【
技術(shù)領(lǐng)域：
】本發(fā)明涉及原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞及其制作方法，更具體而言，涉及能分化為肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞及腸細(xì)胞的內(nèi)胚層細(xì)胞及其制作方法。
背景技術(shù)：
：近年，關(guān)注利用自ips/es細(xì)胞等的多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)的組織－器官而開發(fā)新的藥品的藥物開發(fā)篩選或補(bǔ)救喪失的器官的功能的再生醫(yī)療實(shí)現(xiàn)化(takebe，etal.nature，499：481-484，2013(非專利文獻(xiàn)1)、wo2013/047639：組織及器官的制作方法(專利文獻(xiàn)1))。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)于使用人ips細(xì)胞的肝疾病的再生治療，“超大量”的人肝細(xì)胞的gmp等級(jí)的制造技術(shù)變得必要。例如，為了使人成體肝臟的約30％的功能替代成為可能，對(duì)于1名患者，作為肝細(xì)胞數(shù)，移植6×1010個(gè)細(xì)胞植活是必須條件。一方面，對(duì)于這些超大量的人肝細(xì)胞制造，在通過由既有的現(xiàn)有技術(shù)的分化誘導(dǎo)流程嘗試細(xì)胞調(diào)制時(shí)，如果考慮到移植效率，則1人的肝移植待機(jī)患者的治療需要約95億日元的莫大的成本，由我們的成本試算確證?！粳F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】【非專利文獻(xiàn)】非專利文獻(xiàn)1：takebe，etal.nature，499：481-484，2013【專利文獻(xiàn)】專利文獻(xiàn)1：wo2013/047639a1技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】對(duì)于肝疾病的再生治療費(fèi)用的大部分是從人ips細(xì)胞的分化誘導(dǎo)所要求的細(xì)胞因子等的分化誘導(dǎo)因子，所以以大幅的成本削減作為目的，作為在自人ips細(xì)胞向器官細(xì)胞的分化過程中極重要的中間階段，設(shè)定“原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(pgecs)”被認(rèn)為是極有利的戰(zhàn)略。即，由分化誘導(dǎo)期間大幅縮短，每分化誘導(dǎo)的偏差最小化等，成為用于廉價(jià)穩(wěn)定并且大量地誘導(dǎo)人器官細(xì)胞的技術(shù)基盤。作為解決這樣的技術(shù)性障礙的方法，近年，嘗試了以下的3個(gè)方法。(1)自ips細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)胚層前體細(xì)胞(cellstemcell.2012apr6；10(4)：371-84.、wo2012178215a1)、(2)前腸內(nèi)胚層細(xì)胞(stemcellreport，vol1，293-306，2013)、(3)由直接重編程得到的多能性內(nèi)胚層細(xì)胞(nature508，93-97，2014)。是擴(kuò)增由各(1)～(3)的方法制作的中間階段的細(xì)胞，在功能細(xì)胞的分化誘導(dǎo)中使用的方法。但是，在(1)中，由于以小鼠細(xì)胞作為飼養(yǎng)者使用，難以臨床應(yīng)用。從在(2)中，從擴(kuò)增的細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞的分化功能顯著地低，在(3)的方法中，擴(kuò)增的細(xì)胞的安全性成為課題，即，確認(rèn)cxcr4等的轉(zhuǎn)移等的與癌的惡性度有關(guān)系的標(biāo)志物表達(dá)等的問題來看，在各細(xì)胞中，難以在醫(yī)療－產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中使用是現(xiàn)狀。本發(fā)明以解決這些現(xiàn)有技術(shù)的問題作為目的?！窘鉀Q課題的技術(shù)方案】本發(fā)明人經(jīng)銳意努力的結(jié)果，確立在上述(1)、(3)的細(xì)胞和(2)的細(xì)胞的中間階段的“原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞：pgecs)”的誘導(dǎo)。再者，在使它們的細(xì)胞擴(kuò)增之后，成功向功能細(xì)胞分化誘導(dǎo)。本發(fā)明的原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(pgecs)能向肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞及腸細(xì)胞的分化(分化功能高)(對(duì)于上述(2)的細(xì)胞的顯著性)、不表達(dá)cxcr4等的與癌的惡性度相關(guān)的標(biāo)志物(安全性高)(對(duì)于上述(3)的細(xì)胞的顯著性)、再者，由于可不使用飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)制，具有臨床應(yīng)用容易(對(duì)于上述(1)的細(xì)胞的顯著性)的顯著性。本發(fā)明的要點(diǎn)如下。(1)使多能性干細(xì)胞分化之后，在實(shí)施至少1次以上傳代之后誘導(dǎo)的細(xì)胞，其中，作為未分化(多能性)細(xì)胞標(biāo)志物的nanog，oct4，myc，lin28a是陰性，作為內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志物的cxcr4，cer1，hhex，gata4是陰性，作為腸內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志物的cdx2，hoxb9是陽性，再者，作為間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的brachyury(t)是陰性，作為胰腺細(xì)胞標(biāo)志物的pdx1是陰性，所述細(xì)胞可至少分化為肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞及腸細(xì)胞。(2)(1)所述的細(xì)胞的制作方法，其包括在第1階段，在rock抑制物的存在下，在第2階段，在激活素a及wnt3a的存在下，在第3階段，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，在第4階段，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，將多能性干細(xì)胞在飼養(yǎng)細(xì)胞非存在下培養(yǎng)而使分化之后，實(shí)施至少1次以上傳代。(3)(1)所述的細(xì)胞的擴(kuò)增方法，其包括傳代后的第1階段或傳代初日在rock抑制物的存在下，其后在sfd、fgf2、vegf、egf、a83-01及chir99021的存在下培養(yǎng)。(4)器官細(xì)胞的制作方法，其包括使(1)所述的細(xì)胞向器官細(xì)胞分化誘導(dǎo)。(5)將(1)所述的細(xì)胞在任意的階段冷凍－保存，構(gòu)建用于制造器官細(xì)胞的工作細(xì)胞庫的方法。【發(fā)明效果】從人ips細(xì)胞將與分化中途階段相當(dāng)?shù)膒gecs在非飼養(yǎng)者環(huán)境下分化誘導(dǎo)變得可能。此pgecs能大量調(diào)制，可使用此細(xì)胞而制造器官原基(takebe，etal.nature，499：481-484，2013)。誘導(dǎo)的pgecs是在以往方法中必須的飼養(yǎng)細(xì)胞非存在下，也能進(jìn)行20次以上傳代培養(yǎng)而擴(kuò)增至1010倍的細(xì)胞。再者，被擴(kuò)增的細(xì)胞能由冷凍保存的貯存。再者，有向肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、腸道細(xì)胞等的各種各樣的功能細(xì)胞的分化能力的pgecs在重復(fù)在以往方法中成為課題的傳代之后，也向有高的功能的功能細(xì)胞分化誘導(dǎo)。本說明書包含作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本國專利申請(qǐng)、特愿2014-248694的說明書及/或附圖中記載的內(nèi)容?！靖綀D說明】【圖1】顯示人ips細(xì)胞來源原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(pgecs)的誘導(dǎo)－擴(kuò)增－分化法的概要。由本發(fā)明擴(kuò)增的細(xì)胞，相比稱為定形內(nèi)胚層或內(nèi)胚層祖細(xì)胞的細(xì)胞，是作為(向腸道系統(tǒng))分化的更下游的細(xì)胞的稱為原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(pgec)的細(xì)胞。本細(xì)胞是能分化為來源于內(nèi)胚層的全部的細(xì)胞的細(xì)胞。在細(xì)胞名(人ipsc/esc，內(nèi)胚層祖細(xì)胞(ep)/定形內(nèi)胚層(de)、pgecs)的下或右，記載該細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)志物的種類?！緢D2】顯示從人ips細(xì)胞未夾傳代的pgec的初期分化誘導(dǎo)過程和細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察。【圖3】顯示由rock抑制劑的添加，進(jìn)行傳代時(shí)的細(xì)胞的粘接－植活大幅地改善。【圖4】對(duì)于pgec傳代后的維持及增殖有效的細(xì)胞因子－添加因子組合的探討。m1～8表示條件的差異。與圖5的結(jié)果一并，顯示m2的條件有效?！緢D5】左圖顯示在m1～8中的基因表達(dá)量的比較，右圖顯示細(xì)胞增殖數(shù)的定量結(jié)果。顯示在細(xì)胞良好地增殖的m2，m4，m6～8的條件之中，作為pgec標(biāo)志物的cdx2表達(dá)增強(qiáng)，cxcr4，cer1的表達(dá)降低的條件是m2。