0063] 圖5表示的是各種納米復合物攜帶基因后對腫瘤的治療能力，可以看到具有靶 向能力的載體攜帶No t ch-1 shRNA后能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖，隨著時間的增加抑 制效果更為明顯。該實驗說明了 Fe304@Si02/PEI-FA/N〇t Ch-lShRNA被人類乳腺癌細胞 MDA-MB-231高效內吞后，能夠沉默相應的基因表達，抑制腫瘤細胞的增殖，達到治療腫瘤的 作用。
[0064] 實施例7 :攜帶基因的靶向磁性熒光納米載體（Fe304@Si02/PEI-FA/Notch-lshRNA) 對Notch-I蛋白表達的影響。
[0065] 為了評價Fe304@Si02/PEI-FA作為Notch-IshRNA基因載體的有效性，我們采用 Western Blot檢測了 Notch-I蛋白表達水平。具體步驟如下：
[0066] ①將MDA-MB-231細胞消化后，按每孔5 X IO5個細胞的密度，接種在6孔板中，繼 續(xù)培養(yǎng)24h。
[0067] ②取出培養(yǎng)好的MDA-MB-231細胞，按照以下分組向每孔中加入不同粒子各 10 μ g，充分混勻，繼續(xù)孵育6h。
[0068]第一組：Fe304@Si02 ;
[0069] 第二組：Fe304@Si02/PEI/SC shRNA ;
[0070] 第三組：Fe304@Si02/PEI/Notch-lshRNA ;
[0071] 第四組：Fe304@Si02/PEI-FA/SC shRNA
[0072] 第五組：Fe304@Si02/PEI-FA/Notch-lshRNA
[0073] ③培養(yǎng)6h后，吸出培養(yǎng)基，用PBS沖洗3遍，更換新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72h， 提取總蛋白，通過Western Blot檢測Notch-I蛋白的表達水平。
[0074] 結果如圖6所示，當向細胞內用Fe304@Si0 2/PEI來轉染Scramble shRNA時蛋白的 表達量與對照組的相同，而用Fe304@Si02/PEI來轉染Notch-IshRNA時，蛋白表達量稍有下 調，但當用Fe 304@Si02/PEI-FA來轉染Notch-IshRNA時，蛋白表達量明顯下調。這就說明 Fe304@Si02/PEI_FA納米載體確實能夠將Notch-IshRNA靶向輸送到腫瘤部位，使其mRNA降 解，抑制其蛋白的表達。
[0075] 實施例8 :核磁共振造影劑成像效果研究
[0076] 由于Fe3O4OSiO2 (FITC)/PEI-FA納米粒子具有很好的超順磁性，是理想的核磁共 振造影劑，因此我們使用3T核磁共振成像系統(tǒng)對Fe 3O4OSiO2(FITC)/PEI-FA納米載體作 為造影劑的體外成像效果進行檢測。圖7 (A)是Fe3O4OSiO2 (FITC) /PEI-FA納米載體作 用于MDA-MB-231細胞時T2核磁共振成像的效果圖。隨著MDA-MB-231細胞內吞Fe 3O4O SiO2 (FITC) /PEI-FA納米載體的量逐漸增加，作為核磁共振成像造影劑成像效果越來越好， 當Fe元素的濃度達到25. 6 μ g/ml時，造影效果最為明顯，證明Fe3O4OSiO2 (FITC)/PEI-FA納 米粒子的確是比較理想的核磁共振T2造影劑。圖7 (B)是定量分析磁響應時間的R2值，隨 著Fe元素濃度增加，R2的值越來越大，符合核磁共振造影劑的要求。
[0077] 以上所述為本發(fā)明的較佳實施例，但本發(fā)明不應該局限于該實施例所公開內容。 所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的原理下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明的保護范圍。
【權利要求】
1. 一種核殼結構的磁性突光納米載體，磁性內核為Fe304外殼為Si02,其特征在于：所 述納米載體的二氧化硅殼層內部摻雜熒光染料，納米載體表面修飾有葉酸作為靶向分子， 攜帶Notch-lshRNA質粒作為靶向基因。
2. -種如權利要求1所述的靶向磁性熒光納米載體的制備方法，其特征在于，包括如 下步驟： A. 將異硫氰酸熒光素（FITC)、氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS)溶于無水乙醇中，避光，搖 床震蕩，形成APTMS-FITC; B. 將磁流體和氨水溶于稀釋的無水乙醇中，置于搖床震蕩，再將正硅酸乙酯（TE0S)加 入其中，置于搖床震蕩形成Fe30 4@Si02納米粒子； C. 將APTMS-FITC與Fe304@Si02納米粒子混合，置于搖床震蕩，形成Fe 304@Si02 (FITC); D. 向N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)和N，N' -二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)的混合溶液中加 入葉酸，置于搖床中震蕩，進行葉酸活化，向其中加入PEI，收集沉淀物，溶于雙蒸水中，制得 PEI-FA 懸液； E. 將 Fe304@Si02 (FITC)和 PEI-FA 懸液混合，磁力攪拌，得到 Fe304@Si02 (FITC) /PEI-FA 納米載體； F. 將上述Fe304@Si02 (FITC) /PEI-FA溶液混合質粒DNA，室溫反應得到攜帶基因的靶向 磁性熒光納米載體。
3. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟A中所述的FITC的濃度為 0· 1-lmg/ml，F(xiàn)ITC 與 APTMS 的體積比為 10-50:1。
4. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟B中所述磁流體與氨水的體積比 為1-10:1，所加入的TE0S的量占總體積的1% -10%。
5. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟C所述的APTMS-FITC的加入量占 總體積的10% -50%。
6. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟D中加入DCC和NHS的體積比為 0. 1-1:1 ;加入葉酸的量占總體積的10% -60% ;加入PEI的終濃度為0. 5% -5%。
7. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟E中所述的Fe304@Si02 (FITC)和 PEI-FA的質量比為1-10:1。
8. -種如權利要求1或2所述的靶向磁性熒光納米載體，在生物醫(yī)學領域中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK104288791SQ201410549427
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權日:2014年10月16日
【發(fā)明者】劉貽堯, 李亭亭, 李穎, 楊紅 申請人:電子科技大學