本發(fā)明涉及在液體培養(yǎng)基中對多能干細(xì)胞等有用的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)而制備細(xì)胞聚集體的方法。

背景技術(shù)：

隨著近年對人es細(xì)胞、人ips細(xì)胞等人多能干細(xì)胞的研究，再生醫(yī)療的實用化的可能性正在增加。這些細(xì)胞具有能夠無限增殖的能力和分化為各種細(xì)胞的能力，因此期待使用了多能干細(xì)胞的再生醫(yī)療可根本性地改變對疑難疾病、生活習(xí)慣病等的治療方法。已經(jīng)能夠在試管內(nèi)從多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為以神經(jīng)細(xì)胞為代表的心肌細(xì)胞、血液細(xì)胞及網(wǎng)膜細(xì)胞等各種細(xì)胞。

作為面向使用多能干細(xì)胞對各種臟器進(jìn)行再生的再生醫(yī)療的實用化的課題之一，有如何高效地生產(chǎn)臟器再生所需要的大量細(xì)胞的課題。例如，肝臟的再生需要約2×10¹¹個細(xì)胞。通過在平坦的基板上的貼壁培養(yǎng)來培養(yǎng)上述個數(shù)的細(xì)胞需要10⁶cm²以上的基板，以普通的10cm培養(yǎng)皿計，這相當(dāng)于約20,000個的量分。對于基板表面上的貼壁培養(yǎng)而言，由于得到的細(xì)胞數(shù)量依賴于培養(yǎng)面積，因此難以擴(kuò)大規(guī)模，難以供給再生醫(yī)療所需要的足夠量的細(xì)胞。

在液體培養(yǎng)基中使細(xì)胞懸浮并進(jìn)行培養(yǎng)的懸浮培養(yǎng)容易進(jìn)行規(guī)模擴(kuò)大，可以期待其適于細(xì)胞的大量生產(chǎn)。

非專利文獻(xiàn)3中公開了一種制備均勻大小的球狀體的方法，該方法包括：使用懸浮培養(yǎng)瓶(spinnerflask)作為懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)容器，并在通過強(qiáng)大的攪拌力對液體培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌的同時進(jìn)行人多能干細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。

非專利文獻(xiàn)4中公開了一種使用形成了微小的微孔的基板在各微孔中制備均勻大小的球狀體的方法。

非專利文獻(xiàn)5中公開了如下方法：使用調(diào)整了粘性、比重的培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，保持多能干細(xì)胞的懸浮狀態(tài)，并且在抑制細(xì)胞彼此碰撞的同時進(jìn)行培養(yǎng)。

專利文獻(xiàn)1中公開了一種在液體培養(yǎng)基中在對細(xì)胞進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的同時進(jìn)行培養(yǎng)，從而制備細(xì)胞的聚集體的技術(shù)。

專利文獻(xiàn)2中公開了一種將多能干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)至細(xì)胞團(tuán)的平均直徑為約200～300μm的方法。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開2003-304866號公報

專利文獻(xiàn)2：國際公開wo2013/077423號小冊子

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：takayaman,nishimuras,nakamuras,shimizut,ohnishir,endoh,yamaguchit,otsum,nishimurak,nakanishim,sawaguchia,nagair,takahashik,yamanakas,nakauchih,etok.transientactivationofc-mycexpressioniscriticalforefficientplateletgenerationfromhumaninducedpluripotentstemcells.jexpmed.2010dec20；207(13)：2817-30.doi：10.1084/jem.20100844.epub2010nov22.pubmedpmid:21098095；pubmedcentralpmcid:pmc3005234.

非專利文獻(xiàn)2：frgarcia-gonzaloandjcibelmonte,albumin-associatedlipidsregulatehumanembryonicstemcellself-renewal.plosone,2008,3(1),e1384

非專利文獻(xiàn)3：olmerr.etal.,tissueengineering:partc,volume18(10):772-784(2012)

非專利文獻(xiàn)4：ungrinmdetal.,plosone,2008,3(2),e1565

非專利文獻(xiàn)5：otsujigtetal.,stemcellreports,volume2:734-745(2014)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

雖然如上所述開發(fā)了通過懸浮培養(yǎng)來制備細(xì)胞聚集體的各種技術(shù)，但本發(fā)明人等認(rèn)為仍有以下尚未解決的課題。

多能干細(xì)胞等貼壁細(xì)胞(adherentcell)通過懸浮培養(yǎng)而形成聚集體。作為細(xì)胞凝聚的機(jī)理，可以列舉：膜蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜等細(xì)胞間的非特異性吸附、細(xì)胞表面的鈣黏著蛋白所介導(dǎo)的細(xì)胞間的粘接等。人ips細(xì)胞等細(xì)胞無法以單細(xì)胞的形式生存，因此，為了生存需要形成細(xì)胞聚集體，但在聚集體過大時，營養(yǎng)無法充分地到達(dá)聚集體內(nèi)部的細(xì)胞，存在增殖受阻、對保持未分化性造成影響的問題。為了防止過度凝聚，可以考慮在培養(yǎng)中使液體培養(yǎng)基流動，但存在過度的流動對細(xì)胞造成物理性刺激而對細(xì)胞造成傷害的危險。因此，要求不對細(xì)胞造成傷害地生產(chǎn)適度大小的聚集體的懸浮培養(yǎng)技術(shù)，但背景技術(shù)一欄中列舉的現(xiàn)有的聚集體制備方法仍有改善的余地。

非專利文獻(xiàn)3的方法中存在因剪切應(yīng)力而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的問題。

非專利文獻(xiàn)4的方法中存在難以大規(guī)模化、難以更換培養(yǎng)基等的問題。

非專利文獻(xiàn)5的方法中存在培養(yǎng)時培養(yǎng)基的移動少而難以對細(xì)胞聚集體供給氧、營養(yǎng)成分的問題。

專利文獻(xiàn)1中未公開用于將細(xì)胞團(tuán)的大小控制為適度大小的方法。

專利文獻(xiàn)2中記載了在培養(yǎng)基中添加水溶性高分子來提高粘性的方法作為用于防止細(xì)胞團(tuán)彼此粘接的方法。因此，與非專利文獻(xiàn)5同樣地存在難以對細(xì)胞聚集體供給氧、營養(yǎng)成分的問題。

因此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞聚集體的制備方法，該方法易于將細(xì)胞聚集體制備成適于培養(yǎng)的大小、且對細(xì)胞造成傷害的可能性小。

解決課題的方法

本發(fā)明人等令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過在液體培養(yǎng)基中添加脂質(zhì)(特別是磷脂)來進(jìn)行細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)能夠大量生產(chǎn)適當(dāng)尺寸的細(xì)胞聚集體的集群，從而完成了本發(fā)明。在本發(fā)明中，不使用培養(yǎng)基的粘性、基于攪拌的剪切應(yīng)力、或微孔板等培養(yǎng)器的形狀等培養(yǎng)環(huán)境改變的機(jī)械學(xué)/物理學(xué)方法，而是使用利用生物體中存在的物質(zhì)使培養(yǎng)基組成發(fā)生改變的生化學(xué)/化學(xué)方法。具體而言，本發(fā)明包括以下的發(fā)明。

(1)一種細(xì)胞聚集體的制備方法，該方法包括：在含有溶血磷脂的液體培養(yǎng)基中使細(xì)胞懸浮并進(jìn)行培養(yǎng)的工序。典型的所述工序是通過在含有溶血磷脂的液體培養(yǎng)基中使細(xì)胞懸浮并進(jìn)行培養(yǎng)來控制培養(yǎng)中所述細(xì)胞聚集體的尺寸增大的工序。

(2)根據(jù)(1)所述的方法，其中，所述液體培養(yǎng)基含有大于0.0064μg/ml且100μg/ml以下的所述溶血磷脂。

(3)根據(jù)(1)或(2)所述的方法，其還包括下述工序中的至少一者：

添加所述溶血磷脂來制備所述液體培養(yǎng)基的工序，以及

通過酶反應(yīng)生成所述溶血磷脂來制備所述液體培養(yǎng)基的工序。

(4)根據(jù)(1)～(3)中任一項所述的方法，其中，所述細(xì)胞是在貼壁或懸浮進(jìn)行培養(yǎng)后經(jīng)過分離的細(xì)胞。

(5)根據(jù)(1)～(4)中任一項所述的方法，其中，所述溶血磷脂是溶血磷脂酸及鞘氨醇-1-磷酸中的至少一者。

(6)根據(jù)(1)～(5)中任一項所述的方法，其中，所述液體培養(yǎng)基含有選自l-抗壞血酸、胰島素、運鐵蛋白、硒及碳酸氫鈉中的至少一者。

(7)根據(jù)(1)～(6)中任一項所述的方法，其中，所述液體培養(yǎng)基含有生長因子。

(8)根據(jù)(7)所述的方法，其中，所述生長因子是fgf2及tgf-β1中的至少一者。

(9)根據(jù)(1)～(8)中任一項所述的方法，其中，所述液體培養(yǎng)基含有rock抑制劑。

(10)根據(jù)(9)所述的方法，其中，所述rock抑制劑是y-27632。

(11)根據(jù)(1)～(10)中任一項所述的方法，其中，所述細(xì)胞是多能干細(xì)胞。

(12)通過(1)～(11)中任一項所述的方法制備的細(xì)胞聚集體。

(13)一種細(xì)胞凝聚抑制劑，其含有溶血磷脂。在本發(fā)明中，“細(xì)胞凝聚抑制劑”也可以表達(dá)為“細(xì)胞凝聚控制劑”。

(14)根據(jù)(13)所述的細(xì)胞凝聚抑制劑，其含有大于0.0064μg/ml且100μg/ml以下的所述溶血磷脂。

(15)根據(jù)(13)或(14)所述的細(xì)胞凝聚抑制劑，其還含有生長因子。

(16)根據(jù)(15)所述的細(xì)胞凝聚抑制劑，其中，所述生長因子是fgf2及tgf-β1中的至少一者。

(17)根據(jù)(13)～(16)中任一項所述的細(xì)胞凝聚抑制劑，其還含有rock抑制劑。

(18)根據(jù)(17)所述的細(xì)胞凝聚抑制劑，其中，所述rock抑制劑是y-27632。

(19)根據(jù)(13)～(18)中任一項所述的細(xì)胞凝聚抑制劑，其中，所述溶血磷脂是溶血磷脂酸及鞘氨醇-1-磷酸中的至少一者。

(20)一種溶血磷脂的用途，其用于抑制細(xì)胞的凝聚。在本發(fā)明中，“用于抑制細(xì)胞的凝聚的用途”可以表達(dá)為“用于在細(xì)胞培養(yǎng)中控制細(xì)胞的凝聚的用途”。

(21)根據(jù)(20)所述的用途，其中，所述溶血磷脂以大于0.0064μg/ml且100μg/ml以下的濃度存在。

(22)根據(jù)(20)或(21)所述的用途，其中，所述溶血磷脂與生長因子組合使用。

(23)根據(jù)(22)所述的用途，其中，所述生長因子是fgf2及tgf-β1中的至少一者。

(24)根據(jù)(20)～(23)中任一項所述的用途，其中，所述溶血磷脂與rock抑制劑組合使用。

(25)根據(jù)(24)所述的用途，其中，所述rock抑制劑是y-27632。

(26)根據(jù)(20)～(25)中任一項所述的用途，其中，所述溶血磷脂是溶血磷脂酸及鞘氨醇-1-磷酸中的至少一者。

(27)一種細(xì)胞聚集體的制備方法，該方法包括：在含有具有與白蛋白結(jié)合的能力的脂質(zhì)的液體培養(yǎng)基中使細(xì)胞懸浮并進(jìn)行培養(yǎng)的工序。

(28)根據(jù)(27)所述的方法，其中，所述液體培養(yǎng)基以0.00325～0.065mg/ml含有所述脂質(zhì)。

(29)根據(jù)(27)或(28)所述的方法，其中，所述液體培養(yǎng)基含有l(wèi)-抗壞血酸和/或胰島素和/或運鐵蛋白和/或硒和/或碳酸氫鈉和/或1種以上的生長因子。

(30)根據(jù)(29)所述的方法，其中，所述液體培養(yǎng)基中含有的所述生長因子是fgf2和/或tgf-β1。

(31)根據(jù)(27)～(30)中任一項所述的方法，其中，所述細(xì)胞是多能干細(xì)胞。

(32)通過(27)～(31)中任一項所述的方法制備的細(xì)胞聚集體。

(33)一種細(xì)胞凝聚抑制劑(或細(xì)胞凝聚控制劑)，其含有具有與白蛋白結(jié)合能力的脂質(zhì)。

(34)一種具有與白蛋白結(jié)合的能力的脂質(zhì)的用途，其用于抑制(或控制)細(xì)胞的凝聚的用途。

(35)根據(jù)(33)所述的細(xì)胞凝聚抑制劑或(34)所述的用途，其中，所述脂質(zhì)以0.00325～0.065mg/ml的濃度存在。

(36)根據(jù)(33)所述的細(xì)胞凝聚抑制劑或(34)所述的用途，其中，所述脂質(zhì)與l-抗壞血酸和/或胰島素和/或運鐵蛋白和/或硒和/或碳酸氫鈉和/或1種以上的生長因子組合使用。