【圖6】顯示對(duì)在傳代第1～20次、及傳代第5次的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行顯微鏡觀察的結(jié)果，長期繼續(xù)傳代之后也維持細(xì)胞的形態(tài)。【圖7】在傳代第10次中進(jìn)行長期冷凍保存，解凍而繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)之后的形態(tài)觀察的結(jié)果。顯示解凍后重復(fù)傳代20次之后也維持細(xì)胞的形態(tài)?！緢D8】顯示人ips細(xì)胞來源pgecs的增殖曲線(圖8、左)和細(xì)胞倍增時(shí)間(圖8、右)。【圖9】顯示在傳代前(p0)及傳代后(p5，10，15，20)的人ips細(xì)胞來源pgec標(biāo)志物的表達(dá)基因的解析的結(jié)果。【圖10】顯示在傳代前(p0)及傳代后(p5，15)的人ips細(xì)胞來源pgecs的facs經(jīng)時(shí)解析的結(jié)果?！緢D11】顯示在傳代前(p0)及傳代后(p1，10，15)的人ips細(xì)胞來源pgecs的免疫學(xué)解析的結(jié)果?！緢D12】顯示在傳代后(p5，10，15)的人ips細(xì)胞來源pgecs的免疫學(xué)解析的結(jié)果?！緢D13】顯示人ips細(xì)胞來源pgecs的主成分解析的結(jié)果?！緢D14】顯示人ips細(xì)胞來源pgecs的階層的聚類解析的結(jié)果。【圖15-1】顯示對(duì)擴(kuò)增的人ips細(xì)胞來源pgec(p6)階段性地進(jìn)行分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的形態(tài)變化(圖15-1、上段)和肝細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)基因的解析的結(jié)果(圖15-1、下段)。【圖15-2】對(duì)擴(kuò)增的人ips細(xì)胞來源pgec(p6)進(jìn)行分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的弱擴(kuò)大像。顯示誘導(dǎo)廣義上示均一的形態(tài)的成熟肝細(xì)胞?！緢D16】顯示從人ips細(xì)胞來源pgecs分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞(pgec-mh)的免疫學(xué)解析的結(jié)果(上段、左)、icg試驗(yàn)、pas染色的結(jié)果(上段、右)、肝細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)(qpcr)。【圖17-1】顯示從人ips細(xì)胞來源pgecs分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞(pgec-mh)的傳代后(p2，4，6，9)的形態(tài)學(xué)觀察?！緢D17-2】顯示從人ips細(xì)胞來源pgecs分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞(pgec-mh)的傳代后(p3，5)的微陣列解析的結(jié)果(左)及從人ips細(xì)胞來源pgecs分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞(pgec-mh)的傳代前(p0)及傳代后(p5，10)的alb分泌能?！緢D18】顯示從人ips細(xì)胞來源pgecs階段性地誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)解析的結(jié)果?！緢D19】顯示從人ips細(xì)胞來源pgecs分化誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞的免疫染色的結(jié)果?！緢D20】顯示從人ips細(xì)胞來源pgecs分化誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞的表達(dá)基因的解析的結(jié)果?！緢D21】顯示使用pgec的腸組織的階段性誘導(dǎo)的方法的概要?！緢D22】顯示從pgec誘導(dǎo)的腸組織的照片。【圖23】對(duì)pgec(p1往后)具有特異性的陽性－陰性標(biāo)志物基因的提取。顯示對(duì)人ips細(xì)胞來源pgecs第1次傳代往后的特異性標(biāo)志物的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。陽性的用紅色表示、陰性的用綠色表示?！緢D24】從各種各樣的ips克隆的原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(pgec)的建立。a：誘導(dǎo)的原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(第0代的第5天)的顯微鏡觀察像。作為在誘導(dǎo)中使用的ips細(xì)胞，使用1231a3-、1383d2-、1383d6-、ff-01-、ff-06-的5種不同的克隆。b：ips克隆每的增殖曲線。來源于全部的克隆的pgec能進(jìn)行至少20次以上傳代－擴(kuò)增?！緢D25】進(jìn)行移植的pgec的內(nèi)胚層組織再構(gòu)建能。a：摘出移植1個(gè)月后的組織的結(jié)果，確認(rèn)不到稱為明顯的奇形腫或癌等的腫瘤的形成。黑虛線：pgec來源的組織。b：免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果，pgec來源的組織形成各種各樣的人內(nèi)胚層來源組織。即，顯示形成被肝臟－胰腺－腸道的標(biāo)志物染色的組織。比例尺＝50μm?！緢D26】pgec來源的肝芽的長期培養(yǎng)后功能表達(dá)的探討。a：體外制成的pgec來源肝芽的顯微鏡觀察。比例尺＝50μm。b：pgec來源肝芽的白蛋白分泌能。人白蛋白從由hcm/egm的分化誘導(dǎo)第4天的階段起檢測(cè)。再者得知，與用pgec單獨(dú)進(jìn)行細(xì)胞塊培養(yǎng)(僅回收pgec，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔/24孔板的密度向呈細(xì)胞在底部集合的形狀的低粘接性的培養(yǎng)皿接種細(xì)胞之后，培養(yǎng)數(shù)天而得到的組織)的組織比較，顯示顯著地高的白蛋白分泌能力。再者，在培養(yǎng)基條件不是hcm/egm，而是使用ko-dmem/egm時(shí)確認(rèn)不到白蛋白分泌。【圖27】進(jìn)行分化誘導(dǎo)的pgec來源肝芽的氨代謝功能。得知進(jìn)行分化誘導(dǎo)的pgec來源肝芽有顯著的氨代謝功能?！緢D28】對(duì)于劇癥肝功能衰竭模型的由pgec來源肝芽移植的治療效果。在移植pgec來源細(xì)胞塊或肝芽的組中確證，與非移植組比較生存率改善。【圖29】由免疫組織化學(xué)染色的向肝細(xì)胞－膽管上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的確認(rèn)。a：在移植1個(gè)月時(shí)間點(diǎn)形成的pgec來源肝芽移植組織是血管化的組織。另外，確認(rèn)不到疑似奇形腫或惡性腫瘤的所見。b：從免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果確證，形成了對(duì)人核特異性抗原、人白蛋白(肝細(xì)胞)、人ck7(膽管上皮細(xì)胞)、人cd31(血管)示染色性的肝組織。比例尺＝50μm?！緦?shí)施方式】以下，詳細(xì)地說明本發(fā)明。本發(fā)明提供在使多能性干細(xì)胞分化之后，實(shí)施至少1次以上傳代之后誘導(dǎo)的細(xì)胞，其中，作為未分化(多能性)細(xì)胞標(biāo)志物的nanog，oct4，myc，lin28a是陰性，作為內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志物的cxcr4，cer1，hhex，gata4是陰性，作為腸內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志物的hoxb5，hoxb6，hoxb7，hoxb8，cdx2，hoxa9，hoxb9，hoxc9是陽性，再者，作為間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的brachyury(t)是陰性，作為胰腺細(xì)胞標(biāo)志物的pdx1是陰性，所述細(xì)胞可至少分化為肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞及腸細(xì)胞(以下，在本說明書中，也記作原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞、原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞、pge或pgecs)。本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)在使多能性干細(xì)胞分化之后，實(shí)施至少1次以上傳代之后誘導(dǎo)。多能性干細(xì)胞是指潛在具有分化為生物體的各種各樣的組織的能力(分化萬能性)的細(xì)胞，具體而言，是指能分化為內(nèi)胚層、中胚層、外胚層的全部的細(xì)胞，可例示人工多能性干細(xì)胞(ips細(xì)胞)、胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)等，但不限于這些。多能性干細(xì)胞可為人來源的，也可為人以外的動(dòng)物、例如，小鼠、大鼠、狗、豬、猴、綿羊、牛、鳥等的動(dòng)物來源的。為使多能性干細(xì)胞分化，在第1階段，在rock抑制物的存在下，在第2階段，在激活素a及wnt3a的存在下，在第3階段，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，在第4階段，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，將多能性干細(xì)胞在飼養(yǎng)細(xì)胞非存在下培養(yǎng)即可，例如，以培養(yǎng)初日作為第0天，在第0天，在rock抑制物的存在下，在第1天，在激活素a及wnt3a的存在下，在第2天-第3天，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，在第4天-第5天，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，在飼養(yǎng)細(xì)胞非存在下培養(yǎng)多能性干細(xì)胞即可，分化的方法不限于此方法。