相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2015年1月16日提交的新加坡申請第10201500366v號的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容以引用的方式全部并入本文中以用于所有目的。

本發(fā)明涉及從干細胞分化巨噬細胞。具體來說，本發(fā)明涉及一種用于從干細胞分化原始巨噬細胞的無血清、無飼養(yǎng)層細胞且無胚狀體的方法。

背景技術(shù)：

巨噬細胞是單核吞噬細胞，其在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和免疫力中起關(guān)鍵作用，但也造成廣泛范圍的病理且因此代表關(guān)鍵的治療標靶。然而，在對于從人多能干細胞分化原始巨噬細胞的深入研究中，其體內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及其在組織特異性情形中的指定活性目前是缺乏的。

根據(jù)單核吞噬細胞系統(tǒng)(mps)概念，組織常駐型巨噬細胞的穩(wěn)態(tài)依賴于血液單核細胞的恒定募集。然而，雖然單核細胞在病理環(huán)境和炎癥中明確產(chǎn)生巨噬細胞，但是最新證據(jù)顯示(1)單核細胞在穩(wěn)態(tài)下和在某些類型的炎癥中并不顯著產(chǎn)生特定的組織巨噬細胞，和(2)一些成人組織巨噬細胞例如腦小膠質(zhì)細胞是衍生自被稱作原始巨噬細胞的胚胎原始前體，其在出生前就植根在組織中并且通過自我更新在成人體內(nèi)自我維持。

基于這個證據(jù)，需要對體外巨噬細胞的胚胎原始起源進行重述以便設計出靶向單核細胞和巨噬細胞的新穎臨床策略。在這方面，用于人細胞的造血分化的絕大多數(shù)的現(xiàn)有方法都利用使用基質(zhì)層的共培養(yǎng)，或胚狀體(eb)。許多這些方案依賴于使用不明確的牛血清補充劑。這些條件將固有水平的可變性引入到人細胞的造血分化方案中，這會影響再現(xiàn)性和產(chǎn)率。因此，需要提供一種造血分化方法，其克服或至少改善以上描述的一或多個缺點，從而重述體外巨噬細胞的胚胎起源。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一方面，提供了一種用于從干細胞培養(yǎng)類原始巨噬細胞的方法，其中所述方法包括：

(a)將所述干細胞與包括gsk3抑制劑的無血清培養(yǎng)基接觸并孵育以誘導所述干細胞分化成中胚層譜系的細胞；

(b)將所述中胚層譜系的細胞與包括dkk1的培養(yǎng)基接觸并孵育以使所述中胚層譜系的細胞分化成造血細胞譜系的細胞；

(c)使所述造血細胞譜系的細胞成熟；

(d)將所述造血細胞譜系的成熟細胞與包括m-csf的培養(yǎng)基接觸并孵育以促使所述造血細胞分化成類原始巨噬細胞。

在一方面，提供了一種用于如本文所定義的方法中的試劑盒，其包括gsk3抑制劑和dkk1以及使用說明書。

在一方面，提供了一種通過本文所述的方法獲得的類原始巨噬細胞。

在一方面，提供了本文所述的類原始巨噬細胞用于開發(fā)體外疾病模型的用途，其中所述疾病是神經(jīng)變性疾病、代謝疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、結(jié)締組織疾病、癌癥或炎性疾病。

在一方面，提供了本文所述的小膠質(zhì)細胞用于開發(fā)體外疾病模型的用途，其中所述疾病是神經(jīng)變性疾病。

在一方面，提供了本文所述的類原始巨噬細胞用于篩選供治療疾病用的化合物的用途，其中所述疾病是神經(jīng)變性疾病或代謝疾病。

在一方面，提供了本文所述的小膠質(zhì)細胞用于篩選供治療疾病用的化合物的用途，其中所述疾病是神經(jīng)變性疾病。

在一方面，提供了本文所述的類原始巨噬細胞用于制造用在傷口愈合和組織再生中的藥物的用途。

在一方面，提供了本文所述的類原始巨噬細胞用于將載運分子(cargomolecule)遞送到組織中的用途，其中所述載運分子是免疫調(diào)節(jié)性細胞因子或趨化因子，或活化前藥的酶。

