本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法。
背景技術(shù)：
目前，水蛭素是蛭類動物唾液腺分泌的一種酸性多肽，含有65～66個氨基酸殘基，主要有HV1、HV2、HV3這3種異構(gòu)體，它們之間具有很高的結(jié)構(gòu)同源性。水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強的凝血酶特異性抑制劑，水蛭素(HV3)蛋白表達工程菌菌種活性取決于抗凝血酶活性強度，它與凝血酶以等摩爾比形成非共價鍵緊密結(jié)合的穩(wěn)定復合物。藥理學及臨床研究表明，水蛭素可用于深靜脈血栓、Ⅱ型肝素相關(guān)的血小板減少癥和彌漫性血管內(nèi)凝血，并在血液透析和體外循環(huán)時預防血栓形成等。與肝素、阿司匹林等傳統(tǒng)的抗凝藥物相比，水蛭素用量小、療效高、不良反應少而輕、不會引起過敏反應。重組水蛭素已成為一種高效、專一、安全的新型抗凝、防栓藥物，具有廣闊的臨床應用前景。
由于目前水蛭素分離純化時采用大批量發(fā)酵液加熱后放入發(fā)酵罐中的處理方式，不適于大批量工業(yè)化生產(chǎn)，并且在去除雜蛋白和脂類物質(zhì)時，采取低溫離心的方法，大批量生產(chǎn)的可操作性差，且蛋白純度低、色素含量較高，成本高。分離純化水蛭素時需提高蛋白純度的同時大大降低色素含量，使工藝操作簡便、成本較低，且適合工業(yè)化放大生產(chǎn)有賴于新的技術(shù)和方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法，利用發(fā)酵液上清液通過pH調(diào)節(jié)和上罐加熱的處理方式，提高蛋白純度的同時大大降低色素含量，使工藝操作簡便；采用低溫靜置后過濾的方法去除雜蛋白和脂類物質(zhì)，降低成本，且提高工藝的可操作性，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法，步驟如下：
(1)取水蛭素(HV3)蛋白表達工程菌菌種培養(yǎng)發(fā)酵得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，得發(fā)酵液上清液，備用；
(2)將上述發(fā)酵液上清液用鹽酸將pH調(diào)為3.8-4.2，之后放入發(fā)酵罐中加熱至78-82℃，備用；
(3)將步驟(2)中所得發(fā)酵液從罐中取出保持2-8℃靜置，待分層后取發(fā)酵液上清液，備用；
(4)將步驟(3)中發(fā)酵液上清液用0.45μm過濾器進行過濾；將過濾后的發(fā)酵液進行分離純化得到目的蛋白活性部分。
優(yōu)選地，適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法，步驟(1)中菌種培養(yǎng)發(fā)酵的步驟如下：
A、將保存的水蛭素(HV3)蛋白表達工程菌菌種在LBA固體培養(yǎng)基上保持恒溫靜止培養(yǎng)11-13小時，得到單菌落，備用；
B、選取上述單菌落，接種于LBA液體培養(yǎng)基中保持恒溫搖床培養(yǎng)14-16小時，得一級種子液，備用；
C、吸取上述一級種子液，接種于LBA液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，保持恒溫搖床培養(yǎng)14-16小時，制得二級種子液，備用；
D、監(jiān)測上述二級種子液的OD600nm值，待OD600nm值達到4.0-4.4時，開始流加補碳培養(yǎng)基，補料過程中將溶氧控制在20％-40％，待OD600連續(xù)4.5-5.5小時不再增長時，停止補碳，開始緩慢流加補氮培養(yǎng)基，待水蛭素(HV3)蛋白表達工程菌菌種活性不再增長時，停止補氮，發(fā)酵至菌體進入自溶階段、產(chǎn)物合成能力下降時終止發(fā)酵，制得發(fā)酵液，備用；
優(yōu)選地，適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法，菌種培養(yǎng)發(fā)酵的步驟A-C中，恒溫控制在36.5-37.5℃。
優(yōu)選地，適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法，菌種培養(yǎng)發(fā)酵的步驟A-C中，恒溫控制在37℃。
優(yōu)選地，適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法，步驟(2)中，發(fā)酵上清液用12M鹽酸將pH調(diào)為4.0，將發(fā)酵液放入罐中加熱至80℃。
