1.一種丙谷二肽的制備方法,其特征在于:以L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、ADP和乙酰磷酸為原料,加入氨基酸連接酶和乙酸激酶,在pH 6.5-9.5、32-42℃溫度條件下通過酶促反應(yīng)偶聯(lián)催化合成丙谷二肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丙谷二肽的制備方法,其特征在于:具體步驟如下:
(1)分別構(gòu)建氨基酸連接酶的基因重組表達載體pET-His-ywfE和乙酸激酶的基因重組表達載體pET-His-ack,其中,所述氨基酸連接酶編碼基因來源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis,其核苷酸序列為序列表400<1>所示序列;乙酸激酶編碼基因來源于丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum,其核苷酸序列為序列表400<2>所示序列,質(zhì)粒pET-His的核苷酸序列為序列表400<3>所示序列;
(2)分別將步驟(1)中的重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Escherichia coli BL21,獲得基因工程重組菌株E.coli pET-His-ywfE和E.coli pET-His-ack;
(3)培養(yǎng)步驟(2)中的重組菌株,從而獲得表達氨基酸連接酶和乙酸激酶的菌體;
(4)破碎步驟(3)中的菌體獲得粗酶液,經(jīng)鎳柱純化后混合;
(5)將步驟(4)中獲得的混合酶液加入含有30-60mM丙氨酸、30-60mM谷氨酰胺、3.0-6.0mM ADP和30-60mM乙酰磷酸的催化液中,在pH值為7.0-9.0,溫度為32-42℃條件下進行酶促反應(yīng)合成丙谷二肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丙谷二肽的制備方法,其特征在于:所述步驟(3)中重組菌株中的培養(yǎng)方法為:重組菌株從甘油保菌管中以0.1%(v/v)的接種量接種至100mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基,于37℃200rpm培養(yǎng)12h,再按1%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接400mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基,于37℃200rpm繼續(xù)培養(yǎng);待菌株濃度OD600nm達到0.6-0.8時添加終濃度為0.1-0.3mmol/L的IPTG,28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8-10h表達蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的丙谷二肽的制備方法,其特征在于:所述LB液體培養(yǎng)基為:每10g NaCl與5g酵母粉、10g蛋白胨用去離子水定容到1L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丙谷二肽的制備方法,其特征在于:所述催化液為濃度50mM的PBS緩沖液中含有L-丙氨酸、L-谷氨酰胺和乙酰磷酸的濃度均為50mM,ADP的濃度為5mM。