在一方面，提供了一種用于從鼠干細胞培養(yǎng)類原始巨噬細胞的方法，其中所述方法包括：

(a)將所述干細胞與包括fgf2和bmp4的無血清培養(yǎng)基接觸并孵育以誘導所述干細胞分化成中胚層譜系的細胞；

(b)將所述中胚層譜系的細胞與包括fgf2、bmp4、激活素a(activina)和vegf的培養(yǎng)基接觸并孵育以使所述中胚層譜系的細胞分化成造血細胞譜系的細胞；

(c)使所述造血細胞譜系的細胞成熟；

(d)將所述造血細胞譜系的成熟細胞與包括m-csf的培養(yǎng)基接觸并孵育以促使所述造血細胞分化成類原始巨噬細胞。

附圖說明

當結(jié)合非限制性實施例和附圖考慮時，參考具體實施方式將更好地理解本發(fā)明，其中：

圖1顯示本發(fā)明方法的流程圖。

圖2顯示用于添加本發(fā)明方法中所用的生長因子的時間表。

圖3顯示從a)h1es細胞、b)患者來源的wtipsc和c)患者來源的突變型ipsc分化的巨噬細胞的流式細胞術(shù)分析：依次對細胞的fsc/ssc譜、然后活細胞(dapi-)、然后造血細胞(cd45+)且然后單峰(ssc-a和ssc-w門)設門。顯示常見巨噬細胞標志物的表達譜：cd14、hla-dr、cd11b和cd163。從h1es細胞、患者來源的wtipsc和患者來源的突變型ipsc分化的巨噬細胞是cd14+、hla-dr+，且大多數(shù)是cd163+和cd11b+。(ssc＝側(cè)向散射：側(cè)向散射測量與激光路徑成90度的散射光并測量細胞的粒度；fsc＝前向散射：前向散射測量在激光路徑方向上的散射光并測量細胞的大小；dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)：cd45：全造血細胞標志物；hla-dr：巨噬細胞和樹突狀細胞標志物，由人白細胞抗原復合物編碼的mhcii類細胞表面受體；cd14：分化抗原簇14，巨噬細胞標志物；cd11b：整合素αm(itgam)，巨噬細胞標志物；cd163：分化抗原簇163，血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復合物的高親和力清道夫受體，巨噬細胞標志物)。

圖4顯示暴露于熒光標記的乳膠?；虻矸蹣觓β肽的第12天分選的ipsc來源的原始巨噬細胞的吞噬試驗的結(jié)果。iba-1＝離子鈣結(jié)合銜接分子1(小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞標志物)；cx3cr1＝fractalkine受體；dic＝微分干涉相差。

圖5顯示在培養(yǎng)7天后，從ipsc來源的原始巨噬細胞于神經(jīng)元上的共培養(yǎng)物獲得的結(jié)果的顯微鏡圖像。tuj1＝神經(jīng)元特異性iii類β-微管蛋白標志物；iba1＝離子鈣結(jié)合銜接分子1(小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞標志物)；hoechst＝熒光染料，其標記dna且然后標記細胞核。圖像右上角的數(shù)字(*60和*100)指示顯微鏡的放大倍數(shù)。

圖6顯示在共培養(yǎng)的不同天數(shù)(7、16和21)，從ipsc來源的原始巨噬細胞于ipsc來源的神經(jīng)元(相同ipsc來源)上的共培養(yǎng)物獲得的結(jié)果的顯微鏡圖像。

圖7顯示對csf2ar-ko小鼠(cd45.2)模型鼻內(nèi)移植鼠ipsc來源的原始巨噬細胞以測試其功能的策略的圖解。

圖8顯示以下三項的流式細胞術(shù)分析：a)野生型(wt)小鼠肺(8個月大)；b)csf2ar-ko小鼠肺(9個月大)，其中沒有顯示肺泡巨噬細胞(分化缺陷)；和c)csf2ar-ko小鼠肺(1.5個月大)+陽性對照(冷凍ipsc巨噬細胞)。

