1.一種適合工業(yè)化生產的重組水蛭素分離純化的方法,其特征在于,步驟如下:
(1)取水蛭素(HV3)蛋白表達工程菌菌種培養(yǎng)發(fā)酵得到發(fā)酵液,將發(fā)酵液離心,得發(fā)酵液上清液,備用;
(2)將上述發(fā)酵液上清液用鹽酸將pH調為3.8-4.2,之后放入發(fā)酵罐中加熱至78-82℃,備用;
(3)將步驟(2)中所得發(fā)酵液從罐中取出保持2-8℃靜置,待分層后取發(fā)酵液上清液,備用;
(4)將步驟(3)中發(fā)酵液上清液用0.45μm過濾器進行過濾;將過濾后的發(fā)酵液進行分離純化得到目的蛋白活性部分。
2.根據權利要求1所述的適合工業(yè)化生產的重組水蛭素分離純化的方法,其特征在于,步驟(1)中菌種培養(yǎng)發(fā)酵的步驟如下:
A、將保存的水蛭素(HV3)蛋白表達工程菌菌種在LBA固體培養(yǎng)基上保持恒溫靜止培養(yǎng)11-13小時,得到單菌落,備用;
B、選取上述單菌落,接種于LBA液體培養(yǎng)基中保持恒溫搖床培養(yǎng)14-16小時,得一級種子液,備用;
C、吸取上述一級種子液,接種于LBA液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),保持恒溫搖床培養(yǎng)14-16小時,制得二級種子液,備用;
D、監(jiān)測上述二級種子液的OD600nm值,待OD600nm值達到4.0-4.4時,開始流加補碳培養(yǎng)基,補料過程中將溶氧控制在20%-40%,待OD600連續(xù)4.5-5.5小時不再增長時,停止補碳,開始緩慢流加補氮培養(yǎng)基,待水蛭素(HV3)蛋白表達工程菌菌種活性不再增長時,停止補氮,發(fā)酵至菌體進入自溶階段、產物合成能力下降時終止發(fā)酵,制得發(fā)酵液,備用。
3.根據權利要求2所述的適合工業(yè)化生產的重組水蛭素分離純化的方法,其特征在于,菌種培養(yǎng)發(fā)酵的各步驟中,恒溫控制在36.5-37.5℃。
4.根據權利要求3所述的適合工業(yè)化生產的重組水蛭素分離純化的方法,其特征在于,菌種培養(yǎng)發(fā)酵的各步驟中,恒溫控制在37℃。
5.根據權利要求1所述的適合工業(yè)化生產的重組水蛭素分離純化的方法,其特征在于,步驟(2)中,發(fā)酵上清液用12M鹽酸將pH調為4.0,將發(fā)酵液放入罐中加熱至80℃。
6.根據權利要求5所述的適合工業(yè)化生產的重組水蛭素分離純化的方法,其特征在于,將發(fā)酵液放入罐中加熱至80℃保持50-70分鐘,有效除去雜蛋白。