另外，作為培養(yǎng)基，使用sfd培養(yǎng)基、rpmi培養(yǎng)基、其組合等即可。實(shí)施至少1次以上傳代。傳代次數(shù)(passagenumber)只要得到本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)，就不特別限定，優(yōu)選為1～30次，更優(yōu)選為1～20次。使多能性干細(xì)胞分化之后，開始傳代的時(shí)機(jī)在細(xì)胞占培養(yǎng)皿的比例(匯合)達(dá)80～90％左右的狀態(tài)之時(shí)即可。此狀態(tài)是用facs進(jìn)行解析，則如圖10一樣，稱為c-kit、cxcr4的抗原大致(80％以上)陽性的細(xì)胞集團(tuán)。但是，本發(fā)明人取c-kit、cxcr4呈陰性的的也進(jìn)行綜合傳代的方法(過程單純－簡(jiǎn)便)、無進(jìn)行分離的必要性的點(diǎn)也是本方法的有利的點(diǎn)。傳代用向sfd添加a83-01、chir、vegf、egf、fgf2的培養(yǎng)基進(jìn)行即可，不限于此培養(yǎng)基。傳代之后觀察到，cdx2、hoxb9等的hox基因組被誘導(dǎo)。細(xì)胞的培養(yǎng)用37℃，5％co2的培養(yǎng)用溫育器進(jìn)行即可。作為本發(fā)明的實(shí)施的實(shí)施方式，例如，對(duì)向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加rock抑制物(1-20μm、優(yōu)選為，10μm)的培養(yǎng)基接種多能性干細(xì)胞(2～6×105個(gè))(第0天)、培養(yǎng)1天之后，用向sfd培養(yǎng)基(1.5-4ml、優(yōu)選為，2ml)添加wnt3a(1-100ng/ml、優(yōu)選為，50ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換(第1天)、再者培養(yǎng)1天。接下來，用將sfd培養(yǎng)基和rpmi1640培養(yǎng)基以1:1～1:10(優(yōu)選為，1:9)的比例混合，向該培養(yǎng)基添加bmp4(0.5-4ng/ml、優(yōu)選為，2ng/ml)、bfgf(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(5-50ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天(第2天-第3天)。其后還用向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加bmp4(0.5-5ng/ml、優(yōu)選為，2ng/ml)、bfgf(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(8-20ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天(第4天-第5天)。以培養(yǎng)后的細(xì)胞作為p0細(xì)胞(第0代)，進(jìn)行傳代。例如，向pge維持培養(yǎng)基接種p0細(xì)胞(500～4×105個(gè)、優(yōu)選為，1×105個(gè))，其后，每3～4天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。pge維持培養(yǎng)基是向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加fgf2(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(8-20ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)、egf(10-40ng/ml、優(yōu)選為，20ng/ml)、a83-01(0.1-1μm、優(yōu)選為，0.5μm)、chir99021(1-5μm、優(yōu)選為，3μm)的培養(yǎng)基。作為本發(fā)明的別的實(shí)施的實(shí)施方式，例如，對(duì)向b27(2％)添加rpmi/1640培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加rock抑制物(1-20μm、優(yōu)選為，10μm)的培養(yǎng)基接種多能性干細(xì)胞(2～6×105個(gè))(第0天)、培養(yǎng)1天之后，用向b27(2％)添加rpmi/1640培養(yǎng)基(1.5-4ml、優(yōu)選為，2ml)添加wnt3a(1-100ng/ml、優(yōu)選為，50ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換(第1天)、再者培養(yǎng)1天。接下來，用向添加了b27(2％)的rpmi/1640培養(yǎng)基(1.5-4ml、優(yōu)選為，2ml)添加bmp4(0.5-4ng/ml、優(yōu)選為，2ng/ml)、bfgf(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(5-50ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天(第2天-第3天)。其后還用向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加bmp4(0.5-5ng/ml、優(yōu)選為，2ng/ml)、bfgf(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(8-20ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天(第4天-第5天或第4天)。以培養(yǎng)后的細(xì)胞作為p0細(xì)胞(第0代)，進(jìn)行傳代。例如，向pge維持培養(yǎng)基接種p0細(xì)胞(500～4×105個(gè)、優(yōu)選為，1×105個(gè))，其后，每3～4天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。pge維持培養(yǎng)基是向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加fgf2(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(8-20ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)、egf(10-40ng/ml、優(yōu)選為，20ng/ml)、a83-01(0.1-1μm、優(yōu)選為，0.5μm)、chir99021(1-5μm、優(yōu)選為，3μm)的培養(yǎng)基。本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)是，作為未分化(多能性)細(xì)胞標(biāo)志物的nanog，oct4，myc，lin28a是陰性，作為內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志物的cxcr4，cer1，hhex，gata4是陰性，作為腸內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志物的cdx2，hoxb9是陽性，再者，作為間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的brachyury(t)是陰性，作為胰腺細(xì)胞標(biāo)志物的pdx1是陰性。此外，優(yōu)選作為腸內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志物的hoxb5、hoxb6、hoxb7、hoxb8、hoxa9及hoxc9是陽性，作為間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的pdgfra是陰性，作為肝細(xì)胞標(biāo)志物的alb是陰性。本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)可分化為肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、腸細(xì)胞等的器官細(xì)胞。向肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞或腸細(xì)胞的分化誘導(dǎo)可用后述的實(shí)施例中記載的方法實(shí)施。器官細(xì)胞是肝細(xì)胞時(shí)，例如，可在fbs、hgf、osm及dex的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的pgecs而向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)(參照后述的實(shí)施例)。器官細(xì)胞是胰腺細(xì)胞時(shí)，例如，可在l-谷氨酰胺、葡萄糖、抗壞血酸、sb431542、2-m胰島素及煙酰胺的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的pgecs而向胰腺細(xì)胞分化誘導(dǎo)(參照后述的實(shí)施例)。器官細(xì)胞是腸細(xì)胞時(shí)，例如，可在b27、r-反應(yīng)蛋白1、頭蛋白及egf的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的pgecs而向腸細(xì)胞分化誘導(dǎo)(參照后述的實(shí)施例)。本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)能冷凍保存。冷凍保存的時(shí)機(jī)無特別限定，優(yōu)選為，傳代次數(shù)1～20次之后，更優(yōu)選為，傳代次數(shù)2～10次之后。基于一般的細(xì)胞冷凍－解凍的方法即可是本細(xì)胞的益處，但特別是，迅速地進(jìn)行在與保存用溶劑混合之后至冷凍的作業(yè)、及，融解保存后的冷凍細(xì)胞時(shí)的操作是重要的。本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)由于能冷凍保存，在制造在臨床－藥物開發(fā)應(yīng)用中使用的來源于內(nèi)胚層的細(xì)胞－組織－器官時(shí)，能作為工作細(xì)胞庫的利用。從而，本發(fā)明提供將pgecs細(xì)胞在任意的階段冷凍－保存，構(gòu)建用于制造器官細(xì)胞的工作細(xì)胞庫的方法。