本發(fā)明涉及核苷類產(chǎn)品生物技術生產(chǎn)領域，尤其是一種丙谷二肽的制備方法。

背景技術：

L-谷氨酰胺作為一種人體代謝所必需氨基酸，其在體內轉變成為糖胺，作為合成粘蛋白的前體，可促進潰瘍愈合，作為腸外營養(yǎng)藥品應用于嚴重感染、復合性骨折、創(chuàng)傷、大手術、大面積燒傷，化學毒物傷害、輻射傷害、有害物傷害病人的治療和恢復；還可用作腦功能改善劑，用于改善智力發(fā)育不良兒童和精神障礙、酒精中毒、癲癇病人腦功能；此外，它還可以作為免疫缺乏綜合征如艾滋病、危重病或骨髓移植后伴發(fā)的免疫功能低下的治療藥物，因而廣泛應用于醫(yī)療行業(yè)。由于L-谷氨酰胺對酸敏感，加熱時易產(chǎn)生有毒的焦谷氨酸和氨，水溶性差(35g/L，20℃)，長期儲存時化學穩(wěn)定性不足等化學性質大大限制了其在臨床上的應用。為了解決L-谷氨酰胺的這些缺陷，研究人員做了一系列的研究，其中一種方法就是通過與其它氨基酸連接形成二肽，作為L-谷氨酰胺的替代品應用于臨床。在這些二肽中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(簡稱丙谷二肽)的水溶性和熱穩(wěn)定性均優(yōu)于L-谷氨酰胺與其它氨基酸形成的二肽，是國際公認的L-谷氨酰胺的最適載體。

丙谷二肽是由L-丙氨酸和L-谷氨酰胺縮合形成的二肽，屬于氨基酸類的化學藥劑，由德國費森尤斯(Fresenius AG)于1995年研發(fā)成功，首先在德國批準上市，1999年作為進口藥物進入中國市場。目前，工業(yè)生產(chǎn)丙谷二肽的方法主要為化學法(ZL201210371136.4；ZL201210382194.7；ZL201310169606.3；ZL 201310700449.4)。近年來，已有報道采用氨基酸酯酰基轉移酶催化L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺生成丙谷二肽(201410663050.8；201410670694.X；201510064439.5)，但由于原料L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽合成工藝復雜，導致該方法的生產(chǎn)成本較高，不利于工業(yè)化放大。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種低成本的丙谷二肽的制備方法。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是：

一種丙谷二肽的制備方法，以L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、ADP和乙酰磷酸為原料(底物)，加入氨基酸連接酶和乙酸激酶，在pH 6.5-9.5、32-42℃溫度條件下通過酶促反應偶聯(lián)催化合成丙谷二肽。

優(yōu)選的，上述丙谷二肽的制備方法，具體步驟如下：

(1)分別構建氨基酸連接酶的基因重組表達載體pET-His-ywfE和乙酸激酶的基因重組表達載體pET-His-ack，其中，所述氨基酸連接酶編碼基因來源于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(ATCC 15245)，其核苷酸序列為序列表400<1>所示序列；乙酸激酶編碼基因來源于丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum(ATCC 4259)，其核苷酸序列為序列表400<2>所示序列，質粒pET-His的核苷酸序列為序列表400<3>所示序列；

(2)分別將步驟(1)中的重組表達載體轉化至大腸桿菌Escherichia coli BL21(ACCC11171),獲得基因工程重組菌株E.coli pET-His-ywfE和E.coli pET-His-ack；

(3)培養(yǎng)步驟(2)中的重組菌株，從而獲得表達氨基酸連接酶和乙酸激酶的菌體；

(4)破碎步驟(3)中的菌體獲得粗酶液，經(jīng)鎳柱純化后混合；

(5)將步驟(4)中獲得的混合酶液加入含有30-60mM丙氨酸、30-60mM谷氨酰胺、3.0-6.0mM ADP和30-60mM乙酰磷酸的催化液中，在pH值為7.0-9.0，溫度為32-42℃條件下進行酶促反應合成丙谷二肽。