圖9顯示用ipsc(1000k)移植的csf2ar-ko小鼠肺(9個月大)在42天內(nèi)的流式細胞術(shù)分析。是指巨噬細胞。

圖10顯示鼠ipsc來源的原始巨噬細胞能夠嫁接到肺中超過8周并得到肺泡巨噬細胞的標志物(siglecf)。

圖11顯示鼠ipsc來源的原始巨噬細胞(cx3cr1-gfp+)可嫁接到肺中超過8周并吞噬表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白b(spb)。

圖12顯示從csf2ar-ko小鼠(ko)和用ipsc來源的原始巨噬細胞移植的csf2ar-ko小鼠(ko-移植)收集的支氣管肺泡灌洗液的渾濁度。灌洗液的光密度在600nm下測量。

圖13顯示從野生型小鼠(wt)、csf2ar-ko小鼠(ko)和用ipsc來源的原始巨噬細胞移植的csf2ar-ko小鼠(ko-移植)收集的支氣管肺泡灌洗液的渾濁度。灌洗液的光密度在600nm下測量。

具體實施方式

在第一方面，本發(fā)明涉及一種從干細胞培養(yǎng)類原始巨噬細胞的方法。所述方法包括：(a)將所述干細胞與包括gsk3抑制劑的無血清培養(yǎng)基接觸并孵育以誘導所述干細胞分化成中胚層譜系的細胞；(b)將所述中胚層譜系的細胞與包括dkk1的培養(yǎng)基接觸并孵育以使所述中胚層譜系的細胞分化成造血細胞譜系的細胞；(c)使所述造血細胞譜系的細胞成熟；和(d)將所述造血細胞譜系的成熟細胞與包括m-csf的培養(yǎng)基接觸并孵育以促使所述造血細胞分化成類原始巨噬細胞。

干細胞可選自胚胎干細胞(esc)和誘導性多能干細胞(ipsc)。在一個實施方案中，干細胞可以是人h1胚胎干細胞(esc)。在另一個實施方案中，干細胞可以是人誘導性多能干細胞(ipsc)。

gsk3抑制劑可選自6-溴靛玉紅-3′-肟(bio)、chir-99021、sb216763、chir-98014、tws119、im-12、1-氮雜坎帕羅酮(azakenpaullone)、ar-a014418、sb415286、azd1080、azd2858、靛玉紅、a1070722、tcs2002、tideglusib或其任何衍生物。

在一些實施方案中，干細胞可以在步驟(a)之前的至少24小時，以小于1個小集落/cm²的密度接種到涂布有matrigel的6孔板上。

干細胞可以用包括80％dmem/f12、20％knockout血清替代物、l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇和fgf-2的培養(yǎng)基孵育(步驟(a))。在一些實施方案中，干細胞可以在所述培養(yǎng)基中孵育約1天。

在另一個實施方案中，干細胞可以在步驟(a)中與包括1-20ng/ml的bmp4、5-100ng/ml的vegf、0-50ng/ml的fgf-2和0-10μm的chir99021的分化培養(yǎng)基接觸。分化培養(yǎng)基可以是獲自invitrogen的34。細胞可以在約5％的氧濃度下用所述培養(yǎng)基孵育約2天。

在另一個實施方案中，細胞另外在步驟(a)中與1-20ng/ml的bmp4和5-100ng/ml的vegf接觸。

在另一個實施方案中，細胞在約5％的氧濃度下用所述培養(yǎng)基孵育約2天。

細胞可以在步驟(b)中與包括5-100ng/ml的vegf、0-50ng/ml的fgf-2、0-250ng/ml的scf、0-500ng/mldkk1、0-50ng/ml的il-6和0-50ng/ml的il-3的分化培養(yǎng)基接觸。細胞可以在約5％的氧濃度下用所述培養(yǎng)基孵育約3天。

