本發(fā)明涉及一種以幾丁質(zhì)為底物生產(chǎn)幾丁二糖的方法。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)是一種主要來源于海洋蝦蟹殼、真菌細(xì)胞壁、昆蟲外殼等的難溶性天然多糖，幾丁質(zhì)經(jīng)過降解可得到水溶性的幾丁二糖，幾丁二糖可作為一種合成前體，在生物醫(yī)藥、綠色農(nóng)業(yè)和材料化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。
目前幾丁二糖的制備主要采用生物酶降解的方法或酸水解的方法。由于生物酶解具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過程可控等優(yōu)點(diǎn)，近幾年來生物酶法生產(chǎn)幾丁二糖已成為趨勢(shì)。自然界中存在大量的幾丁質(zhì)酶，主要來源于植物、微生物以及昆蟲等，從幾丁質(zhì)酶的催化反應(yīng)模式上又可分為三類，包括內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶、外切型幾丁質(zhì)酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，其中內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶主要作用是將幾丁質(zhì)隨機(jī)切割成不同聚合度的幾丁寡糖，外切型幾丁質(zhì)酶主要是將幾丁質(zhì)按照一定的順序切割成幾丁二糖，而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶則是把幾丁二糖轉(zhuǎn)化為兩個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖。
雖然到目前為止已有大量的關(guān)于這些幾丁質(zhì)酶的報(bào)道，由于幾丁質(zhì)具有非常致密的晶體結(jié)構(gòu)，特別是來源于蝦蟹殼的幾丁質(zhì)，其內(nèi)部分子層與層之間，鏈與鏈之間存在大量的氫鍵，使得生物酶在降解幾丁質(zhì)時(shí)效率非常低，這在很大程度上限制了幾丁二糖的生產(chǎn)與應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種以幾丁質(zhì)為底物生產(chǎn)幾丁二糖的方法，即利用多糖裂解單加氧酶和外切型幾丁質(zhì)酶相結(jié)合，協(xié)同高效降解幾丁質(zhì)，生產(chǎn)幾丁二糖的方法。其中，多糖裂解單加氧酶是一類新發(fā)現(xiàn)的酶，該酶可作用于晶體幾丁質(zhì)的表面，破壞幾丁質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)，從而提高幾丁質(zhì)酶對(duì)幾丁質(zhì)的酶解效率。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案包括：
將幾丁質(zhì)與溶劑混合，幾丁質(zhì)的濃度為0.5-2g/100ml，所用的溶劑包括磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液或醋酸緩沖液中一種。
將來自蘇云金芽孢桿菌的多糖裂解單加氧酶與來自粘質(zhì)沙雷氏菌的外切型幾丁質(zhì)酶添加到幾丁質(zhì)與溶劑的混合體系中，對(duì)幾丁質(zhì)進(jìn)行酶催化降解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20-40℃，處理持續(xù)時(shí)間為8-24h，反應(yīng)體系中需要添加0.5-2mM的還原劑。
附圖說明
圖1A.利用多糖裂解單加氧酶和幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解蝦蟹殼來源的幾丁質(zhì)。
圖1B.利用多糖裂解單加氧酶和幾丁質(zhì)酶協(xié)同降解魷魚來源的幾丁質(zhì)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1利用多糖裂解單加氧酶(BtLPMO10A)和幾丁質(zhì)酶(SmChiA)協(xié)同降解不同來源的幾丁質(zhì)
1)蝦蟹殼來源的幾丁質(zhì)。如圖1A所示，兩組反應(yīng)均在1.0ml的幾丁質(zhì)-磷酸緩沖液(20mM，pH＝6.0)中進(jìn)行，其中一組只添加5.0μM幾丁質(zhì)酶(黑色方塊表示)，另一組同時(shí)添加了5.0μM幾丁質(zhì)酶、1.0μM的多糖裂解單加氧酶和1.0mM的抗壞血酸(黑色三角表示)，反應(yīng)在37℃振蕩條件下進(jìn)行，分別在0,1,2,3,4,5,8,24h取樣，樣品中幾丁二糖的含量通過HPLC的方法進(jìn)行定量分析。結(jié)果如圖1A所示，經(jīng)過24h酶解，不含多糖裂解單加氧酶的一組幾丁二糖的終濃度為8.1μg/ml,而含有多糖裂解單加氧酶的一組幾丁二糖的終濃度為92μg/ml,即通過添加多糖裂解單加氧酶，可將蝦蟹殼來源的幾丁質(zhì)的酶水解效率提高10倍以上。
2)魷魚來源的幾丁質(zhì)。如圖1B所示，兩組反應(yīng)均在1.0ml的幾丁質(zhì)-磷酸緩沖液(20mM，pH＝6.0)中進(jìn)行，其中一組只添加5.0μM幾丁質(zhì)酶(黑色方塊表示)，另一組同時(shí)添加了5.0μM幾丁質(zhì)酶、1.0μM的多糖裂解單加氧酶和1.0mM的抗壞血酸(黑色三角表示)，反應(yīng)在37℃振蕩條件下進(jìn)行，分別在0,0.5,1,2,3,4,5,8h取樣，樣品中幾丁二糖的含量通過HPLC的方法進(jìn)行定量分析。結(jié)果如圖1B所示，幾丁二糖的生成量隨之酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加。經(jīng)過24h酶解，不含多糖裂解單加氧酶的一組幾丁二糖的終濃度為23.5μg/ml,而含有多糖裂解單加氧酶的一組幾丁二糖的終濃度為73μg/ml,即通過添加多糖裂解單加氧酶，可將魷魚來源的幾丁質(zhì)的酶水解效率提高3.1倍。