為了制作本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)，在第1階段，在rock抑制物的存在下，在第2階段，在激活素a及wnt3a的存在下，在第3階段，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，在第4階段，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，將多能性干細(xì)胞在飼養(yǎng)細(xì)胞非存在下培養(yǎng)而使分化之后，實(shí)施至少1次以上傳代即可，例如，以培養(yǎng)初日作為第0天，在第0天，在rock抑制物的存在下，在第1天，在激活素a及wnt3a的存在下，在第2天-第3天，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，在第4天-第5天，在bmp4、bfgf、vegf及激活素a的存在下，在飼養(yǎng)細(xì)胞非存在下培養(yǎng)多能性干細(xì)胞而使分化之后，實(shí)施至少1次以上傳代即可，本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)的制作方法不限于此方法。另外，作為培養(yǎng)基，使用sfd培養(yǎng)基、rpmi培養(yǎng)基、其組合等即可。對(duì)于傳代如前所述。細(xì)胞的培養(yǎng)用37℃，5％co2的培養(yǎng)用溫育器進(jìn)行即可。作為本發(fā)明的實(shí)施的實(shí)施方式，例如，對(duì)向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加rock抑制物(1-20μm、優(yōu)選為，10μm)的培養(yǎng)基接種多能性干細(xì)胞(2～6×105個(gè))(第0天)、培養(yǎng)1天之后，用向sfd培養(yǎng)基(1.5-4ml、優(yōu)選為，2ml)添加wnt3a(1-100ng/ml、優(yōu)選為，50ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換(第1天)、再者培養(yǎng)1天。接下來，用將sfd培養(yǎng)基和rpmi1640培養(yǎng)基以1:1～1:10(優(yōu)選為，1:9)的比例混合，向該培養(yǎng)基添加bmp4(0.5-4ng/ml、優(yōu)選為，2ng/ml)、bfgf(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(5-50ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天(第2天-第3天)。其后還用向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加bmp4(0.5-5ng/ml、優(yōu)選為，2ng/ml)、bfgf(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(8-20ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天(第4天-第5天)。以培養(yǎng)后的細(xì)胞作為p0細(xì)胞(第0代)，進(jìn)行傳代。例如，向pge維持培養(yǎng)基接種p0細(xì)胞(500～4×105個(gè)、優(yōu)選為，1×105個(gè))，其后，每3～4天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。pge維持培養(yǎng)基是向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加fgf2(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(8-20ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)、egf(10-40ng/ml、優(yōu)選為，20ng/ml)、a83-01(0.1-1μm、優(yōu)選為，0.5μm)、chir99021(1-5μm、優(yōu)選為，3μm)的培養(yǎng)基。作為本發(fā)明的別的實(shí)施的實(shí)施方式，例如，對(duì)向添加了b27(2％)的rpmi/1640培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加rock抑制物(1-20μm、優(yōu)選為，10μm)的培養(yǎng)基接種多能性干細(xì)胞(2～6×105個(gè))(第0天)、培養(yǎng)1天之后，用向添加了b27(2％)的rpmi/1640培養(yǎng)基(1.5-4ml、優(yōu)選為，2ml)添加wnt3a(1-100ng/ml、優(yōu)選為，50ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換(第1天)、再者培養(yǎng)1天。接下來，用向添加了b27(2％)的rpmi/1640培養(yǎng)基(1.5-4ml、優(yōu)選為，2ml)添加bmp4(0.5-4ng/ml、優(yōu)選為，2ng/ml)、bfgf(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(5-50ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天(第2天-第3天)。其后還用向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加bmp4(0.5-5ng/ml、優(yōu)選為，2ng/ml)、bfgf(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(8-20ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)及激活素a(50-150ng/ml、優(yōu)選為，100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天(第4天-第5天或第4天)。以培養(yǎng)后的細(xì)胞作為p0細(xì)胞(第0代)，進(jìn)行傳代。例如，向pge維持培養(yǎng)基接種p0細(xì)胞(500～4×105個(gè)、優(yōu)選為，1×105個(gè))，其后，每3～4天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。pge維持培養(yǎng)基是向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加fgf2(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(8-20ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)、egf(10-40ng/ml、優(yōu)選為，20ng/ml)、a83-01(0.1-1μm、優(yōu)選為，0.5μm)、chir99021(1-5μm、優(yōu)選為，3μm)的培養(yǎng)基。另外，為了擴(kuò)增本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)，傳代后的第1階段或傳代初日在rock抑制物的存在下，其后在sfd、fgf2、vegf、egf、a83-01及chir99021的存在下培養(yǎng)即可，例如，以傳代后的培養(yǎng)初日作為第0天，在第0天，在rock抑制物的存在下，其后通過在sfd、fgf2、vegf、egf、a83-01及chir99021的存在下培養(yǎng)，擴(kuò)增即可，本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)的擴(kuò)增方法不限于此方法。細(xì)胞的培養(yǎng)用37℃，5％co2的培養(yǎng)用溫育器進(jìn)行即可。作為本發(fā)明的實(shí)施的實(shí)施方式，例如，以傳代后的培養(yǎng)初日或傳代初日作為第0天，向添加了rock抑制物(1-100μm、優(yōu)選為，10μm)的pge維持培養(yǎng)基接種pgec細(xì)胞(500～4×105個(gè)、優(yōu)選為，1×105個(gè))(第0天)、次日用pge維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換。每3～4天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。pge維持培養(yǎng)基是向sfd培養(yǎng)基(1.5-2ml、優(yōu)選為，2ml)添加fgf2(5-10ng/ml、優(yōu)選為，5ng/ml)、vegf(8-20ng/ml、優(yōu)選為，10ng/ml)、egf(10-40ng/ml、優(yōu)選為，20ng/ml)、a83-01(0.1-1μm、優(yōu)選為，0.5μm)、chir99021(1-5μm、優(yōu)選為，3μm)的培養(yǎng)基。為了制作及/或擴(kuò)增本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)，在凝膠等的支持體上進(jìn)行培養(yǎng)即可。作為支持體，優(yōu)選使用稀釋30倍基質(zhì)膠，但不限于此。作為其他支持體，例如，可例示層粘連蛋白及其衍生物、玻連蛋白、瓊脂糖凝膠、丙烯酰胺凝膠、水凝膠、膠原凝膠、氨基甲酸酯凝膠等。另外，本發(fā)明也提供使用本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)制作肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、腸細(xì)胞等的器官細(xì)胞的方法。向肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞或腸細(xì)胞的分化誘導(dǎo)可用后述的實(shí)施例中記載的方法實(shí)施。器官細(xì)胞是肝細(xì)胞時(shí)，例如，可在fbs、hgf、osm及dex的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的pgecs而向肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)(參照后述的實(shí)施例)。器官細(xì)胞是胰腺細(xì)胞時(shí)，例如，可在l-谷氨酰胺、葡萄糖、抗壞血酸、sb431542、2-m胰島素及煙酰胺的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的pgecs而向胰腺細(xì)胞分化誘導(dǎo)(參照后述的實(shí)施例)。