在一些實施方案中，細胞可以在步驟(c)中通過與包括0-50ng/ml的fgf-2、0-250ng/ml的scf、0-50ng/ml的il-3和0-50ng/ml的il-6的分化培養(yǎng)基接觸而成熟。細胞可以在常氧條件下用所述培養(yǎng)基孵育約7天。本文所用的術(shù)語“常氧條件”是指培養(yǎng)基中的氧濃度水平可以是約20％的條件。

細胞可以在步驟(d)中與包括0-100ng/mlm-csf的分化培養(yǎng)基接觸并孵育。細胞可以在常氧條件下用所述培養(yǎng)基孵育至少6天。

在一個實施方案中，本文所述的方法在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)21天至25天期間可以產(chǎn)生大于1×10⁶/孔的類原始巨噬細胞產(chǎn)率。如所屬領(lǐng)域中將會了解的，巨噬細胞的產(chǎn)率可取決于本文所述方法中所應用的細胞的起源。

在另一個實施方案中，所述方法可另外包括使用facs分選法或磁選法分離所述類原始巨噬細胞。

本文還提供了一種根據(jù)本文所述方法使用的試劑盒，其包括gsk3抑制劑和dkk1以及使用說明書。

本文還提供了一種通過本文所述的方法獲得的類原始巨噬細胞。類原始巨噬細胞可以隨后分化成小膠質(zhì)細胞、肺泡巨噬細胞、庫普弗細胞(kupffercell)、郎格罕細胞(langerhanscell)或其他組織巨噬細胞。術(shù)語“其他組織的巨噬細胞”是指可在包括但不限于腎組織、胰腺組織、脂肪組織、肝組織或結(jié)締組織的任何組織類型中發(fā)現(xiàn)的巨噬細胞。

本文還提供了本文所述的類原始巨噬細胞用于開發(fā)體外疾病模型的用途，其中所述疾病是神經(jīng)變性疾病、代謝疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、結(jié)締組織疾病、癌癥或炎性疾病。在一個實施方案中，所述疾病是神經(jīng)變性疾病。

在一些實施方案中，提供了本文所述的類原始巨噬細胞用于篩選供治療疾病用的化合物的用途，其中所述疾病是神經(jīng)變性疾病或代謝疾病。

在一些實施方案中，所述疾病是神經(jīng)變性疾病。在一些實施方案中，神經(jīng)變性疾病可以是阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病或雷特綜合征(rettsyndrome)。在一些實施方案中，代謝疾病可以是肥胖癥或糖尿病。在一些實施方案中，呼吸系統(tǒng)疾病可以是肺泡蛋白沉著癥。在一些實施方案中，心血管疾病可以是動脈粥樣硬化。在一些實施方案中，結(jié)締組織疾病可以是纖維化。在一些實施方案中，炎性疾病可以是關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、多發(fā)性硬化或炎性腸病以及皮膚炎性疾病例如異位性皮炎、牛皮癬。

還提供了本文所述的類原始巨噬細胞用于傷口愈合和組織再生的用途。

還提供了本文所述的類原始巨噬細胞用于將載運分子遞送到組織中的用途，其中所述載運分子是免疫調(diào)節(jié)性細胞因子或趨化因子，或活化前藥的酶。

還提供了一種用于從鼠干細胞培養(yǎng)類原始巨噬細胞的方法，其中所述方法包括：(a)將所述干細胞與包括fgf2和bmp4的無血清培養(yǎng)基接觸并孵育以誘導所述干細胞分化成中胚層譜系的細胞；(b)將所述中胚層譜系的細胞與包括fgf2、bmp4、激活素a和vegf的培養(yǎng)基接觸并孵育以使所述中胚層譜系的細胞分化成造血細胞譜系的細胞；(c)使所述造血細胞譜系的細胞成熟；(d)將所述造血細胞譜系的成熟細胞與包括m-csf的培養(yǎng)基接觸并孵育以促使所述造血細胞分化成類原始巨噬細胞。

