相關(guān)專利申請的交叉引用

本申請要求2015年1月17日提交的題目為“引起免疫原性反應(yīng)降低的被修飾細胞”的美國臨時專利申請?zhí)?2/104,709的優(yōu)先權(quán)，所述臨時專利申請通過全文引用并入本文。

本公開涉及細胞治療。更具體地，本公開涉及引起免疫原性反應(yīng)降低的被修飾細胞。

背景技術(shù)：

干細胞具有自我更新和分化的能力。在某些條件下，干細胞可以分化成多種功能細胞。根據(jù)發(fā)育階段，干細胞可以分為胚胎干細胞(es細胞)和成體干細胞兩類：根據(jù)發(fā)展的潛力，干細胞可分為三類：全能干細胞(tsc)，多能干細胞和單能干細胞。干細胞未分化和未成熟，具有再生人類各種組織和器官的能力。

自20世紀90年代以來，人們已經(jīng)嘗試了幾種涉及干細胞的治療策略從而來治愈疾病。然而，對于臨床應(yīng)用基于干細胞的細胞替代療法，主要障礙仍然沒有克服(例如同種異體移植免疫排斥)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本文的實施方案涉及被修飾細胞，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞的主要組織相容性復(fù)合體ii(mhcii)較少。在此情況下，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞具有降低的免疫原性，而且被修飾細胞是被修飾的干細胞或源于該干細胞的細胞。

本文的實施方案進一步涉及制造被修飾干細胞用于生物移植的方法。該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該被修飾細胞，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞的mhcii較少。在此情況下，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞具有降低的免疫原性，而且被修飾細胞是被修飾的干細胞或源于該被修飾的干細胞的細胞。

本文的實施方案進一步涉及治療病癥的方法。該方法包括向受試者施用治療有效量的該被修飾細胞，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞的mhcii較少。在此情況下，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞具有降低的免疫原性，而且被修飾細胞是被修飾的干細胞或源于該干細胞的細胞。

在一些實施方案中，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞的mhcii的生物合成或轉(zhuǎn)運途徑的一個或多個基因的表達有所降低。

在一些實施方案中，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞上累積的mhcii量減少。

在一些實施方案中，被修飾干細胞的與mhcii的生物合成或運輸途徑相關(guān)的內(nèi)源基因有破壞。

在一些實施方案中，該破壞包括mhcii類反式激活因子(ciita)的破壞。

在一些實施方案中，該破壞源于至少部分ciita的缺失。

在一些實施方案中，mhcii包含人白細胞抗原ii(hlaii)。

在一些實施方案中，修飾的干細胞包括全能干細胞，多能干細胞，胚胎干細胞，誘導(dǎo)多能干細胞或多能干細胞中的至少一種。

在一些實施方案中，修飾的干細胞包含人胚胎干細胞。

在一些實施方案中，與相應(yīng)的野生型細胞相比，降低的免疫原性包括由被修飾細胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的死亡水平。

在一些實施方案中，被修飾細胞的核型與相應(yīng)野生型細胞的核型相同。

在一些實施方案中，被修飾細胞的多能性水平與相應(yīng)野生型細胞的多能性水平基本相同。

提供該發(fā)明內(nèi)容以用簡化的形式介紹以下具體實施方式中進一步描述的精選概念。該發(fā)明內(nèi)容并不旨在標識所要求保護的主題的關(guān)鍵特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保護的主題的范圍。

附圖說明

參照附圖描述具體實施方式。在不同附圖中使用相同的參考數(shù)字表示類似或相同的項目。

根據(jù)與hescs中ciita的破壞相關(guān)的實施方案，圖1示出了talens針對人ciita外顯子2的序列(a)，以及用talenx1制造的ciita缺陷型人胚胎干細胞(hesc)的效率(b)。

根據(jù)在與ciita靶向hescs的多能性相關(guān)的實施方案，圖2a顯示了在ciita-/-hescs中多能標記nanog，oct4，ssea3和tra-1-60的免疫染色。

根據(jù)ciita靶向hesc的多能性相關(guān)的實施方案，圖2b顯示了由ciita^-/-hescs形成的畸胎瘤中he染色鑒定出三個胚層[(中胚層(左)，外胚層(中)和內(nèi)胚層(右)]，比例尺為100μm。