(37)根據(jù)(33)所述的細(xì)胞凝聚抑制劑或(34)所述的用途，其中，所述細(xì)胞是多能干細(xì)胞。

本說明書包含作為本申請優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請?zhí)?015-015306號所公開的內(nèi)容。

發(fā)明的效果

本發(fā)明的方法能夠大量生產(chǎn)適于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞聚集體，且可以大量生產(chǎn)細(xì)胞自身。

附圖說明

圖1示意性地示出了細(xì)胞聚集體的制備步驟的概述。

圖2示出了在各ksr添加濃度下，通過在非貼壁性的容器內(nèi)進(jìn)行旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)(培養(yǎng)第2天)而從人ips細(xì)胞形成的三維聚集體及其大小。％＝體積(v)/體積(v)。

圖3示出了各ksr添加濃度下，葡萄糖消耗量的經(jīng)時變化。n＝4。

圖4示出了各ksr添加濃度下，培養(yǎng)第5天的細(xì)胞數(shù)。n＝4。

圖5示出了非專利文獻(xiàn)2中公開的ksr的構(gòu)成成分。

圖6示出了添加各因子(albumax^tmii、bsa、胰島素、運鐵蛋白)時對聚集體形成的影響。％＝重量(w)/體積(v)。

圖7示出了人ips細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)時及懸浮培養(yǎng)時(聚集體)的oct4表達(dá)率。

圖8示出了使用添加了無脂質(zhì)牛血清白蛋白和各脂質(zhì)的人ips細(xì)胞懸浮液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時的顯微鏡觀察圖像。

圖9示出了使用添加了無脂質(zhì)牛血清白蛋白和各濃度lpa(溶血磷脂酸)的人ips細(xì)胞懸浮液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時的顯微鏡觀察圖像。φ表示細(xì)胞聚集體的尺寸的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)。

圖10示出了使用添加了無脂質(zhì)牛血清白蛋白和各濃度s1p(鞘氨醇-1-磷酸)的人ips細(xì)胞懸浮液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時的顯微鏡觀察圖像。φ表示細(xì)胞聚集體的尺寸的平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差)。

圖11示出了使用僅添加了無脂質(zhì)牛血清白蛋白、或者添加了各濃度的lpa或s1p的人ips細(xì)胞懸浮液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時的顯微鏡觀察圖像。

圖12示出了使用僅添加了無脂質(zhì)牛血清白蛋白、或者添加了各濃度的lpa或s1p的人ips細(xì)胞懸浮液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時的培養(yǎng)系統(tǒng)的葡萄糖消耗量的經(jīng)時變化。n＝3。

圖13示出了使用僅添加了無脂質(zhì)牛血清白蛋白、或者添加了各濃度lpa或s1p的人ips細(xì)胞懸浮液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時培養(yǎng)第5天的細(xì)胞產(chǎn)量。n＝3。

圖14示出了人ips細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)時、以及在添加了1.0μg/ml的lpa或s1p的細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時的未分化標(biāo)記物(oct4及sox2)的陽性率。

圖15示出了在進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的各培養(yǎng)規(guī)模(4ml規(guī)模、300ml規(guī)模、1.6l規(guī)模)下，接種后1天(第1天)和接種后5天或6天(第5天或第6天)的顯微鏡觀察圖像。

圖16示出了在進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的各培養(yǎng)規(guī)模(4ml規(guī)模、300ml規(guī)模、1.6l規(guī)模)下，細(xì)胞密度的經(jīng)時變化。

圖17示出了在進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的各培養(yǎng)規(guī)模(4ml規(guī)模、300ml規(guī)模、1.6l規(guī)模)下及貼壁培養(yǎng)時的未分化標(biāo)記物(oct4及sox2)的陽性率。

具體實施方式

以下，使用優(yōu)選的實施方式詳細(xì)地對本發(fā)明進(jìn)行說明。

＜1.細(xì)胞＞

用本發(fā)明的方法培養(yǎng)并形成細(xì)胞聚集體的細(xì)胞只要是具有貼壁性的細(xì)胞(貼壁細(xì)胞)即可，沒有特別限定，可以是來自于動物的細(xì)胞等，可以優(yōu)選為來自于哺乳類動物的細(xì)胞等，可以更優(yōu)選為來自于生物體組織的細(xì)胞及由來自于生物體組織的細(xì)胞所衍生出的細(xì)胞等，可以特別優(yōu)選為來自于上皮組織的細(xì)胞及由上皮組織細(xì)胞所衍生出的細(xì)胞等、或者來自于結(jié)締組織的細(xì)胞及由來自于結(jié)締組織的細(xì)胞所衍生出的細(xì)胞等、或者來自于肌肉組織的細(xì)胞及由來自于肌肉組織的細(xì)胞所衍生出的細(xì)胞等、或者來自于神經(jīng)組織的細(xì)胞及由來自于神經(jīng)組織的細(xì)胞所衍生出的細(xì)胞等，可以進(jìn)一步優(yōu)選為來自于動物的干細(xì)胞及由來自于動物的干細(xì)胞分化成的細(xì)胞等，可以更優(yōu)選為來自于動物的多能干細(xì)胞及由來自于動物的多能干細(xì)胞分化成的細(xì)胞等，可以更進(jìn)一步優(yōu)選為來自于哺乳類動物的多能干細(xì)胞及由來自于哺乳類動物的多能干細(xì)胞分化成的細(xì)胞等，可以最優(yōu)選為來自于人的多能干細(xì)胞及由來自于人的多能干細(xì)胞分化成的細(xì)胞等。

在本發(fā)明中，“多能干細(xì)胞”是指具有能夠分化為構(gòu)成生物體的所有種類的細(xì)胞的多分化能力(多能性)的細(xì)胞，是能夠在適當(dāng)條件下的體外(invitro)培養(yǎng)中以保持多能性的狀態(tài)持續(xù)無限增殖的細(xì)胞。作為多能干細(xì)胞的具體例子，可以列舉例如：胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)、作為來自于胎兒原始生殖細(xì)胞的多能干細(xì)胞的eg細(xì)胞(shamblottm.j.etal.,proc.natl.acad.sci.usa.(1998)95,p.13726-13731)、作為來自于睪丸的多能干細(xì)胞的gs細(xì)胞(conrads.,nature(2008)456,p.344-349)、作為來自于體細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的ips細(xì)胞(誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells))等，但并不限定于此。本發(fā)明中使用的多能干細(xì)胞特別優(yōu)選為es細(xì)胞或ips細(xì)胞。es細(xì)胞是來自于從在被稱為胚泡的早期胚胎的內(nèi)部存在的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)中采集的未分化細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞。ips細(xì)胞是通過在體細(xì)胞中導(dǎo)入重編程因子(reprogrammingfactors)而使體細(xì)胞重編程為未分化狀態(tài)，并賦予了多能性的培養(yǎng)細(xì)胞。作為重編程因子，可以使用例如oct3/4、klf4、sox2及c-myc(yuj,etal.science.2007；318:1917-20.)，可以使用例如oct3/4、sox2、lin28及nanog(takahashik,etal.cell.2007；131:861-72.)。這些因子導(dǎo)入細(xì)胞的方式?jīng)]有特別限定，可以列舉例如：使用了質(zhì)粒的基因?qū)搿⒑铣蓃na的導(dǎo)入、以蛋白質(zhì)的形式直接導(dǎo)入等。另外，可以使用通過使用了microrna、rna、低分子化合物等的方法制備的ips細(xì)胞。以es細(xì)胞、ips細(xì)胞為代表的多能干細(xì)胞可以使用市售品或分售的細(xì)胞，也可以使用新制備的細(xì)胞。作為ips細(xì)胞，可以使用例如253g1株、201b6株、201b7株、409b2株、454e2株、hips-riken-1a株、hips-riken-2a株、hips-riken-12a株、nips-b2株、tkdn4-m株、tkda3-1株、tkda3-2株、tkda3-4株、tkda3-5株、tkda3-9株、tkda3-20株、hipsc38-2株、msc-ipsc1株、bj-ipsc1株等。作為es細(xì)胞，可以使用例如khes-1株、khes-2株、khes-3株、khes-4株、khes-5株、sees1株、sees2株、sees3株、hues8株、cyt49株、h1株、h9株、hs-181株等。可以使用新制備的臨床級別的ips細(xì)胞或es細(xì)胞。制備ips細(xì)胞時的細(xì)胞來源沒有特別限定，可以使用例如成纖維細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等。

本發(fā)明所使用的細(xì)胞可以是來自于任意動物的細(xì)胞，例如，可以是來自于小鼠、大鼠、倉鼠等嚙齒類、人、大猩猩、黑猩猩等靈長類、以及犬、貓、兔、牛、馬、棉羊、山羊等家畜或?qū)櫸锏炔溉閯游锏募?xì)胞，特別優(yōu)選為來自于人的細(xì)胞。

在本發(fā)明中，可以使用貼壁或懸浮進(jìn)行培養(yǎng)后進(jìn)行了分離的細(xì)胞。這里，“進(jìn)行了分離的細(xì)胞”是指將多個細(xì)胞以細(xì)胞群的方式附著在一起的細(xì)胞剝離、分散后的狀態(tài)的上述細(xì)胞。分離是指將附著于培養(yǎng)容器、培養(yǎng)擔(dān)載體等的狀態(tài)的細(xì)胞或細(xì)胞彼此附著的狀態(tài)的細(xì)胞群進(jìn)行剝離、分散而形成單一細(xì)胞的工序。待分離的細(xì)胞群可以處于懸浮在液體培養(yǎng)基中的狀態(tài)。分離的方法沒有特別限定，可以優(yōu)選使用剝離劑(胰蛋白酶或膠原酶等細(xì)胞剝離酶)或edta(乙二胺四乙酸)等螯合劑或剝離劑與螯合劑的混合物等。剝離劑沒有特別限定，可以列舉：胰蛋白酶、accutase(注冊商標(biāo))、tryple^tmexpressenzyme(lifetechnologiesjapan公司)、tryple^tmselectenzyme(lifetechnologiesjapan公司)、dispase(注冊商標(biāo))、膠原酶等。分離后冷凍保存的上述細(xì)胞也可以優(yōu)選用于本發(fā)明。

＜2.細(xì)胞聚集體＞

在本發(fā)明中，細(xì)胞聚集體是指多個細(xì)胞三維凝聚而形成的塊狀體，也被稱為球狀體。本發(fā)明中制備的典型的細(xì)胞聚集體具有基本上為球形的形狀。

在本發(fā)明中，構(gòu)成細(xì)胞聚集體的細(xì)胞只要為1種以上的上述貼壁細(xì)胞即可，沒有特別限定。例如，由人多能干細(xì)胞或人胚胎干細(xì)胞等多能干細(xì)胞構(gòu)成的上述細(xì)胞聚集體包含表達(dá)了多能干細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞。作為上述多能干細(xì)胞標(biāo)記物，可以例示出：堿性磷酸酶、nanog、oct4、sox2、tra-1-60、c-myc、klf4、lin28、ssea-4、ssea-1等。在構(gòu)成上述細(xì)胞聚集體的細(xì)胞為上述多能干細(xì)胞時，表達(dá)上述多能干細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞的比例優(yōu)選為80％以上，更優(yōu)選為90％以上，更優(yōu)選為91％以上，更優(yōu)選為92％以上，更優(yōu)選為93％以上，更優(yōu)選為94％以上，更優(yōu)選為95％以上，更優(yōu)選為96％以上，更優(yōu)選為97％以上，更優(yōu)選為98％以上，更優(yōu)選為99％以上，更優(yōu)選為100％以下。

根據(jù)本發(fā)明的方法制備的細(xì)胞聚集體的尺寸沒有特別限定，用顯微鏡觀察時，觀察圖像中最寬部分的尺寸的上限優(yōu)選為1000μm，更優(yōu)選為900μm，更優(yōu)選為800μm，更優(yōu)選為700μm，進(jìn)一步優(yōu)選為600μm，更優(yōu)選為500μm，更進(jìn)一步優(yōu)選為400μm，最優(yōu)選為300μm。下限優(yōu)選為50μm，更優(yōu)選為60μm，進(jìn)一步優(yōu)選為70μm，更優(yōu)選為80μm，更進(jìn)一步優(yōu)選為90μm，最優(yōu)選為100μm。這樣的尺寸范圍的細(xì)胞聚集體易于對內(nèi)部的細(xì)胞供給氧、營養(yǎng)成分，優(yōu)選作為細(xì)胞的增殖環(huán)境。