鼠干細胞可選自小鼠胚胎干細胞(esc)和小鼠誘導性多能干細胞(ipsc)。

本文中說明性地描述的本發(fā)明可以在不存在本文未具體公開的任何一或多個要素、一或多個限制的情況下適當?shù)貙嵤?。因此，舉例來說，術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”等應被廣義地且不受限制地解讀。另外，本文使用的術(shù)語和表達已經(jīng)作為描述性且不構(gòu)成限制的術(shù)語使用，并且在此類術(shù)語和表達的使用中不意圖排除所顯示和所描述特征或其部分的任何等效物，但是應認識到各種修改在要求保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)都是可能的。因此，應理解雖然已經(jīng)通過優(yōu)選實施方案和任選特征明確公開了本發(fā)明，但是本文公開的在其中體現(xiàn)的本發(fā)明的修改和變化可以由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員實施，并且此類修改和變化被視為處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在本文中已經(jīng)廣泛且一般性地描述了本發(fā)明。屬于類屬公開內(nèi)的每一個更窄物種和亞屬分組也形成本發(fā)明的部分。這包括本發(fā)明的類屬描述，附帶條件或負面限制是從該類屬中去除任何主題，而不論本文中是否具體敘述了切除的材料。

其他實施方案處于以下權(quán)利要求和非限制性實施例中。此外，當用馬庫什群組(markushgroup)描述本發(fā)明的特征或方面時，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，因而也用馬庫什群組的任何單獨成員或成員子群描述本發(fā)明。

實驗部分

將參考具體實施例更詳細地進一步描述本發(fā)明的非限制性實施例(包括最佳模式)和比較實施例，所述具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

小鼠多能干細胞分化成原始巨噬細胞

如果mesc/mipsc在mef上擴增，那么在分化開始之前通過在涂布有明膠的6孔板上傳代1-2次耗盡mef。

在第0天，將集落離解并以175,000-200,000個細胞/ml再懸浮于補充有5ng/mlhfgf2和5ng/mlhbmp4的無血清分化培養(yǎng)基(以下配方)中。將這些分配到非附著板中以形成胚狀體(eb)。

48小時后，匯集eb并用tryple(優(yōu)選)或胰蛋白酶離解。

eb然后以175,000個細胞/ml在補充有5ng/mlhfgf2、2ng/mlhbmp4、2ng/ml人激活素a、5ng/mlhvegf的無血清分化培養(yǎng)基中再聚集。

另外48小時后，將eb離解并針對flk-1+細胞分選。

分選后的細胞然后以500,000個細胞/ml在補充有5ng/mlvegf、300ng/mldkk1、100ng/mlm-csf的無血清分化培養(yǎng)基中再聚集。細胞懸浮液然后分配到非貼壁培養(yǎng)孔中以形成eb。

另外48小時后(整個分化的d6)，將eb離解并再懸浮于補充有100ng/mlscf、10ng/mlil-3、100ng/mlm-csf的stemprosfm完全培養(yǎng)基(以下配方)中。細胞然后接種到涂布有明膠的組織培養(yǎng)板上。

類原始巨噬細胞應當從分化的d8開始出現(xiàn)并且在分化的d13-14附近達到峰值。典型地在d10-11附近分選或收獲細胞。細胞傳代不是必需的，但應注意截至d8時懸浮液中有很多細胞。收集懸浮液和貼壁部分兩者以用于分選。

無血清分化培養(yǎng)基：

75％imdm/25％f12

0.5×n2補充物

0.5×b27補充物(無視黃酸)

1×pen/strep(青霉素/鏈霉素)

0.05％bsa

2mml-谷氨酰胺

0.5mm抗壞血酸

4.5×10^-4m1-硫代甘油

stemprosfm完全培養(yǎng)基：

stempro-34sfm(invitrogen)

1×pen/strep(青霉素/鏈霉素)