根據(jù)與ciita靶向hesc的多能性相關(guān)的實施方案，圖2c顯示了ciita靶向的hesc衍生的eb中分化的標志物表達的rt-pcr分析。

根據(jù)與ciita靶向hesc的多能性相關(guān)的實施方案，圖2d示了ciita雜合和純合的hesc的核型分析。兩組均有兩個樣本分析，無異常核型。

根據(jù)與來自ciita靶向hescs的成纖維細胞中ciita和hlaii類表達相關(guān)的實施方案，圖3a顯示了hescs衍生的成纖維細胞中β2m，ciita，hlaii(dra，dqa，dpa)和ii的rt-pcr分析。用ifn-γ(500u/ml)處理5天。對照組無ifn-γ。將所有組與ciita^+/+ifn-γ游離組進行比較。通過t檢驗評估顯著性。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem.n≥3.***p<0.001，**p<0.01。

根據(jù)與來自ciita靶向hesc的成纖維細胞中ciita和hlaii類表達相關(guān)的實施方案，圖3b顯示了經(jīng)過處理的成纖維細胞(如上所述治療的成纖維細胞)中hlaii和ciita蛋白表達的蛋白質(zhì)印跡。比例尺100μm。

根據(jù)與來自ciita靶向hesc的成纖維細胞中ciita和hlaii類表達相關(guān)的實施方案，圖3c顯示了處理的成纖維細胞(如上所述治療的成纖維細胞)中hlaii和ciita蛋白表達的免疫染色分析。比例尺100μm。

根據(jù)與來自ciita靶向hesc的成纖維細胞中ciita和hlaii類表達相關(guān)的實施方案，圖3d顯示了處理的成纖維細胞中hlai和ii蛋白表達在細胞表面的facs分析。

根據(jù)與衍生自ciita靶向hesc的dcs中的hlaii類表達相關(guān)的實施方案，圖4a顯示涉及的來自ciita靶向hesc的dc中cd83，cd86，cd11c，dra，dpa，dqa，ii，ciita，hla-e和β2m的rt-pcr分析。將所有組與ciita^+/+hescs組進行比較。

根據(jù)來自ciita靶向hesc的dcs中hlaii類表達相關(guān)實施方案，圖4b示出了dcs中hlaii表達的facs分析，其由的cd83和cd86的共表達來定義，并比較hlaii⁺的百分比。通過t檢驗評估顯著性。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem，n≥3，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。

根據(jù)與來自teratomas的人成纖維細胞的衍生相關(guān)的實施方案，圖5顯示了源自hesc的成纖維細胞和源自hesc的成纖維細胞表達波形蛋白的形態(tài)(a)。將所有組與ciita^+/+成纖維細胞組進行比較(gb)。

具體實施方式

除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有如本公開所屬的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然在本公開的實踐或測試中可以使用與本文描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但是描述了優(yōu)選的方法和材料。對于本公開的目的，下列術(shù)語定義如下。

本文使用冠詞“一(a)”和“一個(an)”指的是一個或多于一個(即，指的是至少一個)該冠詞的語法對象。舉例來說，“元件”表示一個元件或多于一個元件。

“約”是指與參考量、水平、值、數(shù)量、頻率、百分比、量綱、大小、用量、重量或長度相比，量、水平、值、數(shù)量、頻率、百分比、量綱、大小、用量、重量或長度的變化高達30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。

“編碼序列”指的是導(dǎo)致基因多肽產(chǎn)物編碼的任何核酸序列。與之相比，術(shù)語“非編碼序列”是指不會導(dǎo)致基因多肽產(chǎn)物編碼的任何核酸序列。

在本發(fā)明書中，除了文中另有要求，詞語“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”將被理解為意味包括聲明的步驟或因子或步驟組或因子組，但不排除任何其它步驟或因子或步驟組或因子組。

“由……組成”是指包括并且限于短語“由……組成”之后所描述的內(nèi)容。因此，短語“由……組成”表示所列元素是必要的或強制性的，并且其它元素可以不存在。

“基本上由……組成”是指包括該短語后面列出的任何元素，并且限于對本公開中針對所列元素說明的活性或作用不干擾或無貢獻的其它元素。因此，短語“基本上由……組成”表示所列元素是必要的或強制性的，但是其它元素是任選的，并且根據(jù)它們是否影響所列元素的活性或作用可以存在或不存在。

