本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種重組菌催化萊鮑迪甙A制備萊鮑迪甙M2的方法。
背景技術(shù)：
：甜菊糖提取自原產(chǎn)于南美巴拉圭和巴西的多年生菊科草本植物甜葉菊，具有高甜度（為蔗糖的250～300倍）、低熱量（僅為蔗糖的1/300）的特性，食用安全，有一定的藥理作用和輔助療效。它是繼甘蔗糖、甜菜糖之外的第三種有開(kāi)發(fā)價(jià)值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國(guó)際上譽(yù)為“世界第三糖源”。1998年，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）同意將甜菊糖添加到食品飲料中。瑞士將甜菊糖列入本國(guó)藥典作為糖漿劑、口服液或含片的主要甜味劑原料,取代了糖精鈉等傳統(tǒng)藥用甜味劑。相對(duì)于日本、美國(guó)和瑞士，歐盟批準(zhǔn)使用甜菊糖的時(shí)間稍晚一些。2008年歐盟正式批準(zhǔn)其作為食品添加劑。由于對(duì)甜菊糖的需求量不斷增加，許多國(guó)家包括日本、新加坡、馬來(lái)西亞、韓國(guó)、中國(guó)、以色列、印度、巴西和澳大利亞等都已在商業(yè)化種植甜葉菊。甜葉菊的葉子含有多種天然的甜味糖甙如甜菊甙、萊鮑迪A-F、杜爾可甙A和甜茶甙。2008年，美國(guó)FDA簽發(fā)了確認(rèn)萊鮑迪甙A能以最低95%的純度用作零卡路里甜味劑的“通常認(rèn)為是安全的”（“GRAS”）通知。2014年，萊鮑迪甙M也獲得了FDA“GRAS”認(rèn)證。萊鮑迪甙M與萊鮑迪甙A結(jié)構(gòu)相似，只相差兩個(gè)葡萄糖基，與萊鮑迪甙A相比更具口感優(yōu)勢(shì)。萊鮑迪甙M不是甜菊糖總甙中的主要糖甙，但目前已有化學(xué)合成（專利201410314371.7和201410553617.6）和生物制備方法（專利201310353500.9和CN201410019981.4）可用于生產(chǎn)萊鮑迪甙M。萊鮑迪甙M2是萊鮑迪甙M的同分異構(gòu)體,兩者結(jié)構(gòu)式如下式所示：萊鮑迪甙M萊鮑迪甙M2萊鮑迪甙M2具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。番茄來(lái)源的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2能催化萊鮑迪甙A糖基化生成萊鮑迪甙D和萊鮑迪甙M2（US2014/0357588A1,Biomolecules2014,4:374-389)，萊鮑迪甙D和萊鮑迪甙M2分別占23.7%和6%。其中萊鮑迪甙M2含量低，難以實(shí)現(xiàn)大量制備和工業(yè)化。此外，已報(bào)道的萊鮑迪甙M的生物制備方法（專利CN201310353500.9和CN201410019981.4），使用重組細(xì)胞作為催化劑，需要添加甲苯或其它細(xì)胞通透劑；或使用重組細(xì)胞凍干粉作為催化劑，而凍干粉的制備耗能、成本高；并且需要額外添加UDP作為UDP-葡萄糖再生體系的輔底物；或需要調(diào)配UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合酶的添加比例，重組菌用量大，產(chǎn)酶成本高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種重組菌及其在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙M2中的應(yīng)用，構(gòu)建的重組菌可以共表達(dá)番茄來(lái)源的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2和馬鈴薯來(lái)源的蔗糖合酶StSUS1，不需要分開(kāi)表達(dá)和制備、也不需要調(diào)節(jié)兩種酶之間的配比，應(yīng)用于合成萊鮑迪甙M2過(guò)程中直接使用重組菌破碎后的粗酶液，不需添加UDP或UDP-葡萄糖，也不需要使用直接底物萊鮑迪甙D，以及細(xì)胞通透劑或其他化學(xué)試劑，簡(jiǎn)化了工藝過(guò)程，收率高。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種重組菌催化萊鮑迪甙A制備萊鮑迪甙M2的方法，將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后取粗酶液，加入到反應(yīng)混合物中催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙M2，所述反應(yīng)混合物中包括萊鮑迪甙A、蔗糖和磷酸鈉緩沖液；所述重組菌中同時(shí)含有番茄來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2基因和馬鈴薯來(lái)源蔗糖合酶StSUS1基因。所述重組菌中同時(shí)含有番茄來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2基因和馬鈴薯來(lái)源蔗糖合酶StSUS1基因，所述番茄來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2基因序列如SEQ.NO.1所示，其編碼的番茄來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2的氨基酸序列如SEQ.NO.3所示，所述馬鈴薯來(lái)源蔗糖合酶StSUS1基因序列如SEQ.NO.2所示，其編碼的馬鈴薯來(lái)源蔗糖合酶StSUS1氨基酸序列如SEQ.NO.4所示。