器官細(xì)胞是腸細(xì)胞時(shí)，例如，可在b27、r-反應(yīng)蛋白1、頭蛋白及egf的存在下培養(yǎng)本發(fā)明的pgecs而向腸細(xì)胞分化誘導(dǎo)(參照后述的實(shí)施例)。本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)也可向肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞及腸細(xì)胞以外的器官細(xì)胞、例如，肺細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、消化管分泌腺細(xì)胞、腹膜細(xì)胞、胸膜細(xì)胞、喉頭細(xì)胞、耳管－氣管－支氣管細(xì)胞、尿路細(xì)胞分化。為了從本發(fā)明的細(xì)胞分化誘導(dǎo)器官細(xì)胞，將本發(fā)明的細(xì)胞在凝膠等的支持體上培養(yǎng)即可。作為支持體，在嘗試在平面的分化誘導(dǎo)時(shí)，優(yōu)選使用稀釋30倍基質(zhì)膠，在嘗試由立體器官原基制作的分化誘導(dǎo)時(shí)，優(yōu)選使用凝膠(例如，原液稀釋～4倍基質(zhì)膠(注冊(cè)商標(biāo))、瓊脂糖凝膠、丙烯酰胺凝膠、水凝膠、膠原凝膠、氨基甲酸酯凝膠等)，不限于此。從本發(fā)明的細(xì)胞分化誘導(dǎo)的器官細(xì)胞除了功能性高之外，還除了是從以往的多能性干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的之外，均質(zhì)性也極高(參照后述的實(shí)施例)?？墒褂脧谋景l(fā)明的細(xì)胞(pgecs)制作的器官細(xì)胞而制作組織或器官。例如，將從本發(fā)明的細(xì)胞(pgecs)制作的器官細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，制作器官芽，通過將其移植到生物體內(nèi)，可制作組織或器官(takebe，etal.nature，499：481-484，2013(非專利文獻(xiàn)1)、wo2013/047639：組織及器官的制作方法(專利文獻(xiàn)1))?！緦?shí)施例】以下，由實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明?！矊?shí)施例1〕從ips細(xì)胞擴(kuò)增pgec的方法〔實(shí)驗(yàn)方法〕將在基質(zhì)膠包被上培養(yǎng)的ips細(xì)胞(從臍帶獨(dú)自建立的ips細(xì)胞、及tkda3(由東京大學(xué)提供))由accutase剝離回收。使用向sfd培養(yǎng)基添加rock抑制物(10μm)的培養(yǎng)基向進(jìn)行基質(zhì)膠包被的6孔板接種2～6×105個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)1天。培養(yǎng)后，用向sfd培養(yǎng)基添加wnt3a(50ng/ml)及激活素a(100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，再者培養(yǎng)1天。接下來，用將sfd培養(yǎng)基和rpmi1640培養(yǎng)基以1:9的比例混合，向該培養(yǎng)基添加bmp4(0.5ng/ml)、bfgf(5g/ml)、vegf(10ng/ml)及激活素a(100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天。其后還用向sfd培養(yǎng)基添加bmp4(0.5ng/ml)、bfgf(5ng/ml)、vegf(10ng/ml)及激活素a(100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天。以培養(yǎng)后的細(xì)胞作為pgep0，用pge維持培養(yǎng)基進(jìn)行傳代。用accutase剝離pgep0的細(xì)胞，回收p0細(xì)胞。將回收的細(xì)胞的2/3量的細(xì)胞使用添加rock抑制物(10μm)的pge維持培養(yǎng)基接種到基質(zhì)膠包被的6孔板上。次日，再回收細(xì)胞，使用添加rock抑制物(10μm)的pge維持培養(yǎng)基60mm向皿全量接種。次日觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞在80％匯合以下時(shí)，用pge維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，當(dāng)細(xì)胞在80％匯合以上時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代至p5優(yōu)選以1/3～1/2的比例進(jìn)行傳代。當(dāng)增殖快速時(shí)，其以下也可。傳代時(shí)使用向包被基質(zhì)膠的皿添加rock抑制物(10nm)的pge維持培養(yǎng)基而接種細(xì)胞，次日用pge維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換。培養(yǎng)基更換每3～4天進(jìn)行1次。向100mm皿以3×105個(gè)細(xì)胞/皿接種，則在3～4天達(dá)到匯合。但是，傳代的時(shí)機(jī)則是一邊確認(rèn)此時(shí)的細(xì)胞的狀態(tài)，一邊使時(shí)機(jī)最適化。※需要說明的是，上述在pge分化誘導(dǎo)及肝臟分化誘導(dǎo)中使用的試劑示于以下的表1～3?！颈?】在pge分化誘導(dǎo)及肝臟分化誘導(dǎo)中使用的試劑一覽【2.對(duì)于pge分化誘導(dǎo)及維持必要的培養(yǎng)基的調(diào)制】調(diào)制對(duì)于pge分化誘導(dǎo)及pge維持必要的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(以下sfd培養(yǎng)基)及pge維持培養(yǎng)基。在表2及表3示sfd培養(yǎng)基、pge維持培養(yǎng)基的組成?！颈?】sfd培養(yǎng)基試劑容量imdm500mlf12160mlmtg6.6mln23.3mlb273.3mlasp660μl【表3】pge維持培養(yǎng)基(以向sfd培養(yǎng)基添加下述因子的作為pge維持培養(yǎng)基)試劑最終濃度a83-010.5μmchir3μmvegf10ng/mlegf20ng/mlfgf25ng/ml【3.基質(zhì)膠包被】將基質(zhì)膠生長因子reduce用rpmi稀釋至1/30。根據(jù)下述表4向培養(yǎng)皿加必要量的稀釋的溶液，全面鋪皿。于室溫放置約2小時(shí)。將稀釋溶液回收到管中，加與稀釋溶液等量rpmi(以此包被作業(yè)作為以下基質(zhì)膠包被)。稀釋液能使用至第3次。接種細(xì)胞時(shí)進(jìn)行基質(zhì)膠包被。【表4】稀釋液必要量培養(yǎng)皿稀釋液量6孔板2ml60mm皿2ml100mm皿5ml【4.pgec細(xì)胞的冷凍保存和解凍法】【冷凍保存】在pgec達(dá)到90％匯合的狀態(tài)下(每100mm皿3～4×106個(gè)細(xì)胞左右)、每100-mm皿用3ml無菌無ca+/mg+pbs清洗。其后，加1.5mlaccutase，在37℃、5％co2溫育器之中進(jìn)行2～5分鐘處理。其后，立即用9ml的dmem-f12中和之后回收到50ml的conical管中。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)之后，以80～90g進(jìn)行5min離心分離。在廢棄上清之后，用調(diào)制的cellbanker(cellblanker-1)良好懸浮至成每5×105個(gè)細(xì)胞1ml，將各1ml的細(xì)胞懸浮液移到冷凍保存用管。將管搭載到裝滿異丙醇的1℃的冷凍用容器(確認(rèn)蓋恰好關(guān)閉)、于-80℃的冰箱靜置1天。次日，移動(dòng)到液氮箱，進(jìn)行保存。在本法中能進(jìn)行長期的保存，認(rèn)為2年以上的保存是可能的?！窘鈨觥咳〕鲎砸旱淙〕龅姆湃雙gec的冷凍管，用預(yù)先設(shè)定于37℃的水浴急速融解。在冷凍細(xì)胞即將完全地解凍時(shí)(<1分鐘以內(nèi))，從水浴取出，立即在安全柜之中用70％乙醇擦拭周圍之后，將細(xì)胞與預(yù)先溫的9ml的dmem-f12一同移到離心用conical管中。由80～90g進(jìn)行5分鐘的離心清洗，用調(diào)制成每2×104個(gè)細(xì)胞1ml的放入10μmrock抑制物的pge維持培養(yǎng)基懸浮、向基質(zhì)膠(生長因子減少的)(1:30的稀釋)包被的100mm皿進(jìn)行接種至全量達(dá)10ml(＝2×105個(gè)細(xì)胞/100mm皿)。用37℃、5％co2溫育器進(jìn)行培養(yǎng)，次日起用pge維持培養(yǎng)基(rock抑制物無)每隔2天進(jìn)行更換培養(yǎng)基而使增殖?！矊?shí)驗(yàn)結(jié)果〕(1)顯示本實(shí)施例中的概要(圖1)。由本發(fā)明擴(kuò)增的細(xì)胞，相比被稱為定形內(nèi)胚層(d'amour，k.a.etal.efficientdifferentiationofhumanembryonicstemcellstodefinitiveendoderm.naturebiotechnology23，1534-1541(2005).、iwashita，h.etal.secretedcerberus1asamarkerforquantificationofdefinitiveendodermdifferentiationofthepluripotentstemcells.plosone8，e64291(2013).、si-tayeb，k.etal.highlyefficientgenerationofhumanhepatocyte-likecellsfrominducedpluripotentstemcells.hepatology51，297-305(2010).)或內(nèi)胚層祖細(xì)胞(cheng，x.etal.self-renewingendodermalprogenitorlinesgeneratedfromhumanpluripotentstemcells.cellstemcell10，371-384(2012).)的細(xì)胞，是作為(向腸道系統(tǒng))分化的更下游的細(xì)胞的稱為原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(pgec)的細(xì)胞。