術(shù)語“互補的”和“互補”指的是通過堿基配對原則相關(guān)的多核苷酸(即核苷酸的序列)。例如，序列“a-g-t”與序列“t-c-a”是互補的?；パa可以是“部分的”，其中僅一些核酸的堿基根據(jù)堿基配對原則進行匹配。或者，核酸之間可存在“完全”或“總體”的互補。核酸鏈之間的互補程度對核酸鏈之間雜交的效率和強度具有顯著影響。

“對應(yīng)于”是指(a)具有與參考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互補的核酸序列或編碼與肽或蛋白質(zhì)中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或者(b)具有與參考肽或蛋白質(zhì)中的氨基酸的序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

“衍生物”是指源自已經(jīng)通過修飾的基本序列的多肽，例如通過與其它化學部分共軛或絡(luò)合(例如聚乙二醇化)或者通過如本領(lǐng)域中可理解的后翻譯修飾技術(shù)。術(shù)語“衍生物”還包含其范圍內(nèi)已對親本序列所做的改變，包含提供用于功能上等同的分子的添加或缺失。

正如在本文中所使用的，術(shù)語“功能”和“功能的”等等是指生物的、酶促的或治療的功能。

“基因”指的是在染色體中占據(jù)特異性位點并且由轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序列和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列(也就是內(nèi)含子，5'和3'的非翻譯序列)組成的遺傳單位。

“同源性”是指相同的或構(gòu)成保守性取代的氨基酸的百分比數(shù)字?？梢允褂弥T如gap的序列對比程序確定同源性(deveraux等，1984，nucleicacidsresearch12,387-395)，其通過引用并入本文。在這一方式中，通過將缺口插入對比，與本文中那些引用的序列相似或基本上不同長度的序列將被對比，例如，通過gap所使用的比較算法確定此類缺口。

術(shù)語“宿主細胞”包括可以是或已經(jīng)是本發(fā)明任何重組的載體或分離的多核苷酸受體的單個細胞或者細胞培養(yǎng)物。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，并且該子代因正常的、隨機的或有意的突變和/或變化而不必與原母細胞完全相同(在形態(tài)學上或總dna互補上)。宿主細胞包括使用本發(fā)明重組載體或多核苷酸在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細胞。包含本發(fā)明重組載體的宿主細胞為重組宿主細胞。

術(shù)語“干細胞”是指在多細胞生物體中發(fā)現(xiàn)的生物細胞，其可以分裂(通過有絲分裂)并分化成多種特殊的細胞類型，并可自我更新以產(chǎn)生更多的干細胞。在哺乳動物中，存在兩種廣泛類型的干細胞：從囊胚的內(nèi)細胞團中分離的胚胎干細胞和在各種組織中發(fā)現(xiàn)的成體干細胞。

組合物(例如，干細胞)的術(shù)語“免疫原性”是指組合物誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。例如，當干細胞被移植到受試者時，如果干細胞不接觸mhci和/或mhcii，則免疫原性可以減弱。

“分離的”是指基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含通常在其天然狀態(tài)下附帶著的成分的物質(zhì)。例如，如本文所使用的，“分離的多核苷酸”指的是在天然存在的狀態(tài)下被來自其兩側(cè)的序列所純化的多核苷酸，例如從正常毗鄰于所述片段的序列所移除的dna片段。可選地，如本文所使用的，“分離的肽”或“分離的多肽”等指的是肽或多肽分子從其天然細胞環(huán)境中的體外分離和/或純化，以及與細胞的其它成分關(guān)聯(lián)。

術(shù)語“調(diào)節(jié)”和“改變”包括相對于對照通常在統(tǒng)計學上顯著或生理學上顯著的數(shù)量或程度的“增加”和“提高”以及“減小”或“降低”。在具體的實施例中，相對于未修飾或不同修飾的干細胞，與哺乳動物干細胞移植相關(guān)的免疫排斥減小。

“增加”或“增強”的量通常是“統(tǒng)計學上顯著”的量，并且可包括本文所描述的量或水平增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括這些數(shù)值之間的所有整數(shù)和小數(shù)點，且大于1，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。

“減小”或“減少”或較少的量通常是“統(tǒng)計學上顯著”的量，并且可包括本文所描述的量或水平減小1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括這些數(shù)值之間的所有整數(shù)和小數(shù)點，且大于1，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)。