2mml-谷氨酰胺

200μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白

0.5mm抗壞血酸

4.5×10^-4m1-硫代甘油

實施例2

人多能干細胞分化成原始巨噬細胞

分化策略可以分成4個階段：原條/中胚層誘導、造血特化、造血細胞成熟和最終端髓擴增。每個階段的實驗細節(jié)在圖1和圖2說明且描述如下：

階段0：將es或ips細胞在涂布有matrigel的板上在cf1mef調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中維持。培養(yǎng)基配方由80％dmem/f12、20％knockout血清替代物、l-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇和6ng/mlfgf-2組成，且培養(yǎng)基每天更換。細胞每隔5-6天通過膠原酶iv處理和用細胞刮棒輕輕分離來傳代。在分化開始前24小時，將細胞以極低密度(<1個小集落/cm²)接種到涂布有matrigel的6孔板上并附著過夜。

階段1(原條/中胚層誘導)：在這個初始階段，用bmp4和gsk3抑制劑處理細胞以促進特化成后部原條(posteriorprimitivestreak)，這在胚胎發(fā)生期間產(chǎn)生中胚層。還添加vegf以促進造血中胚層的發(fā)育。細胞也維持在低氧條件(5％o2)下。

階段2(造血特化)：大約4-5天后，可以觀察到具有kdr和cd31高表達的細胞的子集。這個群體含有成血管細胞，它是造血細胞和內(nèi)皮細胞的雙潛能前體。調(diào)整此時的誘導混合液以擴增成血管細胞，并且進一步使其朝向造血譜系特化。此時添加scf和fgf-2以促進細胞存活和增殖。添加il-3、il-6和vegf以促進造血分化，并添加dkk1以抑制紅系分化(且可能驅(qū)動巨噬細胞分化)。細胞在低氧條件下維持到第8天，隨后在常氧條件下培養(yǎng)。

階段3(造血細胞成熟)：在這個階段，更充分地驅(qū)動造血細胞朝向巨噬細胞譜系。此時不再需要dkk和vegf，因此將其從混合液中去除。

階段4(端髓擴增)：去除除m-csf外的所有細胞因子，發(fā)現(xiàn)m-csf可經(jīng)由通過csf1-受體的信號傳導促進原始巨噬細胞的增殖。

早在分化的第18天就可以在群體中觀察到表達經(jīng)典表面標志物的巨噬細胞，并且我們發(fā)現(xiàn)在分化的第21-25天的細胞流式分選導致良好的產(chǎn)率和生活力。具體來說，常見巨噬細胞標志物(cd14、hla-dr、cd11b和cd163)的表達譜，在關(guān)于從h1es細胞、患者來源的wtipsc和患者來源的突變型ipsc分化的巨噬細胞的圖3中顯示。

分化培養(yǎng)基1(dm1)

含有補充物和1×青霉素/鏈霉素的stempro34(invitrogen)

2mm谷氨酰胺

1×脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(apo-transferrin)

4×10^-4m硫代甘油(mtg)

50μg/ml抗壞血酸(aa)

分化培養(yǎng)基2(dm2)

含有1×青霉素/鏈霉素的imdm75％/ham’sf-1225％

0.5×b27補充物(無視黃酸)

0.5×n2補充物

2mm谷氨酰胺

4×10^-4m硫代甘油

50μg/ml抗壞血酸

程序

第0天：用含有bmp4(5ng/ml)、vegf(50ng/ml)、chir99021(2μm)的dm1更換擴增培養(yǎng)基。在5％o2中培養(yǎng)。

第2天：用含有bmp4(5ng/ml)、vegf(50ng/ml)、fgf-2(20ng/ml)的dm1更換培養(yǎng)基。在5％o2中培養(yǎng)。

第4天：用含有vegf(15ng/ml)、fgf-2(5ng/ml)的dm1更換培養(yǎng)基。在5％o2中培養(yǎng)。

第6天：用含有vegf(10ng/ml)、fgf-2(10ng/ml)、scf(50ng/ml)、dkk1(30ng/ml)、il-6(10ng/ml)、il-3(20ng/ml)的dm1更換培養(yǎng)基。在5％o2中培養(yǎng)。

