本發(fā)明屬于水處理領(lǐng)域，涉及糖蛋白絮凝劑，具體涉及一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法

背景技術(shù)：

微生物絮凝劑(MBF)多為次生代謝物，是細胞分泌的大分子。其產(chǎn)量和性能因微生物菌種、發(fā)酵碳源及條件不同而有所差異。從目前報道的MBF的結(jié)構(gòu)看，有蛋白質(zhì)類、多糖類、DNA類、糖蛋白類及其它胞外聚合物類。糖蛋白類MBF分子結(jié)構(gòu)中含有羥基、羰基、糖環(huán)、肽鍵、酯鍵、芳環(huán)及雜環(huán)芳基等多種活性官能團，可用于去除水樣中懸浮固體顆粒物(SS)、重金屬離子、有色物質(zhì)等，可成為綠色的、多功能水處理藥劑。但由于糖蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和較高的微生物絮凝劑生產(chǎn)成本，在實際研究過程中，鮮有人能夠做到穩(wěn)定高產(chǎn)高活性。

現(xiàn)有技術(shù)中，提高微生物絮凝劑產(chǎn)量的方法主要有篩選優(yōu)勢菌株、構(gòu)建基因工程菌、改善營養(yǎng)條件以及優(yōu)化發(fā)酵工藝等常規(guī)方法?；蛘{(diào)控是一個復(fù)雜的過程,涉及定位基因與抑制基因的相互作用、定位基因的表達、絮凝產(chǎn)物的合成與分泌等，且構(gòu)建的基因工程菌只在特定條件下才能表達，因此該方法并不長用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，能夠有效地提高微生物發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑時的產(chǎn)量，并保持穩(wěn)定高產(chǎn)，克服現(xiàn)有的微生物發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑過程中產(chǎn)量低、穩(wěn)定性差的問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，其特征在于，該方法以克雷伯氏菌NY1種子液作為種子液，以加入蔗糖、丙酮酸鈉和α-酮戊二酸鈉的無機鹽培養(yǎng)基為發(fā)酵體系，進行微生物發(fā)酵培養(yǎng)，提取微生物絮凝劑。

具體的，該方法包括以下步驟：

步驟一，制備種子液：

從克雷伯氏菌NY1菌株保存斜面上挑取一環(huán)菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到克雷伯氏菌NY1種子液；

步驟二，制備發(fā)酵體系：

向無機鹽培養(yǎng)基中加入蔗糖、丙酮酸鈉和α-酮戊二酸鈉，溶解，滅菌，得到發(fā)酵體系；

步驟三，微生物發(fā)酵：

向步驟二制得的發(fā)酵體系中接種步驟一制得的克雷伯氏菌NY1種子液，在搖床上，恒溫好氧條件下培養(yǎng)3d，得到發(fā)酵液；

步驟四，提取微生物絮凝劑：

將步驟三制得的發(fā)酵液離心去除NY1菌體，得到上清液，把上清液與無水乙醇按體積比1：3混合，收集漂浮凝聚體，將收集到的漂浮凝聚體，再溶于體積為發(fā)酵液體積三分之一的蒸餾水中；

重復(fù)離心得到上清液和乙醇提取的過程，再次離心去除菌體，用無水乙醇提取，反復(fù)提取三次。取漂浮凝聚體在未干前分裝，凍干，得到糖蛋白絮凝劑。

本發(fā)明還具有如下區(qū)別技術(shù)特征：

步驟一中，所述的克雷伯氏菌NY1種子液為OD_600nm為1.78±0.06的銅綠假單胞菌NY1種子液。

步驟二中，蔗糖投加量為20～21g/L，丙酮酸鈉投加量為1～5g/L，α-酮戊二酸鈉投加量為1～4g/L。丙酮酸鈉和α-酮戊二酸鈉在微生物代謝過程中具有促進其分泌唾液酸的作用。