將番茄來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2基因克隆到pRSFDuet-1的NdeI與XhoI位點(diǎn)之間，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pRSFDuet-SL2，然后再將馬鈴薯來(lái)源蔗糖合酶StSUS1基因克隆到pRSFDuet-SL2的NcoI和EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pRSFDuet-SL2-SUS1，將重組質(zhì)粒pRSFDuet-SL2-SUS1轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到重組菌。所述的重組菌在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙M2中的應(yīng)用。將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后取粗酶液，加入到反應(yīng)混合物中催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙M2，所述反應(yīng)混合物中包括萊鮑迪甙A、蔗糖和磷酸鈉緩沖液。所述重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)條件為：將重組菌接種到LB培養(yǎng)基中，于20~37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)8h，再將培養(yǎng)菌液按2%接種量接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于200rpm，20~37℃培養(yǎng)2h，待OD600達(dá)到0.2左右時(shí)轉(zhuǎn)20℃~37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)22h，離心收集菌體。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑濃度為0.1~0.9g/L。進(jìn)一步的優(yōu)選誘導(dǎo)溫度為25℃，誘導(dǎo)劑濃度為0.5g/L。所述反應(yīng)混合物中萊鮑迪甙A10g/L，蔗糖濃度為30g/L，粗酶液濃度為2~10g/L，采用磷酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH為7.2；進(jìn)一步優(yōu)選地，粗酶液濃度為8g/L。所述反應(yīng)溫度為20℃~40℃，反應(yīng)時(shí)間為2~36h。進(jìn)一步優(yōu)選，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為25h。所述LB培養(yǎng)基配方為0.5g/L酵母粉、0.5g/L氯化鈉、1g/L胰蛋白胨、0.05g/L卡納霉素。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為25g/L酵母粉、15g/L胰蛋白胨、10g/L氯化鈉、2g/L葡萄糖、0.05~0.9g/L乳糖，0.05g/L卡納霉素。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中優(yōu)選乳糖濃度為0.5g/L。通過(guò)控制反應(yīng)條件，在40℃，pH7.2，酶濃度為8mg/mL、反應(yīng)時(shí)間25h時(shí)，萊鮑迪甙M2摩爾收率達(dá)到83%。有益效果：本發(fā)明構(gòu)建的共表達(dá)番茄來(lái)源UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2和馬鈴薯來(lái)源蔗糖合酶StSUS1的重組菌作為生物催化劑，不需要分開(kāi)表達(dá)和制備UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶與蔗糖合酶，也不需要調(diào)節(jié)兩種酶之間的配比。重組菌可以在-20℃或-80℃保存，反應(yīng)中使用重組菌破碎后的粗酶液，避免了酶的分離純化，也無(wú)需制作凍干粉，簡(jiǎn)化了工藝過(guò)程。在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙M2過(guò)程中，反應(yīng)液中不需添加萊鮑迪甙D,UDP或UDP-葡萄糖，顯著降低成本。反應(yīng)液中不需添加任何細(xì)胞通透劑或其他化學(xué)試劑，環(huán)境友好性更佳。萊鮑迪甙M2的產(chǎn)率高達(dá)11.09g/L。附圖說(shuō)明圖1：反應(yīng)液樣品HPLC檢測(cè)結(jié)果圖,反應(yīng)中包含10g/L萊鮑迪甙A，30g/L蔗糖，3mM氯化鎂，8mg/mL粗酶液。