對于根據(jù)本發(fā)明的方法制備的細(xì)胞聚集體的集群而言，在構(gòu)成該集群的細(xì)胞聚集體中，以重量基準(zhǔn)計，優(yōu)選10％以上、更優(yōu)選為20％以上、進(jìn)一步優(yōu)選為30％以上、更優(yōu)選為40％以上、更進(jìn)一步優(yōu)選為50％以上、進(jìn)一步更優(yōu)選為60％以上、進(jìn)一步更優(yōu)選為70％以上、進(jìn)一步更優(yōu)選為80％以上、最優(yōu)選為90％以上具有上述范圍的尺寸。

＜3.液體培養(yǎng)基＞

本發(fā)明所使用的液體培養(yǎng)基可以通過如下方式制備：以任意的動物細(xì)胞培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適當(dāng)添加上述脂質(zhì)及根據(jù)需要而添加的其它成分。

作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可以使用bme培養(yǎng)基、bgjb培養(yǎng)基、cmrl1066培養(yǎng)基、glasgowmem培養(yǎng)基、改良memzincoption培養(yǎng)基、imdm培養(yǎng)基(iscove’smodifieddulbecco’smedium)、medium199培養(yǎng)基、eaglemem培養(yǎng)基、αmem培養(yǎng)基、dmem培養(yǎng)基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)、ham'sf10培養(yǎng)基、ham'sf12培養(yǎng)基、rpmi1640培養(yǎng)基、fischer’s培養(yǎng)基、以及它們的混合培養(yǎng)基(例如dmem/f12培養(yǎng)基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium/nutrientmixturef-12ham))等培養(yǎng)基，沒有特別限定。作為dmem/f12培養(yǎng)基，特別使用優(yōu)選以60/40～40/60的重量比、更優(yōu)選以55/45～45/55的重量比、最優(yōu)選以等量混合有dmem培養(yǎng)基和ham'sf12培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。

本發(fā)明所使用的液體培養(yǎng)基優(yōu)選為不含有血清的培養(yǎng)基，即無血清培養(yǎng)基。

本發(fā)明所使用的液體培養(yǎng)基更優(yōu)選含有選自l-抗壞血酸、胰島素、運鐵蛋白、硒及碳酸氫鈉中的至少一者，更優(yōu)選包含上述全部。l-抗壞血酸、胰島素、運鐵蛋白、硒及碳酸氫鈉可以以溶液、衍生物、鹽或混合試劑等形式添加于培養(yǎng)基。例如，l-抗壞血酸可以以抗壞血酸-2-磷酸酯鎂等衍生物的形式添加于培養(yǎng)基。硒可以以亞硒酸鹽(亞硒酸鈉等)的形式添加于培養(yǎng)基。胰島素及運鐵蛋白可以是從動物(優(yōu)選為人、小鼠、大鼠、牛、馬、山羊等)的組織或血清等中分離得到的天然來源的物質(zhì)，也可以是基因工程制備的重組蛋白質(zhì)。胰島素、運鐵蛋白及硒可以以its試劑(胰島素-運鐵蛋白-硒)的形式添加于培養(yǎng)基。its是含有胰島素、運鐵蛋白及亞硒酸鈉的用于促進(jìn)細(xì)胞增殖的添加劑。

可以使用含有選自l-抗壞血酸、胰島素、運鐵蛋白、硒及碳酸氫鈉中的至少一者的市售的培養(yǎng)基作為本發(fā)明的液體培養(yǎng)基來使用。作為添加了胰島素及運鐵蛋白的市售的培養(yǎng)基，可以使用：cho-s-sfmii(lifetechnologiesjapan公司)、hybridoma-sfm(lifetechnologiesjapan公司)、erdfdrypowderedmedia(lifetechnologiesjapan公司)、ultraculture^tm(biowhittaker公司)、ultradoma^tm(biowhittaker公司)、ultrachotm(biowhittaker公司)、ultramdck^tm(biowhittaker公司)等。可以優(yōu)選使用stempro(注冊商標(biāo))hescsfm(lifetechnologiesjapan公司)、mtesr1(veritas公司)、tesr2(veritas公司)等。另外，也可以優(yōu)選使用用于人ips細(xì)胞、人es細(xì)胞的培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。

本發(fā)明所使用的液體培養(yǎng)基優(yōu)選含有至少一種生長因子。作為生長因子，沒有限定，優(yōu)選含有選自fgf2(堿性成纖維細(xì)胞生長因子-2)、tgf-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)、激活蛋白a(activina)、igf-1、mcp-1、il-6、pai、pedf、igfbp-2、lif及igfbp-7中的至少一者以上。特別優(yōu)選的生長因子為fgf2和/或tgf-β1。

作為本發(fā)明所使用的液體培養(yǎng)基，最優(yōu)選的培養(yǎng)基是還含有選自l-抗壞血酸、胰島素、運鐵蛋白、硒及碳酸氫鈉、以及至少一種生長因子作為作為白蛋白和/或后面敘述的脂質(zhì)以外的成分的無血清培養(yǎng)基，特別優(yōu)選為含有l(wèi)-抗壞血酸、胰島素、運鐵蛋白、硒及碳酸氫鈉、以及至少一種生長因子(優(yōu)選為fgf2及tgf-β1)、且不含有血清的dmem/f12培養(yǎng)基。作為這樣的培養(yǎng)基，可以優(yōu)選使用添加了白蛋白和/或后面敘述的脂質(zhì)的essential8^tm培養(yǎng)基(lifetechnologiesjapan公司)。essential8^tm培養(yǎng)基可以將由lifetechnologiesjapan公司銷售的dmem/f12培養(yǎng)基dmem/f-12(ham)1∶1與essential8^tm補(bǔ)充劑(包含l-抗壞血酸、胰島素、運鐵蛋白、硒、碳酸氫鈉、fgf2及tgf-β1)混合來制備。

本發(fā)明所使用的液體培養(yǎng)基也可以含有脂肪酸或脂質(zhì)、氨基酸(例如非必需氨基酸)、維生素、細(xì)胞因子、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩沖劑、無機(jī)鹽類、抗生素、激酶抑制劑等成分。

作為抗生素，可以使用青霉素、鏈霉素、兩性霉素b等。

作為激酶抑制劑，可以添加rock抑制劑。

rock抑制劑定義為抑制rho-激酶(rock，rho相關(guān)蛋白激酶)的激酶活性的物質(zhì)，可以列舉例如：y-27632(4-[(1r)-1-氨基乙基]-n-吡啶-4-基環(huán)己烷-1-甲酰胺)或其二鹽酸鹽(例如參照，ishizakietal.,mol.pharmacol.57,976-983(2000)；narumiyaetal.,methodsenzymol.325,273-284(2000))、fasudil/ha1077(1-(5-異喹啉磺?；?高哌嗪)或其二鹽酸鹽(例如參照，uenataetal.,nature389:990-994(1997))、h-1152((s)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基)磺酰基]-六氫-1h-1,4-二氮雜卓(diazepine))或其二鹽酸鹽(例如參照，sasakietal.,pharmacol.ther.93:225-232(2002))、wf-536((+)-(r)-4-(1-氨基乙基)-n-(4-吡啶基)苯甲酰胺一鹽酸鹽)(例如參照，nakajimaetal.,cancerchemother.pharmacol.52(4):319-324(2003))及它們的衍生物、以及針對rock的反義核酸、rna干擾誘導(dǎo)核酸(例如sirna)、顯性失活突變體及它們的表達(dá)載體。另外，作為rock抑制劑，還已知其它低分子化合物，因此在本發(fā)明中也可以使用這樣的化合物或它們的衍生物(例如參照：美國專利申請公開第20050209261號、美國專利申請公開第20050192304號、美國專利申請公開第20040014755號、美國專利申請公開第20040002508號、美國專利申請公開第20040002507號、美國專利申請公開第20030125344號、美國專利申請公開第20030087919號、以及國際公開第2003/062227號、國際公開第2003/059913號、國際公開第2003/062225號、國際公開第2002/076976號、國際公開第2004/039796號)。在本發(fā)明中，至少使用1種rock抑制劑。

本發(fā)明所使用的rock抑制劑優(yōu)選為下述式i所示的化合物或作為其鹽(例如，二鹽酸鹽)的y-27632。作為y-27632，可以添加水合物形態(tài)的化合物。

化學(xué)式1

式i：

液體培養(yǎng)基中的y-27632的濃度沒有特別限定，例如為80～120nm(特別是100nm)、400～600nm(特別是500nm)、600～900nm(特別是750nm)、0.8～1.2μm(特別是1μm)、1.6～2.4μm(特別是2μm)、2.4～3.6μm(特別是3μm)、3.2～4.8μm(特別是4μm)、4～6μm(特別是5μm)、4.8～7.2μm(特別是6μm)、μm(特別是7μm)、6.4～9.6μm(特別是8μm)、7.2～10.8μm(特別是9μm)、8～12μm(特別是10μm)、12～18μm(特別是15μm)、16～24μm(特別是20μm)、20～30μm(特別是25μm)、24～36μm(特別是30μm)、32～48μm(特別是40μm)、或者40～60μm(特別是50μm)、更優(yōu)選為8～12μm(特別是10μm)。

＜4.脂質(zhì)＞

在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明所使用的脂質(zhì)可以是具有與白蛋白結(jié)合的能力的脂質(zhì)。在本欄＜4.脂質(zhì)＞中，在沒有特別說明時，“脂質(zhì)”是指具有與白蛋白結(jié)合的能力的脂質(zhì)。作為具體的脂質(zhì)，可以列舉下述形態(tài)的脂質(zhì)：與血清白蛋白等蛋白質(zhì)形成了復(fù)合體的脂質(zhì)、從血清白蛋白中分離的脂質(zhì)、通過微生物、化學(xué)合成等生產(chǎn)且具有與白蛋白結(jié)合的能力的脂質(zhì)等。需要說明的是，“與白蛋白的結(jié)合能力”是指能夠借助化學(xué)性鍵合和/或物理性結(jié)合與白蛋白形成復(fù)合體的性質(zhì)。

脂質(zhì)的來源動物沒有特別限定，可以是小鼠、大鼠、倉鼠等嚙齒類、人、大猩猩、黑猩猩等靈長類、犬、貓、兔、牛、馬、棉羊、山羊、豬等家畜或?qū)櫸锏炔溉閯游?，?yōu)選為牛或人。優(yōu)選為來自于與培養(yǎng)的細(xì)胞相同種類的生物的脂質(zhì)。另外，脂質(zhì)還可以是人工合成的脂質(zhì)。

脂質(zhì)可以以含有其的血清的形式添加入液體培養(yǎng)基中。另外，可以以包含脂質(zhì)的血清白蛋白(含脂質(zhì)的血清白蛋白)的形式添加入液體培養(yǎng)基中。作為含脂質(zhì)的血清白蛋白，可以使用脂質(zhì)與血清白蛋白的蛋白質(zhì)形成了復(fù)合體的物質(zhì)。在含脂質(zhì)的血清白蛋白當(dāng)中，特別優(yōu)選提高了脂質(zhì)含有率的形態(tài)的含脂質(zhì)的血清白蛋白。作為該含脂質(zhì)的血清白蛋白，可以列舉市售的albumax^tm，具體可以列舉：albumax^tmi或albumax^tmii(均為lifetechnologiesjapan公司)。

脂質(zhì)只要是來自于血清的脂質(zhì)、或者能夠與血清白蛋白結(jié)合的脂質(zhì)即可，沒有特別限定，可以隨來源生物而改變，可以是游離脂肪酸、磷脂(甘油磷脂、鞘磷脂、溶血磷脂酰膽堿等)、中性脂肪、膽固醇等。脂質(zhì)例如可以包含選自溶血磷脂酰膽堿、三酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酸、膽固醇及鞘磷脂中的至少一種，更優(yōu)選包含上述全部。以脂質(zhì)的總重量為基準(zhǔn)，進(jìn)一步優(yōu)選本發(fā)明所使用的脂質(zhì)至少包含20～80重量％(更優(yōu)選為40～70重量％)的游離脂肪酸、5～50重量％(更優(yōu)選為10～30重量％)的溶血磷脂酰膽堿、5～45重量％(更優(yōu)選為10～30重量％)的三酰甘油、以及2～25重量％(更優(yōu)選為5～15重量％)的卵磷脂，優(yōu)選還包含選自1～10重量％(更優(yōu)選為1～6重量％)的磷脂酸、0.1～3重量％(更優(yōu)選為0.5～2重量％)的膽固醇及0.1～3重量％(更優(yōu)選為0.5～2重量％)的鞘磷脂中的至少一者。在本發(fā)明的方法中可以優(yōu)選使用含有這樣組成的脂質(zhì)的含脂質(zhì)的血清白蛋白。需要說明的是，根據(jù)非專利文獻(xiàn)2，以脂質(zhì)的總重量為基準(zhǔn)，albumax^tmii包含約54重量％的游離脂肪酸、約17重量％的溶血磷脂酰膽堿、約15重量％的三酰甘油、約8重量％的卵磷脂、約3重量％的磷脂酸、約1重量％的膽固醇及約1重量％的鞘磷脂。