優(yōu)選的，步驟二中，蔗糖投加量為20g/L，丙酮酸鈉投加量為4g/L，α-酮戊二酸鈉投加量為2g/L。

步驟二中，所述的無機鹽培養(yǎng)基包括(g/L)：2.5gNaNO₃，1mL微量元素(2.5g FeSO₄·7H₂O，0.1g ZnSO₄·7H₂O，0.2g MnCl₂·4H₂O，0.024g CoCl₂·6H₂O，0.024g NiCl₂·6H₂O，0.017g CuCl₂·2H₂O，0.109g Na₂MoO₄·2H₂O，0.062g H₃BO₃，5mL 12.1M HCl，溶于1000mL蒸餾水)，2mL 1M MgSO₄·7H₂O溶液，0.2mL 1M CaCl₂·2H₂O溶液，30mL磷酸鹽緩沖液，調(diào)pH為7.8，加蒸餾水于1000mL容量瓶中定容，121℃高壓水蒸氣滅菌30min。

步驟三中，所述的克雷伯氏菌NY1種子液的接種體積比為1.8％～2.2％。

步驟三中，發(fā)酵培養(yǎng)時，搖床溫度為27℃～31℃，轉(zhuǎn)速為130～165rpm。

優(yōu)選的，步驟三中，發(fā)酵培養(yǎng)時，搖床溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為165rpm。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：

本發(fā)明的方法通過發(fā)酵體系的營養(yǎng)條件來優(yōu)化克雷伯氏菌NY1發(fā)酵過程中唾液酸產(chǎn)量，從而提高具有唾液酸修飾的糖蛋白微生物絮凝劑的產(chǎn)量。本發(fā)明的方法能夠有效地提高克雷伯氏菌NY1發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的產(chǎn)量與活性，同時提高了碳源的轉(zhuǎn)化率，從而降低了微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本。且本發(fā)明的方法能夠使克雷伯氏菌NY1發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的產(chǎn)量及活性達到穩(wěn)定。

附圖說明

圖1是實施例1中克雷伯氏菌NY1所產(chǎn)絮凝劑產(chǎn)量及絮凝率。

圖2是實施例1中克雷伯氏菌NY1所產(chǎn)絮凝劑紅外譜圖。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體內(nèi)容作進一步詳細解釋說明。

具體實施方式

本發(fā)明是獲得高產(chǎn)微生物絮凝劑NY1菌株后，在其優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，從微生物絮凝劑合成機理出發(fā)，改變其營養(yǎng)條件，從而獲得高產(chǎn)、穩(wěn)定且高活性的NY1菌發(fā)酵條件。本申請在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，克雷伯氏菌NY1發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑差量與其發(fā)酵液粘度呈正相關(guān)，發(fā)酵液粘度越大，微生物絮凝劑產(chǎn)量越大。然而對所產(chǎn)微生物絮凝劑的表征發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液粘度大小并不影響微生物絮凝劑的平均分子量，而是與微生物絮凝劑中唾液酸含量成正比。微生物中的唾液酸可調(diào)節(jié)其代謝循環(huán)過程中糖蛋白的半衰期，當(dāng)機體內(nèi)缺少SA，可導(dǎo)致糖蛋白迅速消失。據(jù)此推測，SA分泌可影響MBF的產(chǎn)量與活性?；谶@一點重要原因。

需要說明的是，本申請的克雷伯氏菌NY1為已有的菌種，參見文獻：Nie M,Yin X,Jia J,et al.Production of a novel bioflocculant MNXY1by Klebsiella pneumoniae strain NY1and application in precipitation of cyanobacteria and municipal wastewater treatment[J].J.Appl.Microbiol.,2011,111(3):47-58。

遵從上述技術(shù)方案，以下給出本發(fā)明的具體實施例，需要說明的是本發(fā)明并不局限于以下具體實施例，凡在本申請技術(shù)方案基礎(chǔ)上做的等同變換均落入本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：