磷酸鈉緩沖pH7.2,總體系為10mL,40℃條件下反應(yīng)25h的樣品；圖2：樣品中萊鮑迪甙M2的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中，萊鮑迪甙M2采用液相色譜檢測(cè)，HPLC在安捷倫AgilentTechnologies1290Infinity液相色譜儀上進(jìn)行，色譜分析條件如下：色譜柱：Agilent5TC-C18（Netheriands）250×4.6mm；流動(dòng)相為0.1%甲酸：乙腈（70:30；V:V）；流速1min/mL；柱溫55℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。高效液相質(zhì)譜檢測(cè)在二元梯度超高效液相色譜質(zhì)譜(WATERSI-CLASS)上進(jìn)行，色譜柱采用AXQUITYUPLC?HSST31.8μm,2.1*100㎜；高效液相分析條件同前。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)設(shè)置：噴霧電壓3.0kV，錐孔電壓40V，脫溶劑氣流量800L/h，氣簾氣流量50L/h，低端分辨率11.3，高端分辨率14.0，離子能量-0.3。實(shí)施例1重組菌株的構(gòu)建番茄來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶UGTSL2的基因序列如SEQ.NO.1所示，馬鈴薯來(lái)源蔗糖合酶StSUS1基因序列如SEQ.NO.2所示經(jīng)密碼子優(yōu)化后由南京金斯瑞公司合成。設(shè)計(jì)引物GGGAATTCCATATGGCGACCAACCTGCG和CCGCTCGAGTTAGTGGTGATGATGGTGATGTTTG擴(kuò)增UGTSL2基因，將該基因亞克隆到pRSFDuet-1（Novagen）的NdeI與XhoI位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRSFDuet-SL2；設(shè)計(jì)引物TAATAAGGAGATATACCATGGCCGAACGTGTCCTGACCC和AGGCGCGCCGAGCTCGAATTCTTATTCAGCTGCCAGCG，用南京諾唯贊生物科技有限公司的一步克隆試劑盒（OneStepCloningKit，Vazyme）將StSUS1基因亞克隆到pRSFDuet-SL2的NcoI和EcoRI位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pRSFDuet-SL2-SUS1。分子克隆操作中TransFastTaqDNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，T4DNA連接酶及限制性內(nèi)酶均購(gòu)自大連TaKaRa公司。實(shí)施例2誘導(dǎo)表達(dá)重組酶及粗酶液制備將實(shí)施例1中構(gòu)建的pRSFDuet-SL2-SUS1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1）。將該重組菌菌株接種到含有0.05g/L卡納霉素的5mLLB培養(yǎng)基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化鈉，1g/L胰蛋白胨），于37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)8h，再將培養(yǎng)菌液按2%接種量接入含有100mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化鈉，2g/L葡萄糖，0.05g/L乳糖）的500mL搖瓶中，于200rpm，30℃培養(yǎng)2h，待OD600達(dá)到0.2左右時(shí)轉(zhuǎn)25℃誘導(dǎo)22h離心收集菌體。超聲破菌，離心取上清液為粗酶液，置于4℃冰箱待用。實(shí)施例3溫度對(duì)重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)的影響將重組菌接種到含有0.05g/L卡納霉素的5mLLB培養(yǎng)基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化鈉，1g/L胰蛋白胨），37℃條件下、250rpm振蕩培養(yǎng)8h，再將培養(yǎng)菌液按2%接種量接入含有100mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化鈉，2g/L葡萄糖，0.05g/L乳糖）的500mL搖瓶中，于200rpm，分別在30℃條件下培養(yǎng)2h，待OD600達(dá)到0.2左右時(shí)，分別在20℃，25℃，30℃，37℃誘導(dǎo)22h離心收集菌體，超聲破菌，離心取上清液為粗酶液，置于4℃冰箱待用。分別取不同誘導(dǎo)溫度下獲取的粗酶液，在溫度30℃，pH7.2，萊鮑迪甙A10g/L，蔗糖30g/L，8mg/mL粗酶液的條件下反應(yīng)25h，萊鮑迪甙M2產(chǎn)量見(jiàn)表1。表1溫度(℃)萊鮑迪甙M2（g/L）205.97258.96300.50370在25℃條件下誘導(dǎo)產(chǎn)酶，其粗酶液合成萊鮑迪甙M2產(chǎn)量最高，為8.96g/L。