本細(xì)胞是能分化為來源于內(nèi)胚層的全部細(xì)胞的細(xì)胞。(2)從人ips細(xì)胞未夾傳代的pgec的初期分化誘導(dǎo)過程的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(圖2)。由集落的形態(tài)·oct4，sox2的免疫染色確認(rèn)(第0天)充分地保持人ips細(xì)胞的未分化性。接下來，使保持未分化狀態(tài)的ips細(xì)胞依次暴露于激活素a及記載的分化因子，進(jìn)行向定形內(nèi)胚層的誘導(dǎo)。在第6天，向多個(gè)細(xì)胞有肥大化的核的鋪路石狀的定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化誘導(dǎo)。(3)在pgec的傳代后立即的rock抑制物的有用性的探討(圖3)。照片(圖3上)是對(duì)熒光標(biāo)記的pgec細(xì)胞進(jìn)行傳代，進(jìn)行對(duì)在第3天時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)皿的全景攝影。對(duì)使用aavs1：：egfp-ips細(xì)胞(tkda)誘導(dǎo)的pgec進(jìn)行傳代之后，由egfp的熒光實(shí)施生存－粘接－增殖的評(píng)價(jià)。在接種的初日添加rock抑制物而細(xì)胞的生存－粘接亢進(jìn)。一方面，在rock抑制物非存在下，多數(shù)細(xì)胞無法生存(圖3，上)。在接種后第3天對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果，在rock抑制物暴露組中細(xì)胞數(shù)顯著多，認(rèn)為增殖亢進(jìn)(圖3，下)。橫軸示每孔的數(shù)據(jù)(n)。(4)對(duì)于傳代后的pgec的擴(kuò)增有用的液性因子的探討(圖4，5)。將誘導(dǎo)的定形內(nèi)胚層細(xì)胞在組合不同的細(xì)胞因子－低分子量化合物的培養(yǎng)基條件下進(jìn)行培養(yǎng)，探索最適的條件。在第3天得到的細(xì)胞的形態(tài)示于圖4，表達(dá)基因的解析的結(jié)果示于圖5左、細(xì)胞數(shù)示于圖5右。結(jié)果，為了細(xì)胞良好地增殖，需要chir99021，并且，為了誘導(dǎo)原始腸內(nèi)胚層(pgec)標(biāo)志物(cdx2)陽性－定形內(nèi)胚層標(biāo)志物(cxcr4·cer1)陰性的細(xì)胞，需要fgf2，bmp4，vegf，chir99021及a83-01。從而確證，在pgec的誘導(dǎo)中，fgf2，bmp4，vegf，chir99021及a83-01是必須的。＊p1表示第1代、m1-m8表示培養(yǎng)基組成的差異(#1-#8)。各培養(yǎng)基組成如照片下方所示。(5)重復(fù)傳代培養(yǎng)的pgec的形態(tài)學(xué)觀察(圖6)。圖6上段示在pgec-p1，p10，p20的時(shí)間點(diǎn)傳代后第5天的培養(yǎng)細(xì)胞的觀察結(jié)果。在fgf2，bmp4，vegf，chir99021及a83-01的存在下進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果確認(rèn)，即使是重復(fù)傳代20次以上的狀態(tài)，增殖繼續(xù)的同時(shí)，保持pgec特征性的上皮狀的結(jié)構(gòu)。圖6下段示在p5的階段，在傳代后第1天～第5天之間增殖的過程。＊p1表示第1代、m1-m8表示培養(yǎng)基組成的差異(#1-#8)。各培養(yǎng)基組成如照片下方所示。另外得知，本細(xì)胞能以方法中記載的順序，在任意的時(shí)機(jī)冷凍保存，對(duì)在p10時(shí)間點(diǎn)保存3個(gè)月間的細(xì)胞進(jìn)行解凍后，能再傳代20次程度的擴(kuò)增(圖7)。圖7上段示在p10時(shí)間點(diǎn)追加冷凍保存－解凍的pgec，將經(jīng)1次傳代(p1)，10次傳代(p10)，20次傳代(p20)的在第0天擴(kuò)增之后的形態(tài)。確認(rèn)在任何中，也可與未夾冷凍保存的pgec同樣的上皮狀的細(xì)胞增殖。圖7下段示在p10時(shí)間點(diǎn)將冷凍保存－解凍的pgec經(jīng)5次傳代(p5)的于第1，3，5天擴(kuò)增之后的形態(tài)。確證對(duì)于增殖能也良好地保持。(6)人ips細(xì)胞來源pgec的增殖曲線(圖8、左)和細(xì)胞倍增時(shí)間(圖8、右)。從本結(jié)果，能傳代至少20次以上，冷凍(stock)之后，這些也能傳代20次以上。(7)在傳代前(p0)及傳代后(p5，10，15，20)的pgec標(biāo)志物的表達(dá)基因的解析。傳代后(p5，10，15，20)的細(xì)胞是cdx2+/cer1-/cxcr-(圖9)。作為內(nèi)胚層標(biāo)志物的sox17，foxa2被維持。作為內(nèi)胚層標(biāo)志物的gata4不維持。(8)在傳代前(p0)及傳代后(p1，10，15，20)的細(xì)胞的特性解析。facs(flowcytometry)解析的結(jié)果，傳代前(p0，第5天)的細(xì)胞大部分是作為內(nèi)胚層祖細(xì)胞或定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的c-kit、cxcr4共陽性，與此相對(duì)，傳代后(p5，15)的細(xì)胞是陰性(圖10)。作為pgec標(biāo)志物的cdx2的免疫染色的結(jié)果，在傳代前(p0)確認(rèn)不到表達(dá)，與此相對(duì)，傳代后(p1，10，15)維持陽性(圖11)。一方面，作為內(nèi)胚層標(biāo)志物的foxa2、sox17、hnf4a是陽性。再者，作為多能性干細(xì)胞標(biāo)志物的nanog、oct4是陰性(圖12)。(9)在共培養(yǎng)時(shí)(huvecs(lonza，cat.no.191027)，hmscs(lonza，cat.no.pt-2501))，在作為培養(yǎng)液，不是內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，而使用肝細(xì)胞培養(yǎng)基(xenotech)、或者添加bmp4及fgf2的肝細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(hepatology,51(1),297-305,2010)時(shí)，確認(rèn)不到肝芽特征性的基因表達(dá)的增強(qiáng)(alb、ttr等)?！矊?shí)施例2〕由微陣列解析的分化階段的詳細(xì)解析〔實(shí)驗(yàn)方法〕總rna使用rneasyminikit(qiagen，valencia，ca)，從人ipsc-pgec來源細(xì)胞(從pgec(p0)、pgec(p1～p16的各種細(xì)胞)及pgec分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞(pgec-mh)(在后述的實(shí)施例3中分化誘導(dǎo)的細(xì)胞))調(diào)制。作為對(duì)照組，解析從人ipsc來源細(xì)胞(hipsc，ipsc-de(定形內(nèi)胚層)，ipsc-he(肝內(nèi)胚層)ipsc-ih(不成熟的肝細(xì)胞)、ipsc-mh(成熟的肝細(xì)胞)，ipsc-lb(肝芽)(各細(xì)胞的定義在以下的2個(gè)論文中記載：si-tayeb，k.etal.highlyefficientgenerationofhumanhepatocyte-likecellsfrominducedpluripotentstemcells.hepatology51，297-305(2010).、takebe，t.etal.vascularizedandfunctionalhumanliverfromanipsc-derivedorganbudtransplant.nature499，481-484(2013).、takebe，t.etal.generationofavascularizedandfunctionalhumanliverfromanipsc-derivedorganbudtransplant.natureprotocols9，396-409(2014))及人成體肝臟(lotno.：b308121、biochaininstitute、hayward，ca，usa)得到的rna。擴(kuò)增crna，使用lowinputquickamplabelingkit(agilenttechnologies，paloalto，ca)進(jìn)行標(biāo)記，根據(jù)生產(chǎn)商的指示雜交于44k的60寡聚體微陣列(人基因表達(dá)4×44kv2微陣列試劑盒，agilenttechnologies)。將雜交的微陣列載玻片使用agilenthigh-resolutionmicroarrayscanner掃描。使用featureextractionsoftware版本10.7.3.1(agilenttechnologies)而計(jì)算相對(duì)雜交強(qiáng)度及背景雜交值。根據(jù)agilenttechnologies推薦的順序使用genespring11.5.1software中的標(biāo)志基準(zhǔn)，將生的信號(hào)強(qiáng)度及各探針的標(biāo)志從雜交強(qiáng)度及斑信息計(jì)算。再者，對(duì)樣品的生信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行l(wèi)og2變換，由變位值算法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。我們?cè)谌繕悠飞?，除“妥協(xié)的”(compromised)標(biāo)志外選擇探針，作為檢測(cè)到的基因，得到34、183個(gè)的探針。從得到的表達(dá)數(shù)據(jù)，使用75％shiftile&median修正的數(shù)據(jù)，由主成分解析、階層的聚類法分類樣品的分化階段?！矊?shí)驗(yàn)結(jié)果〕示主成分解析的結(jié)果(圖13)及階層性聚類的結(jié)果(圖14)。確證傳代前的pgec(p0)是相當(dāng)于ipsc-de(定形內(nèi)胚層或內(nèi)胚層祖細(xì)胞)的細(xì)胞。一方面，傳代后(p1～p15)的細(xì)胞是接近于ipsc-he的分化階段的細(xì)胞，表示它們是進(jìn)一步分化的ipsc-mh或處于pgec-mh以前的分化狀態(tài)。從以上知，通過夾哪怕一次傳代而擴(kuò)增的細(xì)胞是位于ipsc-de和ipsc-he的中間的分化階段的細(xì)胞?！