本實施例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，該方法包括以下步驟：

步驟一，制備種子液：

菌種的活化：將NY1菌種子液在無菌操作臺轉(zhuǎn)接至牛肉膏固體斜面培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，再放入冰箱冷藏室中保存，每個月至少轉(zhuǎn)接一次。

牛肉膏固體培養(yǎng)基(g/L)為：1000ml牛肉膏液體培養(yǎng)基中加入18g～20g瓊脂加熱攪拌至沸騰用作斜面和平板。

無菌條件下，從克雷伯氏菌NY1菌株保存斜面上挑取一環(huán)菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃,160rpm恒溫振蕩，好氧培養(yǎng)24h，得到OD_600nm為1.78±0.06的克雷伯氏菌NY1種子液。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(g/L)為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉(NaCl)5g，溶于1000ml蒸餾水中，加熱至牛肉膏完全溶解后至室溫時調(diào)pH于7.5，121℃高壓蒸汽滅菌30min備用。

本實施例中，克雷伯氏菌NY1種子液為OD_600nm為1.78±0.06的銅綠假單胞菌NY1種子液。

步驟二，制備發(fā)酵體系：

向無機鹽培養(yǎng)基中加入蔗糖、丙酮酸鈉和α-酮戊二酸鈉，置于250ml錐形瓶中，待其溶解后于121℃高壓蒸汽滅菌30min，得到發(fā)酵體系，備用。

蔗糖投加量為20g/L，丙酮酸鈉投加量為4g/L，α-酮戊二酸鈉投加量為2g/L。

無機鹽培養(yǎng)基包括：2.5gNaNO₃，1mL微量元素(2.5g FeSO₄·7H₂O，0.1g ZnSO₄·7H₂O，0.2g MnCl₂·4H₂O，0.024g CoCl₂·6H₂O，0.024g NiCl₂·6H₂O，0.017g CuCl₂·2H₂O，0.109g Na₂MoO₄·2H₂O，0.062g H₃BO₃，5mL 12.1M HCl，溶于1000mL蒸餾水)，2mL 1M MgSO₄·7H₂O溶液，0.2mL 1M CaCl₂·2H₂O溶液，30mL磷酸鹽緩沖液，調(diào)pH為7.8，加蒸餾水于1000mL容量瓶中定容，121℃高壓水蒸氣滅菌30min。

在糖蛋白末端，細胞表面存在少量唾液酸(SA)，很少以游離的形式存在，它們大多通過2-位異頭碳的羥基以α-糖苷鍵溝通內(nèi)外并具防御功能，SA修飾蛋白質(zhì)與否可以調(diào)節(jié)生物體液和粘蛋白的粘度。SA可調(diào)節(jié)循環(huán)過程中糖蛋白的半衰期，當(dāng)機體內(nèi)缺少SA，可導(dǎo)致糖蛋白迅速消失。據(jù)此推測，SA分泌可影響MBF的產(chǎn)量與活性。丙酮酸是合成聚唾液酸的前體物質(zhì)，發(fā)酵液中添加前體物質(zhì)有助于該類物質(zhì)的合成。同時丙酮酸是微生物TCA循環(huán)的起始物質(zhì)，而在TCA循環(huán)中，丙酮酸會代謝為α-酮戊二酸鈉，因此α-酮戊二酸鈉也有利于合成唾液酸，因此，選擇蔗糖為主要碳源，丙酮酸為第二碳源，α-酮戊二酸鈉為第三碳源組成三碳源發(fā)酵體系。

步驟三，微生物發(fā)酵：

向步驟二制得的發(fā)酵體系中接種步驟一制得的克雷伯氏菌NY1種子液，在搖床上，恒溫好氧條件下培養(yǎng)3d，得到發(fā)酵液；

其中，克雷伯氏菌NY1種子液的接種體積比為2％；發(fā)酵培養(yǎng)時，搖床溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為165rpm。