例如，“從...獲得”指的是樣品，諸如多核苷酸或多肽從特定源(諸如所需的生物或所需生物內(nèi)特異性組織)分離或衍生得到的?！皬?..獲得”也可以是指多核苷酸或多肽序列在其中從特定的生物或生物內(nèi)組織分離或衍生得到的情形。例如，編碼本文中所述的參比多肽的多核苷酸序列可以從多種原核或真核生物分離得到或從某些真核生物內(nèi)特定組織或細胞總分離得到的。

本文所用的術(shù)語“可操作地連接的”指將基因放置在啟動子的調(diào)控下，啟動子然后控制基因的轉(zhuǎn)錄和任選的基因的翻譯。在異源啟動子/結(jié)構(gòu)基因組合的構(gòu)建中，通常優(yōu)選將遺傳序列或啟動子定位于到基因轉(zhuǎn)錄起始位點的距離大約相同于基因序列或啟動子與控制其自然環(huán)境的基因之間的距離；控制其自然環(huán)境的基因即基因序列或啟動子所來源的基因。如本領(lǐng)域已知的，可適應(yīng)該距離的一些變化而不損失功能。類似地，調(diào)節(jié)序列元件相對于其控制之下的異源基因的優(yōu)選位置受其自然環(huán)境中元件位置的限定；即其所來源的基因?！敖M成型啟動子”通常是活性的，即在大多數(shù)情況下，啟動轉(zhuǎn)錄?！罢T導(dǎo)型啟動子”通常只在某些條件下是活性的，諸如在給定的分子因子(例如iptg)或特定的環(huán)境條件(例如特定的co2濃度、營養(yǎng)水平、光、熱)的存在下。在不存在那種情況下，誘導(dǎo)型啟動子通常不允許顯著的或可測量水平的轉(zhuǎn)錄活性。例如，誘導(dǎo)型啟動子可以根據(jù)溫度、ph值、激素、代謝物(例如乳糖、甘露醇、氨基酸)、光(例如特定波長)、滲透勢(例如鹽誘導(dǎo)的)、重金屬或抗生素等來誘導(dǎo)。許多標準的誘導(dǎo)型啟動子對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是已知的。

術(shù)語“多能性”是指es細胞的后代細胞保留多譜系分化潛力的es細胞的能力。在es細胞中維持多能性似乎涉及多個核因子之間的持續(xù)相互作用-這實現(xiàn)了一些平衡，其中一些相互作用是抑制或拮抗的，而其他相互作用是積極的或合作的從而促進多能性，這些抑制了分化中涉及的基因。保持多能性的重要因素包括oct4，nanog和sox2。

如本文所使用的，敘述“多核苷酸”或““核酸”是指mrna、rna、crna、rrna、cdna或dna。該術(shù)語通常指的是長度為至少10個堿基的核苷酸聚合體形式，所述核苷酸是核糖核苷酸或脫氧核苷酸或任一類型核苷酸的經(jīng)修飾形式。該術(shù)語包括dna和rna的單鏈和雙鏈形式。

術(shù)語“多核苷酸變體”和“變體”等指的是顯示與參考多核苷酸序列具有基本序列同一性的多核苷酸或在下文定義的嚴格條件下與參考序列雜交的多核苷酸。這些術(shù)語還包括通過至少一個核苷酸的添加、缺失或取代而區(qū)別于參考多核苷酸的多核苷酸。因此，術(shù)語“多核苷酸變體”和“變體”包括其中一個或多個核苷酸被添加或缺失，或用不同的核苷酸置換的多核苷酸。在這方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員很好理解的是，可以對參考多核苷酸進行某些改變，包括突變、添加、缺失和取代，由此所改變的多核苷酸保持參考多核苷酸的生物學功能或活性，或者相對于所述參考多核苷酸具有增加的活性(即，優(yōu)化)。多核苷酸變體包括，例如，與本文中所描述的參考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％，以及在之間的所有整數(shù)百分比，例如，90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸。術(shù)語“多核苷酸變體”和“變體”還包括天然存在的等位基因變體和編碼這些酶的直系同源物。