矊?shí)施例3〕從pgec向肝細(xì)胞的分化〔實(shí)驗(yàn)方法〕將pgec(p6)使用添加rock抑制物(10μm)的pge維持培養(yǎng)基接種到基質(zhì)膠包被的皿上至次日達(dá)60～100％匯合。次日，確認(rèn)細(xì)胞60～100％匯合，用向pge維持培養(yǎng)基添加激活素(100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天(pgec-2d)。(60％匯合以下的情況中在pge維持培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)至60％匯合以上。)培養(yǎng)后，用向sfd培養(yǎng)基添加dm31898(250nm)、iwp2(4μm)、pd0325901(500nm)及ra(2μm)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換而培養(yǎng)1天。再者，用向sfd培養(yǎng)基添加a-83-01(1μm)、bmp4(10ng/ml)、iwp2(4μm)、及ra(2μm)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)3天(pgec-he)。其后，用向敲除d-mem培養(yǎng)基添加20％ksr、1％dmso、1％neaa、2-me(0.1mm)及l(fā)-谷氨酰胺(1mm)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換培養(yǎng)3天。接下來，調(diào)制除egf的hcm，用向該培養(yǎng)基添加5％fbs、hgf(20ng/ml)、osm(20ng/ml)及dex(100nm)的培養(yǎng)基培養(yǎng)8天，進(jìn)行向肝細(xì)胞(pgec-mh)終末分化誘導(dǎo)?！矊?shí)驗(yàn)結(jié)果〕(1)將擴(kuò)增的pgec(p6)階段性地分化誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的形態(tài)變化(圖15-1、上段)和表達(dá)基因的解析(圖15-1、下段)。確認(rèn)進(jìn)行終末分化的pgec-mh示肝細(xì)胞樣的形態(tài)，肝細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)增強(qiáng)。pgec-mh在免疫染色的結(jié)果確認(rèn)肝細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。再者，從icg試驗(yàn)確證，pas染色的結(jié)果也是具有代謝功能的干細(xì)胞(圖16，上段)。(2)通常，自ipsc誘導(dǎo)的肝細(xì)胞難以均質(zhì)地分化誘導(dǎo)，自pgec分化的細(xì)胞能向有均質(zhì)的形態(tài)學(xué)特征的肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)(圖15-2)。從而，基因表達(dá)解析的結(jié)果，得知與由ipsc誘導(dǎo)的mh(ipsc-mh)比較，在pgec-mh中肝細(xì)胞標(biāo)志物顯著高表達(dá)(圖16、下段)。(3)傳代后的pgec的肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)能的探討(圖17)。形態(tài)學(xué)解析的結(jié)果，得知重復(fù)傳代之后也再現(xiàn)性好，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞(圖17-1)。再者，表達(dá)基因的解析及由elisa的蛋白質(zhì)分泌功能解析的結(jié)果確證，重復(fù)傳代之后也發(fā)揮高的肝細(xì)胞功能，得知它們即使與ipsc-mh比較也顯著地高(圖17-2)。令人興趣深的是，與pgec(p0)比較，pgec(p5，10)的alb分泌能高，認(rèn)為向肝細(xì)胞的分化能高(圖17-2、右)。〔實(shí)施例4〕從pgec向胰腺細(xì)胞的分化〔實(shí)驗(yàn)方法〕使用pgec的胰腺細(xì)胞的階段性誘導(dǎo)的方法(圖18)。將進(jìn)行擴(kuò)增的pgec使用添加rock抑制物(10nm)的pgec維持培養(yǎng)基接種到基質(zhì)膠包被的皿上至次日接種密度達(dá)60～100％左右。次日，確認(rèn)細(xì)胞達(dá)60～100％匯合，用向pgec維持培養(yǎng)基添加激活素(100ng/ml)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)2天。(60％匯合以下的情況中在pge維持培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)至60％匯合以上。)培養(yǎng)后，用向dmem(high葡萄糖)培養(yǎng)基添加l-谷氨酰胺(2mm)、b27(1％)、抗壞血酸(50μg/ml)、頭蛋白(25ng/ml)、a83-01(1μm)、ra(2μm)、環(huán)巴胺(0.25μm)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)3天。再者，用向dmem(高葡萄糖)培養(yǎng)基添加l-谷氨酰胺(2mm)、b27(1％)、抗壞血酸(50μg/ml)、頭蛋白(25ng/ml)、sb431542(6μm)、胰島素(800pm)及煙酰胺(10mm)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)基更換，培養(yǎng)1天。其后，用向dmem(高葡萄糖)培養(yǎng)基添加l-谷氨酰胺(2mm)、葡萄糖(20mm)、抗壞血酸(50μg/ml)、sb431542(6μm)、2-m胰島素(800pm)及煙酰胺(10mm)的培養(yǎng)基培養(yǎng)12天，進(jìn)行向胰腺細(xì)胞終末分化誘導(dǎo)?！矊?shí)驗(yàn)結(jié)果〕(1)從pgec階段性地誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)解析(圖18)。記載了從pgec向胰腺細(xì)胞、特別，胰島素分泌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)流程(圖18)。通過將pge-2d在頭蛋白、kaad-環(huán)巴胺、視黃酸(ncr)存在下培養(yǎng)三天，誘導(dǎo)pdx1陽性的胰腺前體細(xì)胞。再者，在第6天～第12天，用含b27等記載的因子的h21(high葡萄糖)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在12天的階段確認(rèn)誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞。(2)免疫染色的結(jié)果，pgec由胰腺細(xì)胞向作為胰腺前體細(xì)胞標(biāo)志物的pdx1、作為內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物的胰島素，glucagon，somatostatin、作為外分泌細(xì)胞標(biāo)志物的amylase陽性的細(xì)胞分化誘導(dǎo)(圖19)。(3)表達(dá)基因的解析的結(jié)果，胰島素、pdx1的表達(dá)增強(qiáng)，確認(rèn)了向β細(xì)胞的分化誘導(dǎo)(圖20)?！矊?shí)施例5〕從pgec向腸組織的分化〔實(shí)驗(yàn)方法〕使用pgec的腸組織的階段性誘導(dǎo)的方法(圖21)。將進(jìn)行擴(kuò)增的pgec使用添加rock抑制物(10nm)的pgec維持培養(yǎng)基，如圖21所示，在預(yù)先包被含b271％、r-反應(yīng)蛋白1(500ng/ml)、頭蛋白(100ng/ml)、egf(50ng/ml)的基質(zhì)膠的皿上進(jìn)行接種。其后，在細(xì)胞接種后，再次添加含b271％、r-反應(yīng)蛋白1(500ng/ml)、頭蛋白(100ng/ml)、egf(50ng/ml)的基質(zhì)膠，在包埋之上，在第1～22天，用各含有pen/strep、l-谷氨酰胺、b272ml/50ml、hepes(15mm)、r-反應(yīng)蛋白1(500ng/ml)、頭蛋白(100ng/ml)、egf(100ng/ml)的dmem/f12高級(jí)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在第22天，再次、通過將含b271％、r-反應(yīng)蛋白1(500ng/ml)、頭蛋白(100ng/ml)、egf(50ng/ml)的基質(zhì)膠從上添加－包埋，用同樣的培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行腸組織的誘導(dǎo)。每2天進(jìn)行1次培養(yǎng)基更換。得到的組織在任意的時(shí)機(jī)分散，通過以同樣的順序再接種可得到腸組織。再者，為了誘導(dǎo)腸組織必要的pgec的細(xì)胞數(shù)能從單一乃至多個(gè)的任何制作?！矊?shí)驗(yàn)結(jié)果〕(1)從pgec的腸組織誘導(dǎo)流程(圖21)(2)顯微鏡觀察的結(jié)果，得知由單一細(xì)胞培養(yǎng)的pgec向確認(rèn)多個(gè)鋪滿積層化的上皮的立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)的腸組織分化誘導(dǎo)(圖22)。在實(shí)施例1～4中使用的各種的測(cè)定方法?！ば螒B(tài)學(xué)觀察方法：圖2、4、6、15-1上、15-2、17-1、18由位相差顯微鏡(olympus)進(jìn)行觀察。·標(biāo)志物的表達(dá)基因的解析：圖5、9、15-1下、16-1、20定量實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄pcr(qrt-pcr)使用lightcyclera480system(roche)·lightcyclera480sybrgreenimastermix(roche)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?！ぜ?xì)胞的增殖曲線：圖8左增殖曲線通過傳代－接種后立即進(jìn)行接種至成105個(gè)細(xì)胞/孔(6孔板)(d0)，在3天后重復(fù)剝離細(xì)胞而對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的操作制成?！