溫度是微生物的重要生存因子，在適宜的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，酶促反應(yīng)速率也會相應(yīng)提高，則微生物的代謝速率和生長速率能夠相應(yīng)提高。但是過低或者過高的溫度則均會降低微生物的代謝速率和生長速率。

克雷伯氏菌NY1屬于好氧微生物，發(fā)酵體系內(nèi)的溶解氧對它的生長至關(guān)重要，在一定范圍內(nèi)溶解氧越多，越有利于NY1的生長和對絮凝劑的分泌，轉(zhuǎn)速對于溶解氧量就更加尤為重要。

步驟四，提取微生物絮凝劑：

將步驟三制得的發(fā)酵液離心去除NY1菌體，得到上清液，把上清液與無水乙醇按體積比1：3混合，收集漂浮凝聚體，將收集到的漂浮凝聚體，再溶于體積為發(fā)酵液體積三分之一的蒸餾水中；

重復(fù)離心得到上清液和乙醇提取的過程，再次離心去除菌體，用無水乙醇提取，反復(fù)提取三次，取漂浮凝聚體在未干前分裝，凍干，得到糖蛋白絮凝劑。

結(jié)果測試表征：

克雷伯氏菌NY1所產(chǎn)絮凝劑產(chǎn)量均為11g/L以上，絮凝率為96％以上，絮凝劑中唾液酸含量為10ng/gMBF～12.52ng/gMBF(MBF指的是糖蛋白絮凝劑)之間，蛋白質(zhì)含量為0.37g/gMBF～0.4g/gMBF之間。不同時間節(jié)點發(fā)酵所產(chǎn)絮凝劑的產(chǎn)量和絮凝率如圖1所示，在較長的時間跨度內(nèi)所產(chǎn)的絮凝劑均能保持高產(chǎn)高活，這也是本技術(shù)的優(yōu)越性所在。

克雷伯氏菌NY1所產(chǎn)絮凝劑的紅外譜圖如圖2所示，在3430cm^-1附近寬而強的吸收峰為-OH和-NH的伸縮振動峰，絮凝劑中有分子間和分子內(nèi)氫鍵存在；1638cm^-1處寬峰是由仲酰胺基(-NHC＝O-)的C＝O鍵伸縮振動造成的，可以看出絮凝劑分子中蛋白肽鏈主要為無規(guī)則卷曲和螺旋狀；1400cm^-1～1200cm^-1所看到的不太尖的吸收峰(1373cm^-1，1232cm^-1)是C-H的變角振動；1200cm^-1～1000cm^-1間比較大的吸收峰是所有糖衍生物的典型吸收，包括不同基團的C-O變形振動和伸縮振動、C-O-C伸縮振動等。

對比例1：

本對比例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二的發(fā)酵體系中，由三碳源體系變?yōu)殡p碳源體系，蔗糖投加量為20g/L，丙酮酸鈉投加量為6g/L，不投加α-酮戊二酸鈉。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。絮凝劑的產(chǎn)量為9.52g/L，絮凝率為95.28％，絮凝劑中SA含量為9.5ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.3g/gMBF。遠遠低于實施例1的各項指標(biāo)。

對比例2：

本對比例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二的發(fā)酵體系中，由三碳源體系變?yōu)殡p碳源體系，蔗糖投加量為22g/L，丙酮酸鈉投加量為4g/L，不投加α-酮戊二酸鈉。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。絮凝劑的產(chǎn)量為8.725g/L，絮凝率為94.23％，絮凝劑中SA含量為9.2ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.29g/gMBF。遠遠低于實施例1的各項指標(biāo)。

對比例3：

本對比例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二的發(fā)酵體系中，由三碳源體系變?yōu)樗奶荚大w系，蔗糖投加量為20g/L，丙酮酸鈉為2g/L，α-酮戊二酸鈉為1g/L，草酰乙酸二乙酯鈉投加量為3g/L。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。絮凝劑的產(chǎn)量為7.825g/L，絮凝率為92.13％，絮凝劑中SA含量為7.5ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.25g/gMBF。遠遠低于實施例1的各項指標(biāo)。