第8天、第10天：用含有vegf(10ng/ml)、fgf-2(10ng/ml)、scf(50ng/ml)、dkk1(30ng/ml)、il-6(10ng/ml)、il-3(20ng/ml)的dm1更換培養(yǎng)基。將細胞恢復到常氧條件(20％o2)。

第12天、第14天：用含有fgf-2(10ng/ml)、scf(50ng/ml)、il-6(10ng/ml)、il-3(20ng/ml)的dm1更換培養(yǎng)基。

第16天、第18天、第20天：用含有mcsf(50ng/ml)的dm2更換培養(yǎng)基。

技術(shù)備忘表

推薦6孔板中的3ml培養(yǎng)基/孔的體積。

從第6天開始，觀察懸浮液中的細胞。為了避免損失造血細胞，將上清液離心并將得到的細胞沉淀再懸浮于少量新鮮培養(yǎng)基中，隨后添加回其原始孔中。

dm1應每隔5-7天新鮮制備并在4℃儲存以降低生物活性的損失。

dm2可以在使用前預先制備(無aa和mtg)并作為等分試樣冷凍。aa和mtg可以添加到解凍的等分試樣中并在4℃儲存長達一周。

這種方法有許多獨特且有利的特征，包括其模擬胚胎卵黃囊中的原始造血。與晚些時候需要血清補充且需要和基質(zhì)細胞例如op9共培養(yǎng)的競爭性技術(shù)相比，這種方法完全不含血清和飼養(yǎng)層。此外，不需要離解步驟且不存在胚狀體形成階段。事實上，分化發(fā)生在2d貼壁培養(yǎng)中而不是整個過程中。所述方法也已經(jīng)在h1細胞和其他ipsc細胞系上得到了驗證并且是可規(guī)模化的，從而產(chǎn)生高產(chǎn)率的原始巨噬細胞(6孔板中>1×10⁶/孔)。gsk抑制劑的添加推動朝向原條的初始特化，而dkk的添加則抑制紅系分化。

實施例3

人ipsc來源的原始巨噬細胞的分化

用第12天分選的ipsc來源的原始巨噬細胞(cd163+cd11b+hla-dr+iba-1+cx3cr1+cd14+)進行吞噬試驗，其中已經(jīng)從患者來源的wtipsc分化了巨噬細胞且表達譜是cd45+cd11b+和cd163+。具體來說，將第12天分選的ipsc來源的原始巨噬細胞暴露于熒光標記的乳膠粒或淀粉樣aβ肽，以便評估其作為巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞進行吞噬的能力。

如圖4所示，支持了所述ipsc來源的原始巨噬細胞作為巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞進行吞噬的能力。這是很重要的，因為淀粉樣β(aβ或abeta)肽作為阿爾茨海默病患者的腦中所發(fā)現(xiàn)的淀粉樣斑塊的主要組分至關(guān)重要地參與到阿爾茨海默病中。

程序

用于分析巨噬細胞吞噬能力的方法使用亨廷頓舞蹈癥人ipsc(hd33i)來源的原始巨噬細胞的對照細胞系，將其用含有10％fcs的imdm重構(gòu)，接種(5.0×10⁴個細胞/孔)到24孔板上，并在37℃在空氣中在完全潮濕的5％co2氣氛中靜置。

然后將細胞用乳膠粒(1:100,000)孵育24小時，用pbs洗滌三次，用4％pfa固定，并用激光共聚焦顯微鏡分析。

通過參照細胞形態(tài)(微分干涉相差)和核(dapi，1:10,000)來分析被吞噬的乳膠粒。

實施例4

人ipsc來源的神經(jīng)元和巨噬細胞共培養(yǎng)

將從本文所述的方法獲得的ipsc來源的原始巨噬細胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)。

如圖5和圖6所示，共培養(yǎng)導致ipsc來源的原始巨噬細胞分化成iba1+小膠質(zhì)細胞，其具有體內(nèi)成人小膠質(zhì)細胞所特有的分枝形態(tài)。