從血清白蛋白中分離出的上述脂質(zhì)也可以優(yōu)選用于本發(fā)明。從上述血清白蛋白中分離上述脂質(zhì)的方法沒有特別限定，可以舉出：對與脂質(zhì)形成了復(fù)合體的血清白蛋白實施胰蛋白酶處理等蛋白質(zhì)分解處理，然后對脂質(zhì)進(jìn)行回收的方法。分離得到的脂質(zhì)可以以實質(zhì)上保持了血清白蛋白所包含的脂質(zhì)組成的狀態(tài)直接用于本發(fā)明，也可以對一部分脂質(zhì)進(jìn)行富集來使用。

對于脂質(zhì)而言，在作為血清代替物而市售的試劑中含有的情況下，可以作為該試劑中包含的一種成分而添加于液體培養(yǎng)基中使用。血清代替物(serumreplacement)是指在es細(xì)胞、ips細(xì)胞的培養(yǎng)中，作為血清(fbs等)的代替品，用于保持細(xì)胞的未分化狀態(tài)并進(jìn)行培養(yǎng)的試劑，可以列舉例如：knockout^tmsr(knockout^tmserumreplacement(ksr)；lifetechnologiesjapan公司)、stemsure(注冊商標(biāo))serumreplacement(ssr；和光純藥工業(yè))、n2補(bǔ)充劑(和光純藥工業(yè))等。上述ksr中包含albumax^tm，具體來說包含albumax^tmi或albumax^tmii。

通常，血清中含有的白蛋白濃度約為50mg/ml，可以容易地想到ksr中也含有同樣濃度的血清白蛋白。根據(jù)非專利文獻(xiàn)2，ksr中含有的血清白蛋白為albumax^tm，另外如非專利文獻(xiàn)2所述，100mg的albumax^tm中含有的脂質(zhì)為0.65mg，因此，例如在含有最終濃度1％(體積/體積)的ksr的液體培養(yǎng)基中，含有0.5mg/ml的albumax^tm，即以0.00325mg/ml的濃度含有脂質(zhì)。例如，在含有最終濃度2mg/ml的albumax^tm的液體培養(yǎng)基中，含有0.013mg/ml的脂質(zhì)。因此，本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)所使用的液體培養(yǎng)基中的脂質(zhì)含量沒有特別限定，可以設(shè)為0.00325～0.065mg/ml，可以優(yōu)選設(shè)為0.00325～0.0325mg/ml，可以更優(yōu)選設(shè)為0.00325～0.01625mg/ml，可以進(jìn)一步優(yōu)選為0.00325～0.013mg/ml。脂質(zhì)的濃度可以采用通過適當(dāng)?shù)姆治龇椒?例如，使用了液相色譜、氣相色譜等設(shè)備的分析方法)求出的濃度。

脂質(zhì)可以以未與白蛋白結(jié)合的狀態(tài)存在于液體培養(yǎng)基中?？梢詫⒎謩e準(zhǔn)備的脂質(zhì)和白蛋白添加于液體培養(yǎng)基，添加的白蛋白的來源沒有特別限定，例如，優(yōu)選來自于人或牛的白蛋白。即，在本發(fā)明的方法的一個實施方式中，可以包括以未與白蛋白結(jié)合的狀態(tài)添加上述脂質(zhì)來制備液體培養(yǎng)基的工序。另外，也可以使用無脂質(zhì)的血清白蛋白。還可以使用通過基因重組技術(shù)在大腸桿菌、動物細(xì)胞中表達(dá)、制備的白蛋白。也可以添加作為白蛋白代替物的蛋白質(zhì)、添加物，例如兩親性物質(zhì)(表面活性劑等)。

＜5.溶血磷脂(lysophospholipid)＞

本發(fā)明的其它實施方式中，使用的脂質(zhì)為溶血磷脂。

溶血磷脂是具有一個脂肪族基(例如，一個中鏈或長鏈脂肪族基)的磷脂的總稱。作為溶血磷脂，可以具有甘油骨架，也可以具有鞘氨醇骨架。作為上述溶血磷脂，可以列舉：溶血磷脂酸(lpa)、鞘氨醇-1-磷酸(s1p)、溶血磷脂酰膽堿(lpc)、溶血磷脂酰絲氨酸(lps)、溶血磷脂酰肌醇(lpi)、溶血磷脂酰甘油(lpg)、溶血磷脂酰蘇氨酸(lpt)、溶血磷脂酰乙醇胺(lpe)等，可以是多種溶血磷脂的混合物。這些溶血磷脂可以是鹽等任意形態(tài)。作為上述溶血磷脂，優(yōu)選為lpc以外的溶血磷脂，更優(yōu)選lpa、s1p等具有無取代的磷酸基作為極性頭部基團(tuán)的溶血磷脂。在上述溶血磷脂含有?；鶗r，酰基的碳原子數(shù)、不飽和度沒有特別限定，可以是與來源生物對應(yīng)的碳原子數(shù)、不飽和度，典型的?；奶荚訑?shù)為16～24，不飽和度為0～6的范圍。更優(yōu)選碳原子數(shù)∶不飽和度為16∶0、16∶1、18∶0、18∶1、18∶2、18∶3、20∶0、20∶1、20∶2、20∶3、20∶4、20∶5、22∶0、22∶1、22∶2、22∶3、22∶4、22∶5、或者22∶6的?；Ａ硗?，具有甘油骨架的溶血磷脂可以是1-酰基型溶血磷脂及2-?；腿苎字娜我徽?，優(yōu)選為1-?；腿苎字?/p>

上述溶血磷脂的來源生物可以從與＜4.脂質(zhì)＞中說明的來源生物相同的范圍中進(jìn)行選擇。另外，上述溶血磷脂還可以是人工制備的。

上述溶血磷脂可以以含有其的組合物的形式添加于液體培養(yǎng)基中。作為上述組合物，可以例示出溶血磷脂與蛋白質(zhì)的混合物等。

上述溶血磷脂可以以未與蛋白質(zhì)結(jié)合的形態(tài)用于培養(yǎng)。特別是作為用于制備液體培養(yǎng)基的原料，如果使用不是與蛋白質(zhì)的混合物的形態(tài)的上述溶血磷脂、優(yōu)選使用實質(zhì)上純化后的形態(tài)的上述溶血磷脂，則可容易地將上述溶血磷脂的添加量調(diào)節(jié)至優(yōu)選范圍，因此優(yōu)選。這樣的溶血磷脂可以從來源生物中分離，也可以人工制備。

上述溶血磷脂在懸浮培養(yǎng)開始時的液體培養(yǎng)基中的濃度可以適當(dāng)調(diào)整，例如為0.00128μg/ml以上，優(yōu)選為0.0064μg/ml以上，優(yōu)選大于0.0064μg/ml，優(yōu)選為0.032μg/ml以上，優(yōu)選為0.064μg/ml以上，優(yōu)選為0.16μg/ml以上，優(yōu)選為0.2μg/ml以上，優(yōu)選為0.3μg/ml以上，優(yōu)選為0.4μg/ml以上，優(yōu)選為0.5μg/ml以上，在這樣的情況下，能夠適度抑制細(xì)胞的凝聚而形成基本均勻大小的細(xì)胞聚集體，例如為1000μg/ml以下，優(yōu)選為200μg/ml以下，優(yōu)選為150μg/ml以下，更優(yōu)選為100μg/ml以下，更優(yōu)選為90μg/ml以下，更優(yōu)選為80μg/ml以下，更優(yōu)選為70μg/ml以下，更優(yōu)選為60μg/ml以下，更優(yōu)選為50μg/ml以下，更優(yōu)選為40μg/ml以下，更優(yōu)選為30μg/ml以下，更優(yōu)選為20μg/ml以下，更優(yōu)選為10μg/ml以下，更優(yōu)選為9μg/ml以下，更優(yōu)選為8μg/ml以下，更優(yōu)選為7μg/ml以下，更優(yōu)選為6μg/ml以下，更優(yōu)選為5μg/ml以下，更優(yōu)選為4μg/ml以下，更優(yōu)選為3μg/ml以下，更優(yōu)選為2μg/ml以下，更優(yōu)選為1μg/ml以下，更優(yōu)選為0.9μg/ml以下，更優(yōu)選為0.8μg/ml以下，更優(yōu)選為0.7μg/ml以下，更優(yōu)選為0.6μg/ml以下，在這樣的情況下，能夠形成上述的適當(dāng)尺寸的球狀細(xì)胞聚集體。在液體培養(yǎng)基中添加多種成分作為溶血磷脂時，優(yōu)選將各溶血磷脂的濃度設(shè)定為上述范圍，更優(yōu)選將溶血磷脂的總濃度設(shè)定為上述范圍。需要說明的是，上述的溶血磷脂的量是指在制備液體培養(yǎng)基時添加的溶血磷脂的量(其中，在如后面敘述那樣在液體培養(yǎng)基中通過酶反應(yīng)生成溶血磷脂時，也包含該反應(yīng)中生成的溶血磷脂的量)，不包含培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的溶血磷脂。上述溶血磷脂的濃度可以采用通過適當(dāng)?shù)姆治龇椒?例如使用了液相色譜、氣相色譜等設(shè)備的分析方法)求出的濃度。更優(yōu)選使將溶血磷脂換算為2s-氨基-1-(二氫磷酸酯)-4e-十八碳烯-1,3r-二醇(分子量379.5)時的重量濃度為上述的范圍。

在上述溶血磷脂為溶血磷脂酸的情況下，可以適當(dāng)調(diào)整懸浮培養(yǎng)開始時的液體培養(yǎng)基中的溶血磷脂酸的濃度，例如為0.00128μg/ml以上或0.00279μm以上，優(yōu)選為0.0064μg/ml以上或0.0140μm以上，優(yōu)選大于0.0064μg/ml或大于0.0140μm，優(yōu)選為0.032μg/ml以上或0.0698μm以上，優(yōu)選為0.064μg/ml以上或0.140μm以上，優(yōu)選為0.16μg/ml以上或0.349μm以上，優(yōu)選為0.2μg/ml以上或0.436μm以上，優(yōu)選為0.3μg/ml以上或0.654μm以上，優(yōu)選為0.4μg/ml以上或0.872μm以上，優(yōu)選為0.5μg/ml以上或1.09μm以上，在該情況下，能夠適度抑制細(xì)胞的凝聚而形成基本均勻大小的細(xì)胞聚集體，例如為1000μg/ml以下或2180μm以下，優(yōu)選為200μg/ml以下或436μm以下，優(yōu)選為150μg/ml以下或327μm以下，更優(yōu)選為100μg/ml以下或218μm以下，更優(yōu)選為90μg/ml以下或196μm以下，更優(yōu)選為80μg/ml以下或174μm以下，更優(yōu)選為70μg/ml以下或153μm以下，更優(yōu)選為60μg/ml以下或131μm以下，更優(yōu)選為50μg/ml以下或109μm以下，更優(yōu)選為40μg/ml以下或87.2μm以下，更優(yōu)選為30μg/ml以下或65.4μm以下，更優(yōu)選為20μg/ml以下或43.6μm以下，更優(yōu)選為10μg/ml以下或21.8μm以下，更優(yōu)選為9μg/ml以下或19.6μm以下，更優(yōu)選為8μg/ml以下或17.4μm以下，更優(yōu)選為7μg/ml以下或15.3μm以下，更優(yōu)選為6μg/ml以下或13.1μm以下，更優(yōu)選為5μg/ml以下或10.9μm以下，更優(yōu)選為4μg/ml以下或8.72μm以下，更優(yōu)選為3μg/ml以下或6.54μm以下，更優(yōu)選為2μg/ml以下或4.36μm以下，更優(yōu)選為1μg/ml以下或2.18μm以下，更優(yōu)選為0.9μg/ml以下或1.96μm以下，更優(yōu)選為0.8μg/ml以下或1.74μm以下，更優(yōu)選為0.7μg/ml以下或1.53μm以下，更優(yōu)選為0.6μg/ml以下或1.31μm以下，在該情況下，能夠形成上述的適當(dāng)尺寸的球狀細(xì)胞聚集體。需要說明的是，上述的溶血磷脂酸的量是指制備液體培養(yǎng)基時添加的溶血磷脂酸的量(其中，在如后面敘述那樣在液體培養(yǎng)基中通過酶反應(yīng)生成溶血磷脂酸時，也包含該反應(yīng)中生成的溶血磷脂酸的量)，不包含培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的溶血磷脂酸。上述的溶血磷脂酸的重量濃度優(yōu)選為換算成鈉鹽(1-o-9z-十八碳烯酰-sn-甘油基-3-磷酸，鈉鹽；分子量458.5)的重量濃度。