實施例2：

本實施例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二中，蔗糖投加量為20g/L，丙酮酸鈉為5g/L，α-酮戊二酸鈉為1g/L。步驟三中，克雷伯氏菌NY1種子液的接種體積比為1.8％。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。本實施例紅外表征結(jié)果與實施例1相同。絮凝劑的產(chǎn)量為11.85g/L，絮凝率為96.325％，絮凝劑中SA含量為10.986ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.386g/gMBF。

實施例3：

本實施例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二中，蔗糖投加量為20g/L，丙酮酸鈉為4g/L，α-酮戊二酸鈉為2g/L。步驟三中搖床轉(zhuǎn)速為155rpm。步驟三中，克雷伯氏菌NY1種子液的接種體積比為2.2％。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。本實施例紅外表征結(jié)果與實施例1相同。絮凝劑的產(chǎn)量為11.785g/L，絮凝率為96.489％，絮凝劑中SA含量為10.9456ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.376g/gMBF。

實施例4：

本實施例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二中，蔗糖投加量為20g/L，丙酮酸鈉為3g/L，α-酮戊二酸鈉為3g/L。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。本實施例紅外表征結(jié)果與實施例1相同。絮凝劑的產(chǎn)量為11.239g/L，絮凝率為96.597％，絮凝劑中SA含量為11.0565ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.394g/gMBF。

實施例5：

本實施例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二中，蔗糖投加量為20g/L，丙酮酸鈉為2g/L，α-酮戊二酸鈉為4g/L。步驟三中搖床轉(zhuǎn)速為130rpm。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。本實施例紅外表征結(jié)果與實施例1相同。絮凝劑的產(chǎn)量為11.548g/L，絮凝率為96.846％，絮凝劑中SA含量為10.964ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.403g/gMBF。

實施例6：

本實施例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二中，蔗糖投加量為21g/L，丙酮酸鈉為4g/L，α-酮戊二酸鈉為1g/L。步驟三中搖床溫度設(shè)定為31℃。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。本實施例紅外表征結(jié)果與實施例1相同。絮凝劑的產(chǎn)量為11.364g/L，絮凝率為96.175％，絮凝劑中SA含量為10.8965ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.377g/gMBF。

實施例7：

本實施例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二中，蔗糖投加量為21g/L，丙酮酸鈉為3g/L，α-酮戊二酸鈉為2g/L。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。本實施例紅外表征結(jié)果與實施例1相同。絮凝劑的產(chǎn)量為11.236g/L，絮凝率為96.468％，絮凝劑中SA含量為11.0634ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.398g/gMBF。

實施例8：

本實施例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：步驟二中，蔗糖投加量為21g/L，丙酮酸鈉為2g/L，α-酮戊二酸鈉為3g/L。步驟三中搖床溫度設(shè)定為27℃。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。本實施例紅外表征結(jié)果與實施例1相同。絮凝劑的產(chǎn)量為11.895g/L，絮凝率為96.587％，絮凝劑中SA含量為10.9778ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.41g/gMBF。

實施例9：

本實施例給出一種細菌發(fā)酵生產(chǎn)糖蛋白絮凝劑中提高產(chǎn)量活性穩(wěn)定性的方法，該方法的步驟與實施例1基本相同，區(qū)別在于：蔗糖投加量為21g/L，丙酮酸鈉為1g/L，α-酮戊二酸鈉為4g/L。

在恒溫震蕩箱培養(yǎng)發(fā)酵3d，最后提取絮凝劑。本實施例紅外表征結(jié)果與實施例1相同。絮凝劑的產(chǎn)量為11.647g/L，絮凝率為96.563％，絮凝劑中SA含量為11.1236ng/gMBF，蛋白質(zhì)含量為0.399g/gMBF。