這些結(jié)果顯示ipsc來源的原始巨噬細胞具有分化成小膠質(zhì)細胞的能力。

程序

采用本文所述的分化方法從人ipsc(hd33i)誘導神經(jīng)元。將百分之八十(80％)融合率的ipsc用dmem/f12洗滌兩次并用accutase離解成單細胞。用神經(jīng)元前體細胞(npc)+培養(yǎng)基再懸浮細胞并將其接種到涂布有matrigel的6孔板上。為了誘導npc，每天更換npc+培養(yǎng)基，持續(xù)7天。npc然后在含有10μmrock抑制劑的npc-培養(yǎng)基中以1:3稀釋率分離到涂布有matrigel的6孔板上，隨后用補充有egf(20ng/ml)和bfgf(20ng/ml)的npc-培養(yǎng)基傳代幾次以進行調(diào)節(jié)。為了終末分化成神經(jīng)元，用accutase將融合npc離解成單細胞，用神經(jīng)元分化培養(yǎng)基再懸浮，并接種(5.0×10⁴個細胞/孔)到24孔板中的涂布有聚-l-鳥氨酸和層粘蛋白的蓋玻片上。

實施例5

csf2ar-ko小鼠肺移植

使用肺泡蛋白沉著癥的csf2ar-ko小鼠(cd45.2)小鼠模型測試ipsc來源的原始巨噬細胞的作用。

如圖7所示，鼠ipsc來源的原始巨噬細胞的移植拯救并緩解了小鼠模型的肺泡蛋白沉著癥。

通過流式細胞術(shù)分析來自以下小鼠的肺的細胞懸浮液：未經(jīng)處理的野生型小鼠(8a，陽性對照)，未經(jīng)處理的小鼠模型csf2ar-ko(8b，陰性對照)，和添加有ipsc巨噬細胞的細胞懸浮液中的小鼠模型csf2ar-ko，作為技術(shù)對照(8c)，并通過顯現(xiàn)已知的巨噬細胞標志物檢測肺泡巨噬細胞的存在或不存在。

在這方面，圖8a、8b和8c中的圓圈區(qū)域顯示肺泡巨噬細胞的存在或不存在，其中肺泡巨噬細胞在圖8a中存在但在圖8b和8c中不存在。圖8a、8b和8c證明在鼻內(nèi)移植離體來源的巨噬細胞之前，csf2ar-ko小鼠缺乏肺泡巨噬細胞。

此外，在另一個實驗中，csf2ar-ko小鼠接受1000kipsccx3cr1-gfp巨噬細胞的鼻內(nèi)移植，并通過流式細胞術(shù)分析肺的細胞懸浮液。如圖9和圖10所示，鼠ipsc來源的原始巨噬細胞(ipsc來源的巨噬細胞是f4/80和cx3cr1-gfp且得到siglec-f表達)嫁接到肺中超過42天并得到肺泡巨噬細胞的標志物(siglecf)，同時維持特異性標志物例如cd11b的表達。具體來說，圖9中的虛線圓圈代表野生型小鼠中存在的內(nèi)源肺泡巨噬細胞的預期群體。

鼠ipsc來源的原始巨噬細胞也顯示嫁接到肺中超過8周并得到肺泡巨噬細胞的標志物(siglecf)并分布到整個肺中(圖10)。

鼠ipsc來源的原始巨噬細胞(cx3cr1-gfp+)也顯示嫁接到肺中超過8周，并吞噬因為不存在內(nèi)源功能肺泡巨噬細胞而積累的表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白b(spb)(參見圖10和圖11)。因此，在經(jīng)過移植的肺中的spb積累減少，且通過elisa灌洗法測量的支氣管肺泡的渾濁度降低(圖12和圖13)。如將要了解的，針對csf2ar-ko小鼠(cd45.2)小鼠模型顯示的作用和結(jié)果是表明所述疾病因為用ipsc來源的原始巨噬細胞治療而被清除的證據(jù)。