ぜ?xì)胞倍化時(shí)間：圖8右：從在通過由增殖曲線1次近似得到的近似曲線中的斜率，通過集中在任意的2個(gè)時(shí)機(jī)的細(xì)胞數(shù)，代入以下的計(jì)算式求出。((t2-t1)/3.32×(logn2-logn1)其中t是時(shí)間，且n是細(xì)胞數(shù)。)·facs解析：圖10facs解析用takebe，t.etal.vascularizedandfunctionalhumanliverfromanipsc-derivedorganbudtransplant.nature499，481-484(2013)所述的方法實(shí)施。將剝離的細(xì)胞(定形內(nèi)胚層/pgec)用熒光綴合物單克隆抗體(mabs)于4℃、30分鐘、暗室溫育之后，用含2％fbs的pbs清洗之后，由moflo(dakocytomation)進(jìn)行解析。使用的抗體如下：綴合別藻藍(lán)素(apc)的hcd117(hc-kitapc)；綴合藻紅蛋白(pe)的hcd184(hcxcr4pe)。·標(biāo)志物的免疫染色：圖11、12、16、19對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行甲醇·30分鐘－冰上固定，用10％正常山羊血清(ngs)進(jìn)行60分鐘封閉。接下來，添加第1抗體(1:200)之后，進(jìn)行4℃過夜。由pbs的清洗操作之后，將適宜的第二抗體(綴合alexa-488，-555，或-647的第二抗體(1:500；invitrogen))調(diào)制－添加，于室溫反應(yīng)60分鐘。進(jìn)行染色的細(xì)胞在進(jìn)行核染色(dapi)之后，用fa封固液進(jìn)行封入。照片用zeissaxioimager和顯微鏡進(jìn)行攝像。·pas染色：圖16右上將giemsa和高碘酸schiff(wako)染色根據(jù)附屬的說明書的方法進(jìn)行染色。·icg攝?。簣D16右下用dmso將貯存的cardiogreen試劑(sigmacat#i2633)稀釋至25mg/ml，在細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基(dmem)中稀釋至1mg/ml(工作濃度)。將培養(yǎng)中的pgec-mh于在先調(diào)制的dmem培養(yǎng)基(1mg/mlcardiogreen(500μl/24孔))中于37℃、溫育3～6小時(shí)。其后，在更換為通常的細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基之上，由顯微鏡觀察確認(rèn)icg的提取?！lb分泌能的測(cè)定：圖17右alb分泌的測(cè)定用takebe，t.etal.vascularizedandfunctionalhumanliverfromanipsc-derivedorganbudtransplant.nature499，481-484(2013)所述的方法實(shí)施。培養(yǎng)基更換后，回收第1天的培養(yǎng)基，使用人白蛋白elisa定量試劑盒(bethyllaboratories)，根據(jù)附屬的說明書的方法進(jìn)行測(cè)量?！矊?shí)施例6〕第1次傳代往后的特異性標(biāo)志物由實(shí)施例2記載的方法，從取得的全基因的表達(dá)網(wǎng)羅的的解析的結(jié)果，對(duì)于ipsc，de，pgec(p0)這3者，提取在pgec(p1往后)中特異性地最大表達(dá)增加或減少的基因(表5及，圖23)。即，顯示pgec(p1往后)的全樣品共同無高表達(dá)，示低表達(dá)的標(biāo)志物基因的列表?！颈?】〔實(shí)施例7〕從各種各樣的ips克隆的原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(pgec)的建立(圖24)(方法)由除了tkda3-4(實(shí)施例1的tkda3(由東京大學(xué)提供)的第4克隆)之外，在1231a3-、1383d2-、1383d6-、ff-01-、ff-06-(imatrix(層粘連蛋白；自株式會(huì)社nippi購入)上培養(yǎng)的ips細(xì)胞(在京都大學(xué)由末梢血建立的ips細(xì)胞))等的ips細(xì)胞克隆制作pgec。在pgec的制作中，有必要針對(duì)每個(gè)克隆優(yōu)化分化誘導(dǎo)期間。對(duì)于誘導(dǎo)法，參照表6?！颈?】(結(jié)果)誘導(dǎo)的原始腸內(nèi)胚層細(xì)胞(第0代的第5天)的顯微鏡觀察像示于圖24a。作為在誘導(dǎo)中使用的ips細(xì)胞，使用1231a3-、1383d2-、1383d6-、ff-01-、ff-06-的5種不同的克隆。ips克隆每的增殖曲線示于圖24b。來源于全部的克隆的pgec能進(jìn)行至少20次以上傳代－擴(kuò)增?！矊?shí)施例8〕進(jìn)行移植的pgec的內(nèi)胚層組織再構(gòu)建能(圖25)(方法)將從tkda3-4ips細(xì)胞克隆制作的100萬個(gè)的pgecs在免疫缺陷小鼠(不誘導(dǎo)肝障礙的狀態(tài)的tknog小鼠、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所(centralinstituteforexperimentalanimals))腎被膜下進(jìn)行移植。移植的組織在1個(gè)月后摘出，在肉眼觀察之后進(jìn)行組織學(xué)解析。(結(jié)果)摘出移植1個(gè)月后的組織的結(jié)果，確認(rèn)不到稱為明顯的奇形腫或癌等的腫瘤的形成(圖25a)。黑虛線：pgec來源的組織。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果，pgec來源的組織形成各種各樣的人內(nèi)胚層來源組織(圖25b)。即，顯示形成被肝臟－胰腺－腸道的標(biāo)志物染色的組織。比例尺＝50μm。〔實(shí)施例9〕pgec來源的肝芽的長期培養(yǎng)后功能表達(dá)的探討(圖26)(方法)使用低粘接性的培養(yǎng)板，從pgec(第5代的第5天)制作肝芽。在肝芽制作中，在將pgec來源細(xì)胞:臍帶來源靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec):間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)以10:7:1的比例混合之后，將lonza公司的hcm培養(yǎng)基、egm培養(yǎng)基以1:1混合的培養(yǎng)基中進(jìn)行分化誘導(dǎo)。在分化誘導(dǎo)后的pgec來源肝芽培養(yǎng)上清中的白蛋白濃度使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)定量試劑盒(bethyllaboratoriesinc.)評(píng)價(jià)。(結(jié)果)體外制成的pgec來源肝芽的顯微鏡觀察示于圖26a。比例尺＝50μm。pgec來源肝芽的白蛋白分泌能示于圖26b。人白蛋白從由hcm/egm的分化誘導(dǎo)第4天的階段起檢測(cè)。再者得知，與用pgec單獨(dú)進(jìn)行細(xì)胞塊培養(yǎng)(僅回收pgec，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔/24孔板的密度向呈細(xì)胞在底部集合的形狀的低粘接性的培養(yǎng)皿接種細(xì)胞之后，培養(yǎng)數(shù)天而得到的組織)的組織比較，顯示顯著地高的白蛋白分泌能。再者，在培養(yǎng)基條件不是hcm/egm，而是使用ko-dmem/egm時(shí)確認(rèn)不到白蛋白分泌?！矊?shí)施例10〕進(jìn)行分化誘導(dǎo)的pgec來源肝芽的氨代謝功能(圖27)(方法)進(jìn)行之后來源于進(jìn)行15次傳代培養(yǎng)的pgec的肝芽的分化誘導(dǎo)，向培養(yǎng)上清添加2mm的nh4cl。其后，在0hr、3hr、6hr、24hr的各時(shí)間點(diǎn)對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行采樣，將氨濃度由氨測(cè)試(wako)測(cè)定。(結(jié)果)得知進(jìn)行分化誘導(dǎo)的pgec來源肝芽有顯著的氨代謝功能(圖27)?！矊?shí)施例11〕對(duì)于劇癥肝功能衰竭模型的由pgec來源肝芽移植的治療效果(圖28)(方法)在8周齡的alb-treck/scid小鼠(由東京都醫(yī)學(xué)綜合研究所：tokyometropolitaninstituteofmedicalscience提供)腹腔內(nèi)，施用白喉毒素(dt：sigma,st.louis,mo,usa；d0564-1mg)(dtdose:1.5μg/kg)之后，以48小時(shí)后的ast值是8000iu/l以上確認(rèn)發(fā)生劇癥肝功能衰竭。關(guān)于滿足此條件的劇癥肝功能衰竭的小鼠個(gè)體，在麻醉下將來源于pgec細(xì)胞塊(n＝9)及pgec的肝芽(n＝8)移植到腎被膜下。移植組與作為非移植組的對(duì)照組(sham(n＝13))比較而對(duì)其生存率的改善效果進(jìn)行比較。(結(jié)果)在移植pgec來源細(xì)胞塊或肝芽的組中確證，與非移植組比較，生存率改善(圖28)。〔實(shí)施例12〕由免疫組織化學(xué)染色的向肝細(xì)胞－膽管上皮細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的確認(rèn)(圖29)(方法)向alb-treck/scid小鼠(圖28的實(shí)驗(yàn)的小鼠)的腎被膜下移植pgec來源肝芽后，回收形成的組織，解析肉眼所見及組織學(xué)所見。(結(jié)果)在移植1個(gè)月時(shí)間點(diǎn)中形成的pgec來源肝芽移植組織是血管化的組織。另外，確認(rèn)不到疑似奇形腫或惡性腫瘤的所見(圖29a)。從免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果確證形成了對(duì)人核特異性抗原、人白蛋白(肝細(xì)胞)、人ck7(膽管上皮細(xì)胞)、人cd31(血管)示染色性的肝組織(圖29b)。比例尺＝50μm。以在本說明書中引用的全部刊物、專利及專利申請(qǐng)作為直接參考并入本說明書。【工業(yè)實(shí)用性】由本發(fā)明高品質(zhì)并且穩(wěn)定調(diào)制成為用于制作組織－器官的材料的器官細(xì)胞變得可能。本發(fā)明的技術(shù)可向藥物開發(fā)篩選或再生醫(yī)療應(yīng)用。當(dāng)前第1頁12