實(shí)施例4乳糖濃度對(duì)重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)的影響將重組菌S4接種到含有0.05g/L卡納霉素的5mLLB培養(yǎng)基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化鈉，1g/L胰蛋白胨），37℃條件下、250rpm振蕩培養(yǎng)8h，再將培養(yǎng)菌液按2%接種量接入含有不同乳糖濃度的100mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化鈉，2g/L葡萄糖，分別為0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L、0.9g/L的乳糖濃度）的500mL搖瓶中，于200rpm，分別在30℃條件下培養(yǎng)2h，待OD600達(dá)到0.2左右時(shí)，分別在20℃誘導(dǎo)22h離心收集菌體，超聲破菌，離心取上清液為粗酶液，置于4℃冰箱待用。分別取不同乳糖濃度誘導(dǎo)下獲取的粗酶液，在溫度30℃，pH7.2，萊鮑迪甙A10g/L，蔗糖30g/L，8mg/mL粗酶液的條件下反應(yīng)25h，萊鮑迪甙M2產(chǎn)量見(jiàn)表2。表2乳糖濃度（g/L）萊鮑迪甙M2（g/L）0.14.860.33.130.58.930.74.410.95.91在乳糖濃度為0.5g/L條件下誘導(dǎo)產(chǎn)酶，其粗酶液合成萊鮑迪甙M2產(chǎn)量最高，為8.93g/L。由實(shí)施例3和4可以得到重組菌株的最佳誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)溫度25℃，誘導(dǎo)劑乳糖濃度為0.5g/L。實(shí)施案例5粗酶液濃度對(duì)重組菌株催化的影響重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)后獲取的粗酶液進(jìn)行反應(yīng)。在50mL三角瓶中，10mL反應(yīng)混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，50g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸鈉緩沖，粗酶液蛋白濃度分別為2、4、6、8和10mg/mL，反應(yīng)在30℃、200rpm條件下進(jìn)行。加入粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，反應(yīng)14h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，測(cè)得不同粗酶液濃度下反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。表3：酶濃度（mg/mL）萊鮑迪甙M2（g/L）2040.2361.8384.89105.05當(dāng)粗酶液蛋白濃度為10mg/mL時(shí)反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2產(chǎn)量最高，為5.05g/L。而當(dāng)粗酶液蛋白濃度為8mg/mL時(shí)反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2已達(dá)到4.89g/L，兩者產(chǎn)量接近。實(shí)施例6采用重組菌S4誘導(dǎo)表達(dá)后獲取的粗酶液進(jìn)行反應(yīng)，在50mL三角瓶中，10mL反應(yīng)混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，50g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸鈉緩沖，8mg/mL粗酶液，反應(yīng)在30℃和200rpm條件下進(jìn)行。加入粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，分別在反應(yīng)2、6、10、14、18、25、29和32h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，測(cè)得不同時(shí)間反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。表4時(shí)間（h）萊鮑迪甙M2(g/L)20.0660.61103.48144.77185.29256.70296.93326.92在29h反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2產(chǎn)量最高，這時(shí)反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2的濃度為6.93g/L。但25h已經(jīng)達(dá)到了6.70g/L，可見(jiàn)25h后，反應(yīng)進(jìn)行緩慢，產(chǎn)物積累很少。實(shí)施例7重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)后獲取的粗酶液進(jìn)行反應(yīng)。在50mL三角瓶中，10mL反應(yīng)混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，50g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸鈉緩沖，3mg/mL粗酶液，反應(yīng)分別在20、25、30、37、40℃和200rpm條件下進(jìn)行。