本發(fā)明屬于發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種生產(chǎn)玻尿酸發(fā)酵液的方法。
背景技術(shù)：
：透明質(zhì)酸(HyaluroIlicacid，簡稱HA)又名玻尿酸、玻璃酸，是一種大分子粘多糖，由葡萄糖醛酸和N．乙酰氨基葡萄糖胺通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵反復(fù)交替連接而成的一種鏈狀高分子聚合物中。基于透明質(zhì)酸高粘度、潤滑性、保水性、良好的生物相容性及特殊的生理作用，透明質(zhì)酸在醫(yī)藥、美容、保健食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。透明質(zhì)酸既可以通過傳統(tǒng)的雞冠提取法生產(chǎn)，也可以通過微生物發(fā)酵法進行生產(chǎn)。由于發(fā)酵法成本低、產(chǎn)品純度高，而傳統(tǒng)的動物組織提取法由于透明質(zhì)酸的含量少，組織成分復(fù)雜，提取分離困難，造成生產(chǎn)成本高，因此目前微生物發(fā)酵法正逐步取代組織提取法。在現(xiàn)有細菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中，由于使用的營養(yǎng)物質(zhì)主要是各種單糖、蔗糖和淀粉水解物、蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出液、大豆蛋白水解液等，實驗證明，在這些不同批次營養(yǎng)物質(zhì)存在下，微生物并不能穩(wěn)定很好生長，從而影響發(fā)酵周期及正常生產(chǎn)。技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種制備透明質(zhì)酸的方法。技術(shù)方案：本發(fā)明通過以下方案解決該技術(shù)問題。一種制備玻尿酸的方法，以獸疫鏈球菌為發(fā)酵菌株，包括如下步驟：a、將獸疫鏈球菌接種至固體培養(yǎng)基上進行菌種培養(yǎng)，得到單克隆菌種。b、配制種子培養(yǎng)基，獸疫鏈球菌種子培養(yǎng)基由葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀組成，將獸疫鏈球菌接種至種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，得到獸疫鏈球菌種子培養(yǎng)液。c、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、谷氨酸鈉，微量元素液組成，所述微量元素由氯化鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、乙二胺四乙酸二鈉組成，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后調(diào)節(jié)pH至7.5，將獸疫鏈球菌種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液，即可得到透明質(zhì)酸發(fā)酵液。作為優(yōu)選，所述b步驟的種子培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為1-10g/L，酵母粉濃度為5-10g/L，蛋白胨濃度為10-20g/L，硫酸鎂濃度為0.5-2g/L，磷酸二氫鉀濃度為0.5-2g/L。作為優(yōu)選，所述c步驟的發(fā)酵培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為50-100g/L，酵母粉濃度為5-10g/L，蛋白胨濃度為10-20g/L，硫酸鎂濃度為0.5-2g/L，磷酸二氫鉀濃度為0.5-2g/L，谷氨酸鈉為10-20g/L，微量元素液濃度為0.5-10ml/L；所述微量元素中氯化鈣濃度為0.5-5g/L，硫酸鎂濃度為1-20g/L，硫酸亞鐵為0.200-2g/L，硫酸錳為0.2-2g/L，乙二胺四乙酸二鈉濃度為1-50g/L。作為優(yōu)選，所述b步驟中種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度33-37℃，振蕩培養(yǎng)10-14小時。作為優(yōu)選，所述c步驟中的發(fā)酵過程中，發(fā)酵攪拌速度為200-500rpm，發(fā)酵溫度為33-37℃，用30%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)，使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值在7.5±0.5，通氣量為1-3vvm，發(fā)酵周期在12-18小時。有益的效果：本發(fā)明在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了微量元素液，明顯縮短發(fā)酵周期，提高透明質(zhì)酸鈉發(fā)酵液粘度。本發(fā)明所述生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的發(fā)酵液經(jīng)過純化處理，可以得到化妝品級的透明質(zhì)酸鈉。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。