更優(yōu)選地，適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法，將發(fā)酵液放入罐中加熱至80℃保持50-70分鐘，有效除去雜蛋白。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明關(guān)鍵在于適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化工藝的設(shè)計。實驗證實，使用所設(shè)計的分離純化工藝，發(fā)酵液上清液通過pH調(diào)節(jié)和上罐加熱的處理方式，提高蛋白純度的同時大大降低色素含量，使工藝操作簡便；采用低溫靜置后過濾的方法去除雜蛋白和脂類物質(zhì)，降低成本，且提高工藝的可操作性，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
附圖說明
圖1為具體實施方式步驟4中所提供的HV3發(fā)酵過程菌體濃度OD600值和上清液抗凝血酶活性。
具體實施方式
為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明提供的適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法作進一步的詳細說明。
水蛭素(HV3)蛋白表達工程菌，見江蘇省南京中央路童家巷24號的中國藥科大學譚樹華、吳梧桐申請的“新型分泌表達載體及其在重組水蛭素表達技術(shù)中的應用”，專利申請?zhí)枺?1113526.3，授權(quán)公告日：20031119。
步驟1：菌種活化
將水蛭素(HV3)蛋白表達工程菌菌種一支于室溫解凍，用接菌環(huán)接種，在LBA固體培養(yǎng)基上劃線，倒置在恒溫培養(yǎng)箱中，保持恒溫37℃靜止培養(yǎng)12小時，得到形狀規(guī)則的圓形單菌落；
步驟2：一級種子培養(yǎng)
從LBA固體培養(yǎng)基上，選取形狀規(guī)則的，圓形,單個菌落，挑取單菌落，接種于LBA液體培養(yǎng)基中保持恒溫37℃搖床培養(yǎng)14-16小時，得一級種子液；
步驟3：二級種子培養(yǎng)
吸取5％的一級種子液，接種于LBA液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，保持恒溫37℃搖床培養(yǎng)14-16小時，制得二級種子液，備用；
步驟4：發(fā)酵
監(jiān)測上述二級種子液的OD600nm值，待OD600nm值達到4.2左右時，開始流加補碳培養(yǎng)基，根據(jù)溶氧的變化，補料的速度呈指數(shù)或線性增加，補料過程中將溶氧控制在20％～40％，待OD600連續(xù)5小時左右不再增長時，停止補碳，開始緩慢流加補氮培養(yǎng)基，待抗凝血酶活性不再增長時，停止補氮，發(fā)酵至菌體進入自溶階段、產(chǎn)物合成能力下降時終止發(fā)酵，制得發(fā)酵液，發(fā)酵時長約20小時左右，如圖1所示；
步驟5：發(fā)酵液預處理
將上述發(fā)酵液進行離心，制得發(fā)酵液上清液，發(fā)酵液上清液用12M鹽酸將pH調(diào)為4.0，之后放入發(fā)酵罐中加熱至80℃，保持60分鐘后將發(fā)酵液從罐中取出保持2-8℃靜置，待分層后取發(fā)酵液上清液，用4層紗布過濾，和0.45μm過濾器過濾；
步驟6：發(fā)酵液純化
(1)陽離子交換樹脂SP sepharose Fast Flow
裝SP sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂柱，使用去離子水沖洗除去樹脂保存液，用50mM檸檬酸-NaOH(pH3.0)緩沖液平衡，將過濾后的發(fā)酵液經(jīng)以5ml/min的速度上樣。用50mM檸檬酸-NaOH(pH3.0)緩沖液和50mM檸檬酸-NaOH(pH4.25)緩沖液洗去部分雜蛋白和色素，采用50mM檸檬酸c-NaOH(pH5.5)緩沖液進行洗脫目的蛋白。每步收集穿過液，凝血酶滴定法測比活，記錄數(shù)據(jù)，收集活性部分。
(2)快速蛋白液相色譜Fast protein liquid chromatography(FPLC)
將SP sepharose Fast Flow陽離子交換層析洗脫液經(jīng)C18反相柱進行分離純化。甲醇-水作為流動相，A相為0.2％TFA/dd H2O，B相為甲醇，流速20ml/min，檢測波長280nm。
甲醇-水梯度洗脫體系：
15％B平衡反相柱30mim至基線平行；依次使用0-30min 30％B；30-40min，65％B；40-50min，60％-100％B。收集活性部分。
表1純化后水蛭素(HV3)的回收率
步驟5中除去雜蛋白和脂類物質(zhì)時，以往技術(shù)中大批量發(fā)酵液罐外加熱之后采取低溫離心的處理方式不方便操作，本發(fā)明采取發(fā)酵液上清通過pH調(diào)節(jié)和上罐加熱80℃保持60分鐘之后低溫靜置并且過濾的處理方式，有效除去雜蛋白，大大降低后續(xù)純化工藝的難度，提高工藝的可操作性，成本較低，且適合工業(yè)化生產(chǎn)。
以上對本發(fā)明所提供的適合工業(yè)化生產(chǎn)的重組水蛭素分離純化的方法進行了詳細介紹。本文中應用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。