加入粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，反應(yīng)25h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，測(cè)得不同反應(yīng)溫度下反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。表5溫度(℃)萊鮑迪甙M2(g/L)202.84254.17305.62377.744011.09可見(jiàn)在40℃條件下反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2產(chǎn)量最高，這時(shí)反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2的濃度為11.09g/L。在40℃條件下反應(yīng)時(shí)萊鮑迪甙A可全部反應(yīng)完全。由實(shí)施例5-7可知，最佳反應(yīng)條件為：重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)后獲取的粗酶液進(jìn)行反應(yīng)。在50mL三角瓶中，10mL反應(yīng)混合物中包含10g/L萊鮑迪甙A，30g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸鈉緩沖，粗酶液蛋白濃度8mg/mL，反應(yīng)在40℃、200rpm條件下進(jìn)行。加入粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，反應(yīng)25h后取樣于95℃加熱5min滅活酶，離心取上清，反應(yīng)液中萊鮑迪甙M2產(chǎn)量最高，為11.09g/L，產(chǎn)率為83%。SEQUENCELISTING<110>南京工業(yè)大學(xué)<120>一種重組菌催化萊鮑迪甙A制備萊鮑迪甙M2的方法<130><160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1329<212>DNA<213>人工序列<400>1atggcgaccaacctgcgtgtgctgatgttcccgtggctggcgtacggtcacatcagcccg60tttctgaacattgcgaaacagctggcggatcgtggcttcctgatctacctgtgcagcacc120cgtattaacctggagagcatcattaagaaaatcccggaaaagtatgcggacagcatccac180ctgattgagctgcaactgccggagctgccggaactgccgccgcactatcacaccaccaac240ggtctgccgccgcacctgaacccgaccctgcacaaggcgctgaaaatgagcaagccgaac300tttagccgtatcctgcagaacctgaaaccggatctgctgatttacgacgtgctgcagccg360tgggcggagcacgttgcgaacgaacaaaacattccggcgggtaaactgctgaccagctgc420gcggcggtgttcagctatttctttagctttcgtaagaacccgggcgttgagttcccgttt480ccggcgatccacctgccggaagtggaaaaggttaaaatccgtgagattctggcgaaagaa540ccggaggaaggtggccgtctggatgagggtaacaagcagatgatgctgatgtgcaccagc600cgtaccatcgaggcgaaatacattgactattgcaccgaactgtgcaactggaaggtggtt660ccggtgggtccgccgttccaagatctgatcaccaacgatgcggacaacaaagagctgatt720gactggctgggtaccaagcacgaaaacagcaccgtgttcgttagctttggcagcgagtac780ttcctgagcaaagaagatatggaggaagttgcgtttgcgctggagctgagcaacgtgaac840ttcatctgggttgcgcgttttccgaaaggcgaggaacgtaacctggaagatgcgctgccg900aagggcttcctggagcgtattggtgaacgtggccgtgtgctggacaagtttgcgccgcag960ccgcgtatcctgaaccacccgagcaccggtggcttcattagccactgcggttggaacagc1020gcgatggagagcatcgattttggcgttccgatcattgcgatgccgatccacaacgaccaa1080ccgattaacgcgaaactgatggtggagctgggtgtggcggttgaaatcgttcgtgacgat1140gacggtaaaatccaccgtggcgagattgcggaaaccctgaagagcgtggttaccggcgag1200accggcgaaattctgcgtgcgaaagtgcgtgaaatcagcaaaaacctgaagagcattcgt1260gatgaggaaatggacgcggttgcggaggaactgatccaactgtgccgtaacagcaacaag1320agcaaataa1329<210>2<211>2418<212>DNA<213>人工序列<400>2atggccgaacgtgtcctgacccgtgtccatagtctgcgtgaacgtgttgatgctaccctg60gctgcccaccgtaatgaaatcctgctgtttctgagtcgtattgaaagccacggcaaaggt120atcctgaaaccgcacgaactgctggcagaatttgatgctattcgccaggatgacaaaaac180aaactgaacgaacatgcattcgaagaactgctgaaaagcacccaagaagctatcgtcctg240ccgccgtgggtggcactggcaattcgtctgcgcccgggcgtttgggaatacatccgtgtt300aacgtcaatgcgctggttgtggaagaactgagtgtgccggaatatctgcagtttaaagaa360gaactggtcgatggcgcgtccaacggtaatttcgtgctggaactggactttgaaccgttc420accgcctcatttccgaaaccgaccctgacgaaatcgattggcaacggtgttgaatttctg480aatcgtcatctgagcgccaaaatgttccacgataaagaatctatgaccccgctgctggaa540tttctgcgcgcacatcactataaaggtaaaaccatgatgctgaacgatcgtattcagaac600agcaatacgctgcaaaatgtgctgcgcaaagcggaagaatacctgatcatgctgccgccg660gaaaccccgtacttcgaatttgaacataaattccaggaaattggcctggaaaaaggctgg720ggtgatacggcagaacgtgtgctggaaatggtttgcatgctgctggatctgctggaagct780ccggacagctgtaccctggaaaaatttctgggtcgcattccgatggttttcaacgtcgtg840atcctgtctccgcacggctattttgcgcaggaaaatgtcctgggttacccggataccggc900ggtcaggttgtctatattctggaccaagtgccggccctggaacgtgaaatgctgaaacgc960atcaaagaacagggcctggatattatcccgcgtattctgatcgtcacccgtctgctgccg1020gacgcagtgggcaccacgtgcggtcaacgtattgaaaaagtgtatggcgctgaacattca1080cacatcctgcgtgttccgtttcgcaccgaaaaaggtattgtccgtaaatggatctcgcgc1140tttgaagtgtggccgtacatggaaacgttcattgaagatgttgcaaaagaaatctcagcg1200gaactgcaggccaaaccggacctgattatcggcaactatagcgaaggtaatctggcggcc1260tctctgctggcccataaactgggcgtgacccaatgtacgattgcacacgctctggaaaaa1320accaaatatccggattcggacatctactggaaaaaattcgatgaaaaataccatttcagc1380tctcagttcaccgcagatctgattgctatgaaccacacggactttattatcaccagtacg1440ttccaggaaatcgcgggctccaaagataccgtgggtcaatacgaaagtcatatggccttt1500acgatgccgggcctgtatcgcgtggttcacggtatcaacgttttcgatccgaaattcaac1560attgtctccccgggtgcagacatcaatctgtatttttcatactcggaaaccgaaaaacgt1620ctgacggctttccatccggaaatcgatgaactgctgtatagcgatgtggaaaacgacgaa1680cacctgtgcgttctgaaagatcgcaccaaaccgattctgtttacgatggcgcgtctggac1740cgcgttaaaaatctgaccggcctggtcgaatggtacgccaaaaacccgcgtctgcgcggt1800ctggtgaatctggtcgtggttggcggtgatcgtcgcaaagaatctaaagacctggaagaa1860caggcggaaatgaagaaaatgtacgaactgatcgaaacccataacctgaatggccagttc1920cgttggatcagttcccaaatgaaccgtgttcgcaatggcgaactgtatcgctacatcgca1980gatacgaaaggtgcttttgtccagccggcgttttacgaagccttcggcctgaccgtcgtg2040gaagcgatgacgtgcggtctgccgaccttcgcaacgaatcatggcggcccggcagaaatt2100atcgttcacggcaaaagtggttttcatattgatccgtatcacggcgaacaggcagctgat2160ctgctggccgactttttcgaaaaatgtaaaaaagacccgtcacattgggaaaccatttcg2220atgggcggtctgaaacgcatcgaagaaaaatatacctggcaaatttacagcgaatctctg2280ctgacgctggcggccgtgtacggtttctggaaacacgtttctaaactggatcgtctggaa2340attcgtcgctatctggaaatgttttatgcgctgaaataccgcaaaatggcggaagccgtg2400ccgctggcagctgaataa2418<210>3<211>442