在上述溶血磷脂為鞘氨醇-1-磷酸的情況下，可以適當(dāng)調(diào)整懸浮培養(yǎng)開始時的液體培養(yǎng)基中的鞘氨醇-1-磷酸的濃度，例如為0.00128μg/ml以上或0.00337μm以上，優(yōu)選為0.0064μg/ml以上或0.0169μm以上，優(yōu)選大于0.0064μg/ml或大于0.0169μm，優(yōu)選為0.032μg/ml以上或0.0843μm以上，優(yōu)選為0.064μg/ml以上或0.169μm以上，優(yōu)選為0.16μg/ml以上或0.422μm以上，優(yōu)選為0.2μg/ml以上或0.527μm以上，優(yōu)選為0.3μg/ml以上或0.791μm以上，優(yōu)選為0.4μg/ml以上或1.05μm以上，優(yōu)選為0.5μg/ml以上或1.32μm以上，在該情況下，能夠適度抑制細(xì)胞的凝聚而形成基本均勻大小的細(xì)胞聚集體，例如為1000μg/ml以下或2640μm以下，優(yōu)選為200μg/ml以下或527μm以下，優(yōu)選為150μg/ml以下或395μm以下，更優(yōu)選為100μg/ml以下或264μm以下，更優(yōu)選為90μg/ml以下或237μm以下，更優(yōu)選為80μg/ml以下或211μm以下，更優(yōu)選為70μg/ml以下或184μm以下，更優(yōu)選為60μg/ml以下或158μm以下，更優(yōu)選為50μg/ml以下或132μm以下，更優(yōu)選為40μg/ml以下或105μm以下，更優(yōu)選為30μg/ml以下或79.1μm以下，更優(yōu)選為20μg/ml以下或52.7μm以下，更優(yōu)選為10μg/ml以下或26.4μm以下，更優(yōu)選為9μg/ml以下或23.7μm以下，更優(yōu)選為8μg/ml以下或21.1μm以下，更優(yōu)選為7μg/ml以下或18.4μm以下，更優(yōu)選為6μg/ml以下或15.8μm以下，更優(yōu)選為5μg/ml以下或13.2μm以下，更優(yōu)選為4μg/ml以下或10.5μm以下，更優(yōu)選為3μg/ml以下或7.91μm以下，更優(yōu)選為2μg/ml以下或5.27μm以下，更優(yōu)選為1μg/ml以下或2.64μm以下，更優(yōu)選為0.9μg/ml以下或2.37μm以下，更優(yōu)選為0.8μg/ml以下或2.11μm以下，更優(yōu)選為0.7μg/ml以下或1.84μm以下，更優(yōu)選為0.6μg/ml以下或1.58μm以下，在該情況下，能夠形成上述的適當(dāng)尺寸的球狀細(xì)胞聚集體。需要說明的是，上述的鞘氨醇-1-磷酸的量是指制備液體培養(yǎng)基時添加的鞘氨醇-1-磷酸的量(其中，在如后面敘述那樣在液體培養(yǎng)基中通過酶反應(yīng)生成鞘氨醇-1-磷酸時，也包含該反應(yīng)中生成的鞘氨醇-1-磷酸的量)，不包含培養(yǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的鞘氨醇-1-磷酸。上述的鞘氨醇-1-磷酸的重量濃度是指優(yōu)選換算成游離體(2s-氨基-1-(二氫磷酸酯)-4e-十八碳烯-1,3r-二醇；分子量379.5)的重量濃度。

可以混合多種上述溶血磷脂使用?；旌媳嚷蕸]有特別限定，例如，lpa∶s1p以重量比計為1∶1～80000或1～80000∶1，具體而言，可以以下述比例使用：1∶0.5～1.5(例如1∶1)、1∶2.5～7.5(例如1∶5)、1∶13～38(例如1∶25)、1∶63～190(例如1∶125)、1∶78～230(例如1∶156.25)、1∶310～940(例如1∶625)、1∶1600～4700(例如1∶3125)、1∶7800～23000(例如1∶15625)、1∶39000～120000(例如1∶78125)、2.5～7.5∶1(例如5∶1)、13～38∶1(例如25∶1)、63～190∶1(例如125∶1)、78～230∶1(例如156.25∶1)、78～230∶5(例如156.25∶5)、78～230∶25(例如156.25∶25)、78～230∶125(例如156.25∶125)、310～940∶1(例如625∶1)、310～940∶156.25(例如625∶156.25)、1600～4700∶1(例如3125∶1)、1600～4700∶156.25(例如3125∶156.25)、7800～23000∶1(例如15625∶1)、7800～23000∶156.25(例如15625∶156.25)、39000～120000∶1(例如78125∶1)、39000～120000∶156.25(例如78125∶156.25)。上述重量比優(yōu)選為將lpa換算為鈉鹽(1-o-9z-十八碳烯酰-sn-甘油基-3-磷酸，鈉鹽；分子量458.5)、將s1p換算為游離體(2s-氨基-1-(二氫磷酸酯)-4e-十八碳烯-1,3r-二醇；分子量379.5)的重量比。

作為上述溶血磷脂，除了溶血磷脂酸(lpa)和鞘氨醇-1-磷酸(s1p)以外，也可以以上述濃度或上述混合比率使用溶血磷脂酰膽堿(lpc)、溶血磷脂酰絲氨酸(lps)、溶血磷脂酰肌醇(lpi)、溶血磷脂酰甘油(lpg)、溶血磷脂酰蘇氨酸(lpt)、溶血磷脂酰乙醇胺(lpe)。

在本發(fā)明的方法中還可以包括通過酶反應(yīng)由脂質(zhì)生成上述溶血磷脂的工序。作為上述酶反應(yīng)，可以例示出水解酶反應(yīng)、激酶反應(yīng)等。

作為上述水解酶反應(yīng)，可以列舉以上述磷脂作為底物的基于水解酶的水解反應(yīng)。本發(fā)明所使用的上述水解酶沒有特別限定，優(yōu)選為磷脂酶及溶血磷脂酶。上述磷脂酶及上述溶血磷脂酶沒有特別限定，優(yōu)選為磷脂酶a1、磷脂酶a2、溶血磷脂酶d(autotaxin)。磷脂酶a1是對甘油磷脂的sn-1位的酯鍵進(jìn)行水解的酶。磷脂酶a2是對甘油磷脂的sn-2位的酯鍵進(jìn)行水解的酶。autotaxin是對磷脂或溶血磷脂中磷酸基上與取代基的磷酸酯鍵進(jìn)行水解，生成無取代的磷酸基作為極性頭部基團(tuán)的水解酶，例如，可以水解lpc生成lpa和膽堿。在本發(fā)明中，作為溶血磷脂，可以優(yōu)選使用以甘油磷脂作為底物通過基于磷脂酶a1或磷脂酶a2及autotaxin的反應(yīng)而得到的水解物(lpa等)。在本發(fā)明中，可以優(yōu)選使用將lpc、lps、lpi、lpg、lpt、lpe等通過上述autotaxin處理而得到的水解產(chǎn)物(lpa等)。

在本發(fā)明中，可以優(yōu)選使用由上述鞘磷脂制備的s1p等作為溶血磷脂。制備方法沒有特別限定，例如，可以優(yōu)選使用通過鞘激酶(sphingokinase)等激酶對鞘氨醇進(jìn)行磷酸化而得到的磷酸化產(chǎn)物(s1p等)作為溶血磷脂。

在本發(fā)明的方法中，還可以還包括添加上述溶血磷脂而制備液體培養(yǎng)基的工序。此時，以未與蛋白質(zhì)結(jié)合的形態(tài)添加上述溶血磷脂可易于調(diào)節(jié)上述溶血磷脂的添加量，因此優(yōu)選。

在本發(fā)明中，可以優(yōu)選使用細(xì)胞凝聚抑制試劑盒，所述細(xì)胞凝聚抑制試劑盒含有上述溶血磷脂(優(yōu)選包含lpa或s1p中的任一者)、或上述脂質(zhì)的水解產(chǎn)物、或上述脂質(zhì)和上述水解酶的混合物、或上述鞘磷脂和上述激酶的混合物等、或含有這些物質(zhì)中任一種的液體培養(yǎng)基等。

＜6.細(xì)胞凝聚抑制劑＞

本發(fā)明的細(xì)胞凝聚抑制劑含有上述脂質(zhì)，且可以用于在懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中適度抑制細(xì)胞的凝聚而形成基本均勻大小的細(xì)胞聚集體。

本發(fā)明的細(xì)胞凝聚抑制劑的形態(tài)沒有特別限定，可以是上述脂質(zhì)自身，也可以是上述脂質(zhì)與其它成分組合而成的組合物。上述組合物的形態(tài)沒有特別限定。上述組合物例如可以是用于懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基，也可以是制備液體培養(yǎng)基時所配合的添加用組合物。

本發(fā)明的細(xì)胞凝聚抑制劑的優(yōu)選實施方式是以上述濃度或上述比率含有上述溶血磷脂的上述液體培養(yǎng)基或磷酸緩沖液等緩沖液。

本發(fā)明的細(xì)胞凝聚抑制劑的另一優(yōu)選實施方式是在液狀培養(yǎng)基中含有上述溶血磷脂的液態(tài)組合物。上述液態(tài)組合物是在制備懸浮培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基時添加的添加物。上述液態(tài)組合物優(yōu)選以待制備的液體培養(yǎng)基中的上述溶血磷脂的最終濃度為上述濃度的方式進(jìn)行制備，與上述細(xì)胞混合前的上述液態(tài)組合物中的上述溶血磷脂的濃度沒有特別限定，優(yōu)選為上述溶血磷脂的、作為懸浮培養(yǎng)時的優(yōu)選濃度而列舉的上述濃度的1倍以上，更優(yōu)選為10倍以上，更優(yōu)選為100倍以上，更優(yōu)選為1000倍以上，更優(yōu)選為10000倍以上。

對于細(xì)胞凝聚抑制劑而言，作為添加劑，可以含有酶(特別是水解酶、激酶)、抗生素、激酶抑制劑、緩沖劑、增稠劑、著色劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、乳化劑、防腐劑、保存劑、抗氧化劑等。酶沒有特別限定，可以使用水解酶、激酶等，上述水解酶、激酶如上所述?？股貨]有特別限定，可以使用例如青霉素、鏈霉素、兩性霉素b等。激酶抑制劑沒有特別限定，優(yōu)選為rock抑制劑。rock抑制劑沒有特別限定，優(yōu)選為上述y-27632。本發(fā)明的細(xì)胞凝聚抑制劑優(yōu)選含有rock抑制劑，并使其相對于液體培養(yǎng)基的最終濃度為上述濃度，最優(yōu)選含有rock抑制劑，并使其相對于液體培養(yǎng)基的最終濃度為10μm。作為緩沖劑，可以列舉：磷酸緩沖液、tris-鹽酸緩沖液、甘氨酸緩沖液等。作為增稠劑，可以列舉：明膠、多糖類等。作為著色劑，可以舉出酚紅等。作為穩(wěn)定劑，可以列舉：白蛋白、葡聚糖、甲基纖維素、明膠等。作為表面活性劑，可以列舉：膽固醇、烷基糖苷、烷基多糖苷、烷基單甘油基醚、糖苷、麥芽糖苷、新戊二醇類、聚氧乙烯二醇類、硫代糖苷、硫代麥芽糖苷、肽、皂苷、磷脂、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、脂肪酸二乙醇胺等。作為乳化劑，可以列舉：甘油脂肪酸酯、脫水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等。作為防腐劑，可以列舉：氨基乙基磺酸、苯甲酸、苯甲酸鈉、乙醇、依地酸鈉、瓊脂、dl-樟腦、檸檬酸、檸檬酸鈉、水楊酸、水楊酸鈉、水楊酸苯酯、二丁基羥基甲苯、山梨酸、山梨鉀、氮氣、脫氫乙酸、脫氫乙酸鈉、2-萘酚、白糖、蜂蜜、對羥基苯甲酸異丁酯(paraoxyisobutylbenzoate)、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸甲酯、l-薄荷醇、桉樹油等。作為保存劑(preservingagent)，可以列舉：苯甲酸、苯甲鈉、乙醇、依地酸鈉、干燥亞硫酸鈉、檸檬酸、甘油、水楊酸、水楊酸鈉、二丁基羥基甲苯、d-山梨糖醇、山梨酸、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、對羥基苯甲酸異丁酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸甲酯、丙二醇、磷酸等。作為抗氧化劑，可以列舉：檸檬酸、檸檬酸衍生物、維生素c及其衍生物、番茄紅素、維生素a、類胡蘿卜素類、維生素b及其衍生物、類黃酮類、多酚類、谷胱甘肽、硒、硫代硫酸鈉、維生素e及其衍生物、α-硫辛酸及其衍生物、碧蘿芷(pycnogenol)、flavangenol(フラバンジェノール)、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶、以及它們的混合物等。