優(yōu)選的，上述丙谷二肽的制備方法，所述步驟(3)中重組菌株中的培養(yǎng)方法為：重組菌株從甘油保菌管中以0.1％(v/v)的接種量接種至100mL含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，于37℃200rpm培養(yǎng)12h，再按1％(v/v)接種量轉接400mL含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，于37℃200rpm繼續(xù)培養(yǎng)；待菌株濃度OD_600nm達到0.6-0.8時添加終濃度為0.1-0.3mmol/L的IPTG，28℃誘導培養(yǎng)8-10h表達蛋白。

優(yōu)選的，上述丙谷二肽的制備方法，所述LB液體培養(yǎng)基為：每10g NaCl與5g酵母粉、10g蛋白胨用去離子水定容到1L。

優(yōu)選的，上述丙谷二肽的制備方法，所述催化液為濃度50mM的PBS緩沖液中含有L-丙氨酸、L-谷氨酰胺和乙酰磷酸的濃度均為50mM，ADP的濃度為5mM。

上述丙谷二肽的制備方法所得反應液中丙谷二肽的檢測方法為：取適量體積的反應液于13000rpm離心10min后，取上清用20％的水楊酸稀釋至10-50mg/L，靜止10min后，用0.22um的無菌膜過濾至液相瓶待分析。采用全自動氨基酸分析儀，陽離子交換樹脂色譜柱，130℃反應，柱溫57℃，進樣量50uL，檢測波長為570nm，保留時間為23min。

本發(fā)明的有益效果是：

上述丙谷二肽的制備方法，在氨基酸連接酶催化反應中所需要的ATP由乙酸激酶催化反應不斷提供，只需消耗少量的ADP即可實現(xiàn)ATP的循環(huán)再生；且原料來源廣泛，成本較低，操作簡單，易于規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為雙酶偶聯(lián)反應示意圖；

圖2為丙谷二肽標準品的色譜圖(丙谷二肽出峰時間為23.1min)；

圖3為雙酶催化反應液的色譜圖(丙谷二肽出峰時間為23.1min)。

具體實施方式

為了使本領域的技術人員更好的理解本發(fā)明的技術方案，下面結合具體實施方式對本發(fā)明所述技術方案作進一步的詳細說明。

實施例1氨基酸連接酶菌株的構建

①根據(jù)Genbank上B.subtilis ATCC 15245的氨基酸連接酶編碼基因ywfE的核苷酸序列，用大腸桿菌中常用的密碼子軟件對其進行密碼子優(yōu)化，將優(yōu)化后序列加上酶切位點BamH I和Hind III(序列表400<1>所示序列)送到金唯智公司進行合成。

②使用Takara限制性內切酶BamH I和Hind III雙酶切步驟①中的目的基因片段及pET-His載體質粒，獲得帶有相同粘性末端的ywfE和pET-His線性片段。

③使用Takara T4DNA連接酶連接步驟②中的兩個基因片段，得到重組表達載體pET-His-ywfE。

④將步驟③中的重組表達載體轉化入E.coli BL21(ACCC11171)中，獲得產(chǎn)氨基酸連接酶菌株E.coli pET-His-ywfE。

實施例2乙酸激酶菌株的構建

①采用PCR技術以丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 4259基因組為模板，根據(jù)乙酸激酶編碼基因ack的核苷酸序列序列(序列表400<2>所示序列)設計一對基因擴增引物(上游引物為序列表400<4>所示序列，下游引物為序列表400<5>所示序列)，擴增獲取ack基因片段。所述一對引物分別包含酶切位點BamH I和EcoRI。

②使用Takara限制性內切酶BamH I和EcoRI雙酶切步驟①中獲得目的片段及pET-His載體質粒，獲得帶有相同粘性末端的ack和pET-His線性片段。

③使用Takara T4DNA連接酶連接步驟②中獲得的兩個兩個基因片段，得到重組表達載體pET-His-ack。

④將步驟③重組表達載體轉化入E.coli BL21(ACCC11171)中，獲得產(chǎn)乙酸激酶菌株E.coli pET-His-ack。

實施例3氨基酸連接酶和乙酸激酶的制備

①將(1)和(2)中的菌株從甘油保菌管中以0.1％(v/v)的接種量接種至100mL含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，于37℃200rpm培養(yǎng)12h，再按1％(v/v)接種量轉接400mL含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，于37℃200rpm繼續(xù)培養(yǎng)。待菌株濃度OD_600nm達到0.6時添加終濃度為0.1mmol/L的IPTG，28℃誘導培養(yǎng)10h表達蛋白。