<212>PRT<213>人工序列<400>3MetAlaThrAsnLeuArgValLeuMetPheProTrpLeuAlaTyrGly151015HisIleSerProPheLeuAsnIleAlaLysGlnLeuAlaAspArgGly202530PheLeuIleTyrLeuCysSerThrArgIleAsnLeuGluSerIleIle354045LysLysIleProGluLysTyrAlaAspSerIleHisLeuIleGluLeu505560GlnLeuProGluLeuProGluLeuProProHisTyrHisThrThrAsn65707580GlyLeuProProHisLeuAsnProThrLeuHisLysAlaLeuLysMet859095SerLysProAsnPheSerArgIleLeuGlnAsnLeuLysProAspLeu100105110LeuIleTyrAspValLeuGlnProTrpAlaGluHisValAlaAsnGlu115120125GlnAsnIleProAlaGlyLysLeuLeuThrSerCysAlaAlaValPhe130135140SerTyrPhePheSerPheArgLysAsnProGlyValGluPheProPhe145150155160ProAlaIleHisLeuProGluValGluLysValLysIleArgGluIle165170175LeuAlaLysGluProGluGluGlyGlyArgLeuAspGluGlyAsnLys180185190GlnMetMetLeuMetCysThrSerArgThrIleGluAlaLysTyrIle195200205AspTyrCysThrGluLeuCysAsnTrpLysValValProValGlyPro210215220ProPheGlnAspLeuIleThrAsnAspAlaAspAsnLysGluLeuIle225230235240AspTrpLeuGlyThrLysHisGluAsnSerThrValPheValSerPhe245250255GlySerGluTyrPheLeuSerLysGluAspMetGluGluValAlaPhe260265270AlaLeuGluLeuSerAsnValAsnPheIleTrpValAlaArgPhePro275280285LysGlyGluGluArgAsnLeuGluAspAlaLeuProLysGlyPheLeu290295300GluArgIleGlyGluArgGlyArgValLeuAspLysPheAlaProGln305310315320ProArgIleLeuAsnHisProSerThrGlyGlyPheIleSerHisCys325330335GlyTrpAsnSerAlaMetGluSerIleAspPheGlyValProIleIle340345350AlaMetProIleHisAsnAspGlnProIleAsnAlaLysLeuMetVal355360365GluLeuGlyValAlaValGluIleValArgAspAspAspGlyLysIle370375380HisArgGlyGluIleAlaGluThrLeuLysSerValValThrGlyGlu385390395400ThrGlyGluIleLeuArgAlaLysValArgGluIleSerLysAsnLeu405410415LysSerIleArgAspGluGluMetAspAlaValAlaGluGluLeuIle420425430GlnLeuCysArgAsnSerAsnLysSerLys435440<210>4<211>805<212>PRT<213>人工序列<400>4MetAlaGluArgValLeuThrArgValHisSerLeuArgGluArgVal151015AspAlaThrLeuAlaAlaHisArgAsnGluIleLeuLeuPheLeuSer202530ArgIleGluSerHisGlyLysGlyIleLeuLysProHisGluLeuLeu354045AlaGluPheAspAlaIleArgGlnAspAspLysAsnLysLeuAsnGlu505560HisAlaPheGluGluLeuLeuLysSerThrGlnGluAlaIleValLeu65707580ProProTrpValAlaLeuAlaIleArgLeuArgProGlyValTrpGlu859095TyrIleArgValAsnValAsnAlaLeuValValGluGluLeuSerVal100105110ProGluTyrLeuGlnPheLysGluGluLeuValAspGlyAlaSerAsn115120125GlyAsnPheValLeuGluLeuAspPheGluProPheThrAlaSerPhe130135140ProLysProThrLeuThrLysSerIleGlyAsnGlyValGluPheLeu145150155160AsnArgHisLeuSerAlaLysMetPheHisAspLysGluSerMetThr165170175ProLeuLeuGluPheLeuArgAlaHisHisTyrLysGlyLysThrMet180185190MetLeuAsnAspArgIleGlnAsnSerAsnThrLeuGlnAsnValLeu195200205ArgLysAlaGluGluTyrLeuIleMetLeuProProGluThrProTyr210215220PheGluPheGluHisLysPheGlnGluIleGlyLeuGluLysGlyTrp225230