細(xì)胞凝聚抑制劑可以含有生長因子，優(yōu)選至少含有fgf2或tgf-β1中的任一者。

＜7.懸浮培養(yǎng)＞

在本發(fā)明中，通過在上述液體培養(yǎng)基中使細(xì)胞懸浮進(jìn)行培養(yǎng)來形成細(xì)胞聚集體。在本發(fā)明中，優(yōu)選在假如液體培養(yǎng)基中不存在本發(fā)明所給定的脂質(zhì)的情況下細(xì)胞就會形成超過上述優(yōu)選尺寸的細(xì)胞聚集體的條件下，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)容器優(yōu)選為細(xì)胞對容器內(nèi)面的貼壁性低的容器。作為這樣的細(xì)胞對容器內(nèi)面的貼壁性低的容器，可以列舉例如：用具有生物體適應(yīng)性的物質(zhì)進(jìn)行了親水性表面處理的板。例如，可以使用nunclon^tmsphera(thermofisherscientific公司)，但沒有特別限定。

培養(yǎng)容器的形狀沒有特別限定，可以列舉例如：盤狀、燒瓶狀、孔狀、袋狀、懸浮培養(yǎng)瓶狀等形狀的培養(yǎng)容器。

懸浮培養(yǎng)可以是靜置培養(yǎng)，也可以是在液體培養(yǎng)基流動的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)，優(yōu)選為在液體培養(yǎng)基流動的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)。作為在液體培養(yǎng)基流動的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)，優(yōu)選以促進(jìn)細(xì)胞凝聚的方式在液體培養(yǎng)基流動的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)。作為以促進(jìn)細(xì)胞凝聚的方式在液體培養(yǎng)基流動的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)，可以列舉例如：以通過基于旋轉(zhuǎn)流、搖動流等流動的應(yīng)力(離心力、向心力)使細(xì)胞集中于一點的方式使液體培養(yǎng)基流動的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)、在通過線性往復(fù)運動使液體培養(yǎng)基流動的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)，特別優(yōu)選利用了旋轉(zhuǎn)流和/或搖動流的培養(yǎng)。

在旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)(振蕩培養(yǎng))中，優(yōu)選使容納液體培養(yǎng)基和細(xì)胞的培養(yǎng)容器基本上沿著水平面畫出圓、橢圓、扁平圓、扁平橢圓等封閉軌道進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)速度沒有特別限定，上限可以優(yōu)選為200rpm，更優(yōu)選為150rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為120rpm，更優(yōu)選為115rpm，更優(yōu)選為110rpm，更優(yōu)選為105rpm，更優(yōu)選為100rpm，更優(yōu)選為95rpm，特別優(yōu)選為90rpm。下限可以優(yōu)選為1rpm，更優(yōu)選為10rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為50rpm，更優(yōu)選為60rpm，更優(yōu)選為70rpm，進(jìn)一步優(yōu)選為80rpm，更優(yōu)選為90rpm。旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)時的旋轉(zhuǎn)幅度沒有特別限定，下限例如可以為1mm，優(yōu)選為10mm，更優(yōu)選為20mm，最優(yōu)選為25mm。旋轉(zhuǎn)幅度的上限例可以為200mm，優(yōu)選為100mm，優(yōu)選為50mm，更優(yōu)選為30mm，最優(yōu)選為25mm。旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)時的旋轉(zhuǎn)半徑也沒有特別限定，優(yōu)選設(shè)定得使旋轉(zhuǎn)幅度為上述范圍。旋轉(zhuǎn)半徑的下限例如可以為5mm，優(yōu)選為10mm，上限例如可以為100mm，優(yōu)選為50mm。通過將旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)的條件設(shè)為該范圍，可以容易地制造適當(dāng)尺寸的細(xì)胞聚集體，因此優(yōu)選。

搖擺培養(yǎng)(rockingculture)是通過搖擺(rocking)攪拌使液體培養(yǎng)基流動而進(jìn)行的培養(yǎng)。搖擺培養(yǎng)通過使容納液體培養(yǎng)基和細(xì)胞的培養(yǎng)容器基本上在與水平面垂直的平面內(nèi)搖擺來進(jìn)行。搖擺速度沒有特別限定，例如可以以1分鐘2～50次、優(yōu)選為4～25次(將一次往返作為1次)進(jìn)行搖擺。搖擺角度沒有特別限定，例如可以為0.1°～20°，更優(yōu)選為2°～10°。通過將搖擺培養(yǎng)的條件設(shè)為該范圍，可以制造適當(dāng)尺寸的細(xì)胞聚集體，因此優(yōu)選。

還可以通過組合了上述旋轉(zhuǎn)搖動與搖擺的運動而在攪拌的同時進(jìn)行培養(yǎng)。

使用了懸浮培養(yǎng)瓶狀培養(yǎng)容器的培養(yǎng)是在培養(yǎng)容器中使用攪拌槳對液體培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌的培養(yǎng)。轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基量沒有特別限定。如果是市售的懸浮培養(yǎng)瓶狀培養(yǎng)容器，可以優(yōu)選使用廠商推薦的培養(yǎng)液量。轉(zhuǎn)速可以為例如10rpm以上且100rpm以下，但沒有特別限定。

在懸浮培養(yǎng)中，可以適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中的接種密度(懸浮培養(yǎng)開始時的細(xì)胞密度)，作為下限，例如為0.01×10⁵個細(xì)胞/ml，更優(yōu)選為0.1×10⁵個細(xì)胞/ml，更優(yōu)選為1×10⁵個細(xì)胞/ml。作為接種密度的上限，例如為20×10⁵個細(xì)胞/ml，更優(yōu)選為10×10⁵個細(xì)胞/ml。接種密度在該范圍時，容易形成適當(dāng)大小的細(xì)胞聚集體。

懸浮培養(yǎng)時的培養(yǎng)液量可以根據(jù)使用的培養(yǎng)容器來適當(dāng)調(diào)整，例如，在使用12孔板(俯視時每1孔的孔底面積為3.5cm²)時，可以為0.5ml/孔以上、且1.5ml/孔以下，更優(yōu)選為1ml/孔。例如，在使用6孔板(俯視時每1孔的孔底面積為9.6cm²)時，可以為1.5ml/孔以上，優(yōu)選為2ml/孔以上，更優(yōu)選為3ml/孔以上，可以為6.0ml/孔以下，優(yōu)選為5ml/孔以下，更優(yōu)選為4ml/孔以下。例如，在使用125ml三角燒瓶(容量為125ml的三角燒瓶)時，可以為10ml/容器以上，優(yōu)選為15ml/容器以上，更優(yōu)選為20ml/容器以上，更優(yōu)選為25ml/容器以上，更優(yōu)選為20ml/容器以上，更優(yōu)選為25ml/容器以上，更優(yōu)選為30ml/容器以上，可以為50ml/容器以下，更優(yōu)選為45ml/容器以下，更優(yōu)選為40ml/容器以下。例如，在使用500ml三角燒瓶(容量為500ml的三角燒瓶)時，可以為100ml/容器以上，優(yōu)選為105ml/容器以上，更優(yōu)選為110ml/容器以上，更優(yōu)選為115ml/容器以上，更優(yōu)選為120ml/容器以上，可以為150ml/容器以下，更優(yōu)選為145ml/容器以下，更優(yōu)選為140ml/容器以下，更優(yōu)選為135ml/容器以下，更優(yōu)選為130ml/容器以下，更優(yōu)選為125ml/容器以下。例如，在使用1000ml三角燒瓶(容量為1000ml的三角燒瓶)時，可以為250ml/容器以上，優(yōu)選為260ml/容器以上，更優(yōu)選為270ml/容器以上，更優(yōu)選為280ml/容器以上，更優(yōu)選為290ml/容器以上，可以為350ml/容器以下，更優(yōu)選為340ml/容器以下，更優(yōu)選為330ml/容器以下，更優(yōu)選為320ml/容器以下，更優(yōu)選為310ml/容器以下。例如，在使用2000ml三角燒瓶(容量為2000ml的三角燒瓶)時，可以為500ml/容器以上，更優(yōu)選為550ml/容器以上，更優(yōu)選為600ml/容器以上，可以為1000ml/容器以下，更優(yōu)選為900ml/容器以下，更優(yōu)選為800ml/容器以下，更優(yōu)選為700ml/容器以下。例如，在使用3000ml三角燒瓶(容量為3000ml的三角燒瓶)時，可以為1000ml/容器以上，優(yōu)選為1100ml/容器以上，更優(yōu)選為1200ml/容器以上，更優(yōu)選為1300ml/容器以上，更優(yōu)選為1400ml/容器以上，更優(yōu)選為1500ml/容器以上，可以為2000ml/容器以下，更優(yōu)選為1900ml/容器以下，更優(yōu)選為1800ml/容器以下，更優(yōu)選為1700ml/容器以下，更優(yōu)選為1600ml/容器以下。例如，在使用2l培養(yǎng)袋(容量為2l的一次性培養(yǎng)袋)時，可以為100ml/袋以上，更優(yōu)選為200ml/袋以上，更優(yōu)選為300ml/袋以上，更優(yōu)選為400ml/袋以上，更優(yōu)選為500ml/袋以上，更優(yōu)選為600ml/袋以上，更優(yōu)選為700ml/袋以上，更優(yōu)選為800ml/袋以上，更優(yōu)選為900ml/袋以上，更優(yōu)選為1000ml/袋以上，可以為2000ml/袋以下，更優(yōu)選為1900ml/袋以下，更優(yōu)選為1800ml/袋以下，更優(yōu)選為1700ml/袋以下，更優(yōu)選為1600ml/袋以下，更優(yōu)選為1500ml/袋以下，更優(yōu)選為1400ml/袋以下，更優(yōu)選為1300ml/袋以下，更優(yōu)選為1200ml/袋以下，更優(yōu)選為1100ml/袋以下。例如，在使用10l培養(yǎng)袋(容量為10l的一次性培養(yǎng)袋)時，可以為500ml/袋以上，更優(yōu)選為1l/袋以上，更優(yōu)選為2l/袋以上，更優(yōu)選為3l/袋以上，更優(yōu)選為4l/袋以上，更優(yōu)選為5l/袋以上，可以為10l/袋以下，更優(yōu)選為9l/袋以下，更優(yōu)選為8l/袋以下，更優(yōu)選為7l/袋以下，更優(yōu)選為6l/袋以下。例如，在使用20l培養(yǎng)袋(容量為20l的一次性培養(yǎng)袋)時，可以為1l/袋以上，更優(yōu)選為2l/袋以上，更優(yōu)選為3l/袋以上，更優(yōu)選為4l/袋以上，更優(yōu)選為5l/袋以上，更優(yōu)選為6l/袋以上，更優(yōu)選為7l/袋以上，更優(yōu)選為8l/袋以上，更優(yōu)選為9l/袋以上，更優(yōu)選為10l/袋以上，可以為20l/袋以下，更優(yōu)選為19l/袋以下，更優(yōu)選為18l/袋以下，更優(yōu)選為17l/袋以下，更優(yōu)選為16l/袋以下，更優(yōu)選為15l/袋以下，更優(yōu)選為14l/袋以下，更優(yōu)選為13l/袋以下，更優(yōu)選為12l/袋以下，更優(yōu)選為11l/袋以下。例如，在使用50l培養(yǎng)袋(容量為50l的一次性培養(yǎng)袋)時，可以為1l/袋以上，更優(yōu)選為2l/袋以上，更優(yōu)選為5l/袋以上，更優(yōu)選為10l/袋以上，更優(yōu)選為15l/袋以上，更優(yōu)選為20l/袋以上，更優(yōu)選為25l/袋以上，可以為50l/袋以下，更優(yōu)選為45l/袋以下，更優(yōu)選為40l/袋以下，更優(yōu)選為35l/袋以下，更優(yōu)選為30l/袋以下。培養(yǎng)液量為該范圍時，容易形成適當(dāng)大小的細(xì)胞聚集體。

使用的培養(yǎng)容器的容量可以適當(dāng)選擇，沒有特別限定，以俯視容納液體培養(yǎng)基的部分的底面時的面積計，可以使用下限例如為0.32cm²、優(yōu)選為0.65cm²、更優(yōu)選為0.65cm²、進(jìn)一步優(yōu)選為1.9cm²、更優(yōu)選為3.0cm²、3.5cm²、9.0cm²或9.6cm²的培養(yǎng)容器，作為上限，例如可以使用1000cm²、優(yōu)選為500cm²、更優(yōu)選為300cm²、更優(yōu)選為150cm²、更優(yōu)選為75cm²、更優(yōu)選為55cm²、進(jìn)一步優(yōu)選為25cm²、進(jìn)一步更優(yōu)選為21cm²、進(jìn)一步更優(yōu)選為9.6cm²或3.5cm²的培養(yǎng)容器。