一種制備玻尿酸的方法，以獸疫鏈球菌為發(fā)酵菌株，包括如下步驟：d、將獸疫鏈球菌接種至固體培養(yǎng)基上進行菌種培養(yǎng)，得到單克隆菌種；e、配制種子培養(yǎng)基，獸疫鏈球菌種子培養(yǎng)基由葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀組成，將獸疫鏈球菌接種至種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，得到獸疫鏈球菌種子培養(yǎng)液；f、配制發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、谷氨酸鈉，微量元素液組成，所述微量元素由氯化鈣、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、乙二胺四乙酸二鈉組成，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后調(diào)節(jié)pH至7.5，將獸疫鏈球菌種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液，即可得到透明質(zhì)酸發(fā)酵液。所述b步驟的種子培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為1-10g/L，酵母粉濃度為5-10g/L，蛋白胨濃度為10-20g/L，硫酸鎂濃度為0.5-2g/L，磷酸二氫鉀濃度為0.5-2g/L；所述c步驟的發(fā)酵培養(yǎng)液中葡萄糖濃度為50-100g/L，酵母粉濃度為5-10g/L，蛋白胨濃度為10-20g/L，硫酸鎂濃度為0.5-2g/L，磷酸二氫鉀濃度為0.5-2g/L，谷氨酸鈉為10-20g/L，微量元素液濃度為0.5-10ml/L；所述微量元素中氯化鈣濃度為0.5-5g/L，硫酸鎂濃度為1-20g/L，硫酸亞鐵為0.200-2g/L，硫酸錳為0.2-2g/L，乙二胺四乙酸二鈉濃度為1-50g/L。所述b步驟中種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度33-37℃，振蕩培養(yǎng)10-14小時。所述c步驟中的發(fā)酵過程中，發(fā)酵攪拌速度為200-500rpm，發(fā)酵溫度為33-37℃，用30%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)，使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值在7.5±0.5，通氣量為1-3vvm，發(fā)酵周期在12-18小時。實施例2下面對本發(fā)明做進一步的說明：以獸疫鏈球菌為發(fā)酵菌株生產(chǎn)透明質(zhì)發(fā)酵液的方法，其步驟為：1、將獸疫鏈球菌接種至種子固體培養(yǎng)上進行培養(yǎng)，于33℃培養(yǎng)16小時；2、配置1L種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基的組成：葡萄糖10g/L，酵母粉濃度為5g/L，蛋白胨濃度為10g/L，硫酸鎂濃度為1g/L，磷酸二氫鉀濃度為1g/L；培養(yǎng)基配置后滅菌后，將獸疫鏈球菌接種至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，于33℃振蕩培養(yǎng)12小時，得到獸疫鏈球菌種子培養(yǎng)液。3、配置6L發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的組成：葡萄糖濃度為100g/L，酵母粉濃度為10g/L，蛋白胨濃度為20g/L，硫酸鎂濃度為0.5g/L，磷酸二氫鉀濃度為2g/L，谷氨酸鈉為20g/L，微量元素液濃度為5ml/L；其中微量元素液的組成為：氯化鈣濃度為5g/L，硫酸鎂濃度為10g/L，硫酸亞鐵為2g/L，硫酸錳為1g/L，乙二胺四乙酸二鈉濃度為10g/L。配制發(fā)酵培養(yǎng)基后，裝入10L的發(fā)酵罐中，配制后的發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后使用30%氫氧化鈉調(diào)節(jié)至7.5，將獸疫鏈球菌種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)液，接種后在攪拌轉(zhuǎn)速為100-500rpm，溫度為33℃，pH值為7.5，通氣量為1vvm條件下培養(yǎng)16小時，得到透明質(zhì)酸發(fā)酵液，發(fā)酵過程中用30%氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使pH值保持在7.5±0.5。表1實施例2所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸發(fā)酵液表1發(fā)酵液黏度56000mPa.s玻尿酸產(chǎn)量12g/L發(fā)酵周期20小時生產(chǎn)的發(fā)酵液再經(jīng)過本領(lǐng)域常用的乙醇沉淀法進行純化處理即可得到高質(zhì)量的玻尿酸。表2是所生產(chǎn)的玻尿酸的質(zhì)量表以下是實施例2對照例：所有操作均一致，僅僅將發(fā)酵培養(yǎng)基中的微量元素去除，其生產(chǎn)的玻尿酸發(fā)酵液結(jié)果見表3表3發(fā)酵液黏度40000mPa.s玻尿酸產(chǎn)量8g/L發(fā)酵周期24小時生產(chǎn)的發(fā)酵液再經(jīng)過本領(lǐng)域常用的乙醇沉淀法進行純化處理即可得到高質(zhì)量的透明質(zhì)酸。表4是所生產(chǎn)的玻尿酸的質(zhì)量表綜上所述，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加微量元素生產(chǎn)玻尿酸，在保證產(chǎn)品質(zhì)量的情況下，可以縮短發(fā)酵周期，節(jié)約生產(chǎn)成本，同時提高了玻尿酸產(chǎn)量。當前第1頁1 2 3