235240GlyAspThrAlaGluArgValLeuGluMetValCysMetLeuLeuAsp245250255LeuLeuGluAlaProAspSerCysThrLeuGluLysPheLeuGlyArg260265270IleProMetValPheAsnValValIleLeuSerProHisGlyTyrPhe275280285AlaGlnGluAsnValLeuGlyTyrProAspThrGlyGlyGlnValVal290295300TyrIleLeuAspGlnValProAlaLeuGluArgGluMetLeuLysArg305310315320IleLysGluGlnGlyLeuAspIleIleProArgIleLeuIleValThr325330335ArgLeuLeuProAspAlaValGlyThrThrCysGlyGlnArgIleGlu340345350LysValTyrGlyAlaGluHisSerHisIleLeuArgValProPheArg355360365ThrGluLysGlyIleValArgLysTrpIleSerArgPheGluValTrp370375380ProTyrMetGluThrPheIleGluAspValAlaLysGluIleSerAla385390395400GluLeuGlnAlaLysProAspLeuIleIleGlyAsnTyrSerGluGly405410415AsnLeuAlaAlaSerLeuLeuAlaHisLysLeuGlyValThrGlnCys420425430ThrIleAlaHisAlaLeuGluLysThrLysTyrProAspSerAspIle435440445TyrTrpLysLysPheAspGluLysTyrHisPheSerSerGlnPheThr450455460AlaAspLeuIleAlaMetAsnHisThrAspPheIleIleThrSerThr465470475480PheGlnGluIleAlaGlySerLysAspThrValGlyGlnTyrGluSer485490495HisMetAlaPheThrMetProGlyLeuTyrArgValValHisGlyIle500505510AsnValPheAspProLysPheAsnIleValSerProGlyAlaAspIle515520525AsnLeuTyrPheSerTyrSerGluThrGluLysArgLeuThrAlaPhe530535540HisProGluIleAspGluLeuLeuTyrSerAspValGluAsnAspGlu545550555560HisLeuCysValLeuLysAspArgThrLysProIleLeuPheThrMet565570575AlaArgLeuAspArgValLysAsnLeuThrGlyLeuValGluTrpTyr580585590AlaLysAsnProArgLeuArgGlyLeuValAsnLeuValValValGly595600605GlyAspArgArgLysGluSerLysAspLeuGluGluGlnAlaGluMet610615620LysLysMetTyrGluLeuIleGluThrHisAsnLeuAsnGlyGlnPhe625630635640ArgTrpIleSerSerGlnMetAsnArgValArgAsnGlyGluLeuTyr645650655ArgTyrIleAlaAspThrLysGlyAlaPheValGlnProAlaPheTyr660665670GluAlaPheGlyLeuThrValValGluAlaMetThrCysGlyLeuPro675680685ThrPheAlaThrAsnHisGlyGlyProAlaGluIleIleValHisGly690695700LysSerGlyPheHisIleAspProTyrHisGlyGluGlnAlaAlaAsp705710715720LeuLeuAlaAspPhePheGluLysCysLysLysAspProSerHisTrp725730735GluThrIleSerMetGlyGlyLeuLysArgIleGluGluLysTyrThr740745750TrpGlnIleTyrSerGluSerLeuLeuThrLeuAlaAlaValTyrGly755760765PheTrpLysHisValSerLysLeuAspArgLeuGluIleArgArgTyr770775780LeuGluMetPheTyrAlaLeuLysTyrArgLysMetAlaGluAlaVal785790795800ProLeuAlaAlaGlu805<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>5gggaattccatatggcgaccaacctgcg28<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>6ccgctcgagttagtggtgatgatggtgatgtttg34<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>7taataaggagatataccatggccgaacgtgtcctgaccc39<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>8aggcgcgccgagctcgaattcttattcagctgccagcg38當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3