②培養(yǎng)結束后，將發(fā)酵液于4℃，6000rpm離心收集菌體。使用pH 7.4的PBS緩沖液洗滌三次后，再用pH 7.4的PBS緩沖液重懸，超聲破碎20min，4℃，10000rpm離心取上清液。

③將上清液以1mL/min的流速通過Ni⁺-NTA樹脂后，用50mM的咪唑溶液以1mL/min的流速洗脫，再用250mM的咪唑溶液以1mL/min的流速洗脫目的蛋白。

④將洗脫下來的目的蛋白用pH 7.4的PBS緩沖液于4℃下透析脫鹽，每2h更換一次透析液，重復透析四次之后，將所獲的目的蛋白混合得到混合酶液。

實施例4雙酶偶聯(lián)催化合成丙谷二肽

①配制反應體系，其中L-丙氨酸，L-谷氨酰胺和乙酰磷酸的濃度均為50mM，ADP的濃度為5mM，PBS緩沖液濃度為50mM，pH值為8.0。

②向步驟①中的反應體系內添加混合酶液使得氨基酸連接酶的終濃度為0.2mg/mL，乙酸激酶的終濃度為0.4mg/mL。于37℃恒溫水浴搖床，200rpm，反應8h。

實施例5反應液中丙谷二肽的檢測

使用氨基酸分析儀(Sykam S7130)測定丙谷二肽的含量，進樣量為50uL，色譜柱為PEEK色譜柱，柱溫為57℃，反應器為130℃，流動相為pH 3.4和pH 10.8的鈉鹽，檢測波長為440和570nm，保留時間為23min。經(jīng)液氨基酸分析儀檢測，如附圖3所示，反應液中丙谷二肽濃度為32.5mM。

上述參照具體實施方式對該一種丙谷二肽的制備方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構思下的變化和修改，應屬本發(fā)明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大學

<120> 一種丙谷二肽的制備方法

<130> 2017

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1419

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌

<220>

<221> 氨基酸連接酶編碼基因ywfE

<222> (1)..(1419)

<400> 1

atggagcgca aaacagttct ggttatcgcc gatctgggtg gctgccctcc gcacatgttt 60

tataaaagcg ccgccgagaa gtacaatctg gtgagcttca ttccgcgccc ttttgccatc 120

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gccgacgcca tcaccaccaa taatgagctg ttcatcgccc ctatggccaa agcatgtgaa 360

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cacgccaagc tgaccgccaa atatgttctg ccggtgtaa 1419

<210> 2

<211> 1206

<212> DNA

<213> 丙酮丁醇梭菌

<220>

<221> 乙酸激酶編碼基因ack

<222> (1)..(1206)

<400> 2

atgaaaaact tagttattaa ctgcggtagt tcatcaatca aataccagtt tatagatatg 60

aaggatgaaa ctgtactcgc taaaggatta gttgaaagaa ttggaataaa aggatctgta 120

ataacccata aagtaaatgg agaaaaatat gttacagaaa ctcctatgga agatcataaa 180

agggctataa agcttgtatt agatgcttta ttaaatgatg aatatggtgt tataaaaaat 240

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aaataa 1206

<210> 3

<211> 2799

<212> DNA

<213> 質粒

<220>

<221> pET-His質粒

<222> (1)..(2799)

<400> 3

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acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggatctg gcgtaatagc 120

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caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 1380

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gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 1500

cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 1560

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atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 1860

tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 1920

gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 1980

actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 2040

gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 2100

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ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 2220

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cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 2340

gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 2400

cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat 2460

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gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca 2580

aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag gatctcgatc ccgcgaaatt 2640

aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct agaaataatt ttgtttaact 2700

ttaagaagga gatataccat gcatcatcac catcaccatc tgctgccgcg cggatccgca 2760

gaattcagcg ctagctaaca tatcatcatc attaagctt 2799

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物

<220>

<221> ack 基因擴增上游引物

<222> (1)..(35)

<400> 4

cgggatccat gaaaaactta gttattaact gcggt 35

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 引物

<220>

<221> ack 基因擴增下游引物

<222> (1)..(37)

<400> 5

cggaattctt attttaactt gcctactata tctttgg 37