上述脂質(zhì)存在下的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的溫度、時間、co2濃度等條件沒有特別限定。培養(yǎng)溫度優(yōu)選為20℃以上，更優(yōu)選為35℃以上，優(yōu)選為45℃以下，更優(yōu)選為40℃以下，最優(yōu)選為37℃。培養(yǎng)時間優(yōu)選為0.5小時以上，更優(yōu)選為12小時以上，優(yōu)選為7天以下，更優(yōu)選為72小時以下，更優(yōu)選為48小時以下，最優(yōu)選為24小時以下。作為培養(yǎng)時的co2濃度，優(yōu)選為4％以上，更優(yōu)選為4.5％以上，優(yōu)選為10％以下，更優(yōu)選為5.5％以下，最優(yōu)選為5％。懸浮培養(yǎng)可以伴隨進(jìn)行傳代。培養(yǎng)條件為該范圍時，容易形成適當(dāng)大小的細(xì)胞聚集體。

懸浮培養(yǎng)所使用的細(xì)胞可以預(yù)先通過通常方法進(jìn)行保持培養(yǎng)。保持培養(yǎng)可以是使細(xì)胞貼壁于容器、擔(dān)載體等培養(yǎng)基材進(jìn)行培養(yǎng)的貼壁培養(yǎng)，也可以是使細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的懸浮培養(yǎng)。進(jìn)行了保持培養(yǎng)的細(xì)胞用上述的剝離劑從培養(yǎng)基材上剝離或使細(xì)胞彼此剝離，充分使其分散后用于懸浮培養(yǎng)。為了使細(xì)胞分散，可以使其通過過濾器而使其分散為單細(xì)胞。

可以對通過上述脂質(zhì)存在下的懸浮培養(yǎng)而形成的細(xì)胞聚集體進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)。作為細(xì)胞聚集體的進(jìn)一步的培養(yǎng)方法，可以列舉在不含上述激酶抑制劑的液體培養(yǎng)基中使細(xì)胞聚集體懸浮而進(jìn)行培養(yǎng)的方法。作為進(jìn)一步培養(yǎng)所使用的液體培養(yǎng)基，可以使用除了不含有上述激酶抑制劑以外與上述相同的液體培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)的條件，可以使用與上述實質(zhì)上相同的條件。在該進(jìn)一步的培養(yǎng)中，優(yōu)選以適當(dāng)?shù)念l率進(jìn)行培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)基更換的頻率隨細(xì)胞種類而不同，可以包括優(yōu)選以5天一次以上、更優(yōu)選以4天一次以上、進(jìn)一步優(yōu)選以3天一次以上、更優(yōu)選以2天一次以上、最優(yōu)選以1天一次以上的頻率進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作。在培養(yǎng)本發(fā)明所使用的多能干細(xì)胞的細(xì)胞聚集體時，特別優(yōu)選該頻率的培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)基更換的方法沒有特別限定，可以優(yōu)選通過如下方式對細(xì)胞聚集體進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)：將全部量的含有細(xì)胞聚集體的培養(yǎng)液回收于離心管，進(jìn)行離心分離或以靜置狀態(tài)放置5分鐘左右，保留沉淀的細(xì)胞聚集體而除去上清液，然后添加新鮮的液體培養(yǎng)基，使細(xì)胞聚集體平穩(wěn)地分散后再次將細(xì)胞聚集體分散液體培養(yǎng)基返回到板等培養(yǎng)容器中。進(jìn)一步培養(yǎng)的培養(yǎng)時間沒有特別限定，優(yōu)選為3天～7天。

本發(fā)明中的“添加上述溶血磷脂制備上述液體培養(yǎng)基的工序”是指在上述液體培養(yǎng)基中添加上述溶血磷脂使其達(dá)到上述濃度或上述比率。可以在將上述溶血磷脂添加于上述液體培養(yǎng)基后混合上述分離的細(xì)胞，也可以將上述分離的細(xì)胞混合于上述液體培養(yǎng)基中后添加上述溶血磷脂，優(yōu)選將上述溶血磷脂添加于上述液體培養(yǎng)基后混合上述分離的細(xì)胞。將上述溶血磷脂添加于上述液體培養(yǎng)基時，可以添加穩(wěn)定劑。上述穩(wěn)定劑只要是有助于上述溶血磷脂在液體培養(yǎng)基中的穩(wěn)定化、活性保持、防止對培養(yǎng)容器等的吸附等的物質(zhì)即可，沒有特別限定，可以使用白蛋白等蛋白質(zhì)、乳化劑、表面活性劑、兩親性物質(zhì)或肝素等多糖類等?！疤砑由鲜鋈苎字苽渖鲜鲆后w培養(yǎng)基的工序”可以包括對添加了上述溶血磷脂的上述液體培養(yǎng)基(可以含有上述穩(wěn)定劑)進(jìn)行冷凍的工序、以及解凍的工序。

實施例

通過以下的實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)地進(jìn)行說明，但這些僅是示例，對本發(fā)明沒有任何限定。

圖1示意性地示出了下述實施例中細(xì)胞聚集體的制備步驟的概述。對人ips細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，回收并分離細(xì)胞后，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，接著進(jìn)行聚集體培養(yǎng)。在以下的說明中，開始懸浮培養(yǎng)的第一天作為“第0天(day0)”，將第二天以后分別作為“第1天(day1)”、“第2天(day2)”、“第3天(day3)”、“第4天(day4)”、“第5天(day5)”。懸浮培養(yǎng)進(jìn)行至第2天，接著進(jìn)行了3天(即，從開始懸浮培養(yǎng)至第5天)的聚集體培養(yǎng)。

＜實施例1.人ips細(xì)胞的保持培養(yǎng)＞

人ips細(xì)胞使用了tkdn4-m株(非專利文獻(xiàn)1)。將人ips細(xì)胞接種于涂敷了matrigel(corning公司)或vitronectin(lifetechnologiesjapan公司)的細(xì)胞培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)基使用mtesr1(stemcelltechnologies公司)或essential8^tm(lifetechnologiesjapan公司)進(jìn)行保持培養(yǎng)。作為傳代時的細(xì)胞剝離劑，在matrigel上進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，使用trypleselect(lifetechnologiesjapan公司)，在vitronectin上進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，使用0.02％edta(乙二胺四乙酸)溶液或accutase(lifetechnologiesjapan公司)。另外，僅在細(xì)胞接種時向培養(yǎng)基添加y-27632(和光純藥工業(yè)株式會社)并使其達(dá)到10μm的濃度。每天進(jìn)行培養(yǎng)基更換。實驗中使用了傳代數(shù)至50次為止的人ips細(xì)胞。

＜實施例2.人ips細(xì)胞的聚集體形成＞

用trypleselect或edta溶液對人ips細(xì)胞進(jìn)行3～5分鐘處理來進(jìn)行剝離，分散至單細(xì)胞后，使其通過40μm孔徑細(xì)胞過濾器(becton,dickinsonandcompany)。將該細(xì)胞懸浮于包含最終濃度10μm的y-27632(和光純藥工業(yè)株式會社)的essential8^tm培養(yǎng)基，將其一部分進(jìn)行錐蟲藍(lán)染色并調(diào)查了細(xì)胞數(shù)。制備每1ml包含2×10⁵個細(xì)胞后，以多個不同的濃度添加knockout^tmserumreplacement(ksr；lifetechnologiesjapan公司)。以1ml/孔的比例將該細(xì)胞懸浮液接種于低貼壁12孔板(nunc公司)。接種了細(xì)胞的板在旋轉(zhuǎn)振蕩器(optima公司)上以90rpm的速度沿水平面進(jìn)行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，使其畫出旋轉(zhuǎn)幅度(直徑)為25mm圓，在5％co2、37℃的環(huán)境下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，直至第2天。開始培養(yǎng)第2天用顯微鏡獲取圖像。

接著，將培養(yǎng)基更換為不含有上述ksr(脂質(zhì))及y-27632的essential8^tm培養(yǎng)基，繼續(xù)在相同條件下進(jìn)行了3天(從上述懸浮培養(yǎng)開始至第5天)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。這期間，每天進(jìn)行培養(yǎng)基更換。作為更換培養(yǎng)基的方法，將全部量的含有細(xì)胞聚集體的培養(yǎng)基回收至離心管，使其靜置5分鐘左右，使細(xì)胞聚集體沉淀。然后，除去上清液，添加新鮮的培養(yǎng)基，使細(xì)胞聚集體平穩(wěn)地再懸浮，再次接種于低貼壁12孔板。

從培養(yǎng)開始起第5天(聚集體培養(yǎng)第3天)拍攝細(xì)胞聚集體的顯微鏡照片，通過圖像分析軟件(例如imagej)分析聚集體的大小，測定了聚集體的直徑。培養(yǎng)后，將聚集體懸浮于trypleselect(lifetechnologiesjapan公司)，在5％co2、37℃的環(huán)境下處理10分鐘，使用微量移液器使聚集體分散為單細(xì)胞，通過錐蟲藍(lán)染色調(diào)查了細(xì)胞數(shù)。

上述的顯微鏡觀察的結(jié)果是確認(rèn)了：在未添加ksr的條件下形生了大的聚集體，但通過添加ksr，形成了具有約70～260μm直徑的多個聚集體(圖2)。ksr的添加濃度越高，聚集體的大小越小，可知由于ksr所含有的某種成分，具有抑制細(xì)胞凝聚的效果。另外，對于形成的聚集體，調(diào)查了各ksr濃度下葡萄糖消耗量與第5天的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果(圖3及圖4、均為n＝4)是ksr濃度為1～10％(v/v)(換算為脂質(zhì)的含量時為0.00325～0.0325mg/ml)時，細(xì)胞顯著增殖，由此可以確認(rèn)，通過形成具有100μm～260μm直徑的細(xì)胞聚集體，能夠進(jìn)行高效的細(xì)胞培養(yǎng)。另一方面可知，過度地抑制細(xì)胞凝聚時，細(xì)胞增殖也受到抑制。

＜實施例3.ksr中含有的具有抑制凝聚作用的成分＞

作為ksr的構(gòu)成成分，已報告了如圖5所示的成分(非專利文獻(xiàn)2)。

在這些構(gòu)成成分當(dāng)中，對于被認(rèn)為具有顯示出抑制凝聚效果的可能性的蛋白質(zhì)性各構(gòu)成成分(albumax^tm、bsa、胰島素、運鐵蛋白)，調(diào)查了通過添加是否具有人ips細(xì)胞的抑制凝聚作用。

具體進(jìn)行了如下操作：添加多個不同濃度的富含脂質(zhì)的白蛋白albumax^tmii(lifetechnologiesjapan公司)、普通的牛血清白蛋白(bsa；sigma公司)、胰島素(sigma公司)或運鐵蛋白(sigma公司)來代替實施例2中的ksr，除此以外，按照與實施例2相同的步驟進(jìn)行了人ips細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(各因子存在下的懸浮培養(yǎng)進(jìn)行2天，接著在更換培養(yǎng)基后進(jìn)行懸浮培養(yǎng)3天)。在添加albumax^tmii條件及添加bsa條件下開始培養(yǎng)，在第2天通過顯微鏡獲取圖像，在添加胰島素條件及添加運鐵蛋白條件下開始培養(yǎng)，在第1天通過顯微鏡獲取圖像。實施例3中添加的各因子的濃度以示出每100ml液體培養(yǎng)基的重量(單位g)的％(w/v)來表示。

其結(jié)果是確認(rèn)了：在不含脂質(zhì)的胰島素及運鐵蛋白的情況下，生成了大聚集體，與以0.2％(w/v)添加bsa時相比，以0.2％(w/v)添加脂質(zhì)含量多的albumax^tmii時(換算為脂質(zhì)的含量時為0.013mg/ml)凝聚明顯受到抑制。由此可知，可以通過albumax^tmii中含有的脂質(zhì)、即具有與白蛋白結(jié)合的能力的脂質(zhì)來抑制凝聚(圖6)。

＜實施例4.形成了聚集體的人ips細(xì)胞的未分化性＞

在實施例3中，利用accutase(lifetechnologiesjapan公司)將在含有albumax^tmii0.2％(w/v)的條件下形成的來自于人ips細(xì)胞的聚集體分散，用pbs(磷酸鹽緩沖生理鹽水)清洗。然后，用4％pfa(多聚甲醛)在室溫下固定20分鐘，然后用pbs清洗3次，用冷甲醇在-20℃下進(jìn)行透化處理過夜。用pbs清洗3次后，用3％fbs(胎牛血清)/pbs封閉，通過熒光標(biāo)記過的抗oct4抗體(cat.no.653703、biolegend公司)在4℃下染色1小時。用3％fbs(胎牛血清)/pbs清洗1次后，用facsverse(becton,dickinsonandcompany)對通過了細(xì)胞過濾器的細(xì)胞進(jìn)行分析。其結(jié)果與常規(guī)貼壁培養(yǎng)時的人ips細(xì)胞相同，在聚集體的人ips細(xì)胞中，96％以上的細(xì)胞表達(dá)了未分化標(biāo)記物oct4，可以確認(rèn)形成聚集體的人ips細(xì)胞保持了未分化性(圖7)。

＜實施例5.基于磷脂的細(xì)胞凝聚抑制效果＞

分析了使用磷脂對細(xì)胞聚集體形成造成的影響。

(步驟)

將按照實施例1的步驟培養(yǎng)的人ips細(xì)胞用trypleselect或edta溶液或accutase進(jìn)行3～5分鐘處理，進(jìn)行剝離，分散至單細(xì)胞，然后使其通過40μm孔徑細(xì)胞過濾器(becton,dickinsonandcompany)，使其分散為單細(xì)胞。將該細(xì)胞懸浮于含有最終濃度10μm的y-27632(和光純藥工業(yè)株式會社)的essential8^tm培養(yǎng)基，對其一部分進(jìn)行錐蟲藍(lán)染色，調(diào)查了細(xì)胞數(shù)。制備成每1ml含有2×10⁵個細(xì)胞。向該細(xì)胞懸浮液中添加無脂質(zhì)牛血清白蛋白(bsa-ff；culturesure白蛋白、和光純藥)使其最終濃度為5mg/ml，并且添加y-27632(和光純藥工業(yè)株式會社)使其最終濃度10μm，再添加下述脂質(zhì)，在與實施例2相同的條件下進(jìn)行1天旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行了人ips細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)。在該1天懸浮培養(yǎng)后，用顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察。

本試驗所使用的脂質(zhì)或添加劑如下所述：

·lpa(溶血磷脂酸)(1-o-9z-十八碳烯酰-sn-甘油基-3-磷酸，鈉鹽、cat.no.62215、cayman公司、sn-1位具有油基)

·s1p(鞘氨醇-1-磷酸)(2s-氨基-1-(二氫磷酸酯)-4e-十八碳烯-1,3r-二醇，cat.no.62570、cayman公司)

在上述人ips細(xì)胞懸浮液中添加lpa為0.2μg/ml、s1p為0.2μg/ml。

作為對照試驗，除了未添加上述脂質(zhì)以外，在使用了與上述同樣制備的細(xì)胞懸浮液的條件下進(jìn)行了試驗。

(結(jié)果)

將上述懸浮培養(yǎng)后的顯微鏡觀察圖像示于圖8。觀察的結(jié)果是可以確認(rèn)：雖然在對照試驗中形成了大聚集體(直徑為1mm以上)，但在含有l(wèi)pa(溶血磷脂酸)或s1p(鞘氨醇-1-磷酸)0.2μg/ml的細(xì)胞懸浮液中，可形成約100μm直徑的多個基本上均勻大小的球狀細(xì)胞聚集體。

＜實施例6.lpa及s1p的添加濃度與聚集體的大小＞

對于實施例5確認(rèn)了細(xì)胞凝聚抑制能力的lpa及s1p，使用含有不同添加濃度的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行了懸浮培養(yǎng)。

(lpa濃度)

人ips細(xì)胞懸浮液按照與實施例5相同的步驟制備，lpa的添加濃度以上述鈉鹽計為0.00128μg/ml、0.0064μg/ml、0.032μg/ml、0.16μg/ml、0.8μg/ml、4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml，分別添加了最終濃度為5mg/ml的bsa-ff，再添加了最終濃度為10μm的y-27632(和光純藥工業(yè)株式會社)。在與實施例5相同的條件下懸浮培養(yǎng)1天，使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

將觀察結(jié)果示于圖9。細(xì)胞聚集體的大小根據(jù)lpa濃度而變化。0.16～100μg/ml的lpa濃度時，形成了基本均勻大小的細(xì)胞聚集體。0.032μg/ml以下的lpa濃度時，形成了直徑1mm以上的大細(xì)胞聚集體。

在lpa濃度為0.16～100μg/ml的觀察圖像中對30個細(xì)胞聚集體進(jìn)行觀察，以顯微鏡相片的比例尺進(jìn)行比較，求出各細(xì)胞聚集體最寬部分的寬度(設(shè)為“φ”)，計算出平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

lpa濃度為0.16μg/ml時，φ＝124.9±26.5μm；lpa濃度為0.8μg/ml時，φ＝68.2±9.8μm；lpa濃度為4μg/ml時，φ＝57.2±8.7μm；lpa濃度為20μg/ml時，φ＝39.9±8.0μm；lpa濃度為100μg/ml時，φ＝41.6±9.9μm。

(s1p濃度)

人ips細(xì)胞懸浮液按照與實施例5相同的步驟制備，s1p的添加濃度以上述游離體計為0.00128μg/ml、0.0064μg/ml、0.032μg/ml、0.16μg/ml、0.8μg/ml、4μg/ml、20μg/ml、100μg/ml，分別添加了最終濃度為5mg/ml的bsa-ff，再添加了最終濃度為10μm的y-27632(和光純藥工業(yè)株式會社)。在與實施例5相同的條件下懸浮培養(yǎng)1天，使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

將觀察結(jié)果示于圖10。細(xì)胞聚集體的大小根據(jù)s1p濃度而變化。0.032～100μg/ml的s1p濃度時，形成了基本均勻大小的細(xì)胞聚集體。0.0064μg/ml以下的s1p濃度時，形成了直徑1mm以上的大細(xì)胞聚集體。

s1p濃度為0.032～100μg/ml的觀察圖像中對30個細(xì)胞聚集體進(jìn)行觀察，以顯微鏡相片的比例尺進(jìn)行比較，求出各細(xì)胞聚集體最寬部分的寬度(設(shè)為“φ”)，計算出平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

s1p濃度為0.16μg/ml時，φ＝142.4±16.4μm；s1p濃度為0.8μg/ml時，φ＝118.5±21.8μm；s1p濃度為4μg/ml時，φ＝109.9±23.1μm；s1p濃度為20μg/ml時，φ＝94.0±19.4μm；s1p濃度為100μg/ml時，φ＝89.0±19.5μm。

＜實施例7.lpa或s1p存在條件下對細(xì)胞增殖能力、未分化能力的影響＞

在以不同濃度含有l(wèi)pa或s1p的培養(yǎng)存在條件下進(jìn)行人ips細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，測定葡萄糖消耗量、細(xì)胞產(chǎn)量、未分化標(biāo)記物的陽性率，分析這些添加物對細(xì)胞造成的影響。

(方法)

人ips細(xì)胞懸浮液按照與實施例5相同的步驟制備，添加了最終濃度為0.2μg/ml或1μg/ml的lpa或s1p、最終濃度為5mg/ml的bsa-ff及最終濃度為10μm的y-27632(和光純藥工業(yè)株式會社)。作為對照，按照與實施例5相同的步驟制備，制備了僅添加有最終濃度為5mg/ml的bsa-ff及最終濃度為10μm的y-27632的細(xì)胞懸浮液。

在與實施例5相同的培養(yǎng)條件下對上述細(xì)胞懸浮液進(jìn)行2天的懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)2天后，用添加了5mg/ml的bsa-ff的essential8^tm培養(yǎng)基進(jìn)行每天培養(yǎng)基的更換。測定培養(yǎng)第2天、第3天、第4天、第5天培養(yǎng)上清液中的葡萄糖濃度，計算出葡萄糖消耗量。另外，在培養(yǎng)第5天回收細(xì)胞聚集體，用accutase分散，懸浮于添加了5mg/ml的bsa-ff的essential8^tm培養(yǎng)基。將該細(xì)胞懸浮液的一部分進(jìn)行錐蟲藍(lán)染色，調(diào)查了細(xì)胞數(shù)。以300g對上述細(xì)胞懸浮液進(jìn)行5分鐘離心分離，然后去除上清液，用pbs(磷酸緩沖生理鹽水)清洗細(xì)胞。然后，用4％pfa(多聚甲醛)在室溫下固定20分鐘，然后用pbs清洗3次，用冷甲醇在-20℃下進(jìn)行透化處理過夜。用pbs清洗3次后，用3％fbs(胎牛血清)/pbs封閉，通過熒光標(biāo)記過的抗sox2抗體(cat.no.656110、biolegend公司)及熒光標(biāo)記抗oct4抗體(cat.no.653703、biolegend社)在4℃下染色1小時。用3％fbs(胎牛血清)/pbs清洗1次后，用facsverse對通過了細(xì)胞過濾器的細(xì)胞進(jìn)行分析。

葡萄糖消耗量的側(cè)定按照下述步驟進(jìn)行。即，在培養(yǎng)基更換時采集培養(yǎng)上清液，用ysi公司制造的生物分析儀(ysi2950)測定殘留葡萄糖量，計算出葡萄糖消耗量。

在培養(yǎng)第5天測定了細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞產(chǎn)量的測定按照下述步驟進(jìn)行。即，用trypleselect對形成的細(xì)胞聚集體進(jìn)行5～10分鐘處理，通過用藍(lán)色移液器吸頭的移液操作使細(xì)胞單獨分散，進(jìn)行錐蟲藍(lán)染色后，血細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)，測定了細(xì)胞產(chǎn)量。

(結(jié)果)

圖11的相片是培養(yǎng)開始后第2天觀察的顯微鏡相片。在添加了lpa及s1p的試驗中形成了適度大小(直徑500μm以下)的細(xì)胞聚集體，相比之下，在僅添加了bsa-ff的試驗中形成了大細(xì)胞聚集體(直徑1mm以上)。

分別將葡萄糖消耗量的測定結(jié)果示于圖12，將培養(yǎng)第5天的細(xì)胞產(chǎn)量示于圖13?？芍?，與僅添加了bsa-ff的情況相比，在添加了lpa或s1p的情況下，葡萄糖消耗量及細(xì)胞數(shù)多，細(xì)胞顯著增殖。

將未分化標(biāo)記物的陽性率的測定結(jié)果示于圖14。在含有1μg/ml的lpa或s1p的細(xì)胞懸浮液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的情況下，與單層貼壁培養(yǎng)時同樣地95％以上的細(xì)胞表達(dá)了未分化標(biāo)記物oct4及sox2，確認(rèn)了通過添加脂質(zhì)而形成的人ips細(xì)胞的聚集體保持了未分化性。

＜實施例8.傳代及擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模的探討＞

按照與實施例5相同的步驟制備人ips細(xì)胞懸浮液，添加最終濃度5mg/ml的albumax^tmii、最終濃度5mg/ml的bsa-ff及最終濃度10μm的y-27632，以培養(yǎng)基量為每1孔4ml、細(xì)胞密度為每1ml2×10⁵個的方式接種于6孔板(sumitomobakelite公司)，在旋轉(zhuǎn)振蕩器(optima公司)上于90rpm的旋轉(zhuǎn)速度、5％co2、37℃的環(huán)境下培養(yǎng)2天，形成聚集體。然后，用含有最終濃度0.5mg/ml的albumax^tmii及最終濃度5mg/ml的bsa-ff的essential8^tm培養(yǎng)基每天更換培養(yǎng)基，進(jìn)行4天。接種細(xì)胞6天后按照下述的方法進(jìn)行傳代操作?；厥占?xì)胞聚集體，用pbs清洗1次，然后用accutase在37℃下處理10分鐘，將細(xì)胞分散后，添加了含有最終濃度5mg/ml的bsa-ff的essential8^tm培養(yǎng)基。以300g離心分離3分鐘，除去上清液后，與上述同樣地制備人ips細(xì)胞懸浮液(添加最終濃度5mg/ml的albumax^tmii、最終濃度5mg/ml的bsa-ff及最終濃度10μm的y-27632)，以培養(yǎng)基量為每個容器300ml、細(xì)胞密度為每1ml2×10⁵個的方式接種于1l三角燒瓶(corning公司、產(chǎn)品編號431147)，與上述6孔板同樣地進(jìn)行培養(yǎng)。接種5天后，與上述同樣地制備人ips細(xì)胞懸浮液(添加最終濃度5mg/ml的albumax^tmii、最終濃度5mg/ml的bsa-ff及最終濃度10μm的y-27632)，以培養(yǎng)基量為每個容器1.6l、細(xì)胞密度為每1ml2×10⁵個的方式接種于3l三角燒瓶(corning公司、產(chǎn)品編號431252)并傳代，將旋轉(zhuǎn)速度設(shè)為70rpm，通過與上述實質(zhì)上相同的方法進(jìn)行培養(yǎng)操作。在各容量(4ml規(guī)模、300ml規(guī)模、1.6l規(guī)模)的培養(yǎng)中，在接種后1天和5天或6天拍攝了細(xì)胞聚集體的顯微鏡相片，而且在培養(yǎng)最后一天用與實施例2相同的方法調(diào)查了細(xì)胞數(shù)，用與實施例7相同的方法分析了未分化標(biāo)記物的陽性率。作為對照，使用了通過實施例1的方法進(jìn)行了貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞。

上述的顯微鏡觀察的結(jié)果是確認(rèn)了：無論培養(yǎng)規(guī)模如何，均能同樣地形成基本均勻大小的細(xì)胞聚集體，可以以保持未分化性的狀態(tài)進(jìn)行增殖(圖15、16、17)。

通過引用將本說明書所引用的全部出版物、專利及專利申請的全部內(nèi)容并入本說明書。