關(guān)于多核苷酸，術(shù)語“外源的”指的是在野生型細胞或生物體中并非天然存在但是通常通過分子生物學技術(shù)將其引入到細胞中的多核苷酸序列。外源多核苷酸的實例包括載體、質(zhì)粒，和/或編碼所需蛋白質(zhì)的人造核酸構(gòu)建體。對于多核苷酸，術(shù)語“內(nèi)源的”或“天然的”指的是可在給定的野生型細胞或生物體中找到的天然存在的多核苷酸序列。同樣，從第一生物體分離并且通過分子生物學技術(shù)轉(zhuǎn)移到第二生物體的特定多核苷酸序列通常被認為相對于所述第二生物體是“外源的”多核苷酸。在具體的實施例中，多核苷酸序列可以通過分子生物學技術(shù)被“引入”到已包含這樣的多核苷酸序列的微生物中，例如，克隆一個或多個另外天然存在的多核苷酸序列，并且由此促進所編碼的多肽的過表達。

列舉的與mhcii的基因有關(guān)的“突變”或“缺失”通常指那些干細胞的變化或改變，其使該基因的產(chǎn)物對于糖原的合成和/或儲存或給定脂質(zhì)的生物合成無功能或具有降低的功能。這樣的變化或改變的例子包括部分或全部核苷酸對于靶基因的編碼或調(diào)控序列(例如ciita)的取代，缺失或添加，這破壞、消除、下調(diào)或顯著減少由該基因編碼的多肽的表達，無論是在轉(zhuǎn)錄還是翻譯水平，和/或其產(chǎn)生相對不活躍的(例如，突變或缺失)或不穩(wěn)定的多肽。用于產(chǎn)生這些改變或變化的技術(shù)，諸如通過與具有可選擇標記的載體重組，在本文中示例性給出并且在分子生物學技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。在具體的實施方案中，基因的一個或多個等位基因，例如兩個或全部等位基因，可以在干細胞內(nèi)突變或缺失。

靶基因的“缺失”也有可能通過打靶基因的mrna實現(xiàn)，如使用領(lǐng)域內(nèi)已知的多種反義技術(shù)(如反義寡核苷酸和sirna)。相應(yīng)的，當基因的多肽或者編碼的酶在修飾過的光合微生物中不表達或者表達量可忽略，靶基因可被認為是“無功能的”。這使得修飾過的干細胞產(chǎn)生或積累比未修飾或者其他不同修飾的干細胞更少的多肽或者酶產(chǎn)物(如mhcii)。

在某些方面，通過在核苷酸水平的突變或改變編碼多肽的氨基酸序列，靶基因可以被渲染“非功能性”。這使得一條修飾的多肽被表達，無論是通過修飾該多肽的活性位點、其細胞內(nèi)定位、其穩(wěn)定性，或?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他功能特性，使得其功能或者活性降低(例如，ciita)。參與mhcii生物合成或運輸途徑的編碼序列或一條多肽的這種修飾可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)來完成，如對一個給定的干細胞進行基因組水平的定向誘變，和/或天然的選擇(如，定向進化)。

“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，用來指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合成類似物。因此，這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物(諸如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學類似物)，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化不同的化學反應(yīng)的酶多肽，或“酶”。

敘述多肽“變體”指的是通過至少一個氨基酸殘基的添加、缺失或取代而區(qū)別于參考多肽序列的多肽。在某些實施例中，多肽變體通過一個或多個取代基而區(qū)別于參考多肽，所述取代基可以是保守的或非保守的。在某些實施例中，所述多肽變體包含保守性取代基，并且在這方面，本領(lǐng)域中很好理解的是，一些氨基酸可以被改變?yōu)榫哂袕V泛相似性質(zhì)的其它氨基酸，而不改變多肽的活性性質(zhì)。多肽變體還包括其中一個或多個氨基酸被添加或缺失，或用不同的氨基酸殘基置換的多肽。

術(shù)語“參比序列”一般是指另一序列與之做對比的核酸編碼序列或氨基酸序列。本文中所述的所有多肽和多核苷酸序列包括在參比序列中，包括由名稱和序列表中描述的那些。

本文中所使用的引述“序列一致性”(或，例如，包括“50％相同的序列”)是指在比較窗口內(nèi)核甘酸緊接核甘酸的基礎(chǔ)上或氨基酸緊接氨基酸的基礎(chǔ)上序列相同的程度。因此，可以在比較窗口內(nèi)通過比較兩個最佳比對序列來計算“序列一致性的百分比”，確定在位置上兩序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基(例如，a、t、c、g、i)或相同氨基酸殘基(例如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)的位置的數(shù)字以獲得配對位置的數(shù)字，通過在比較窗口(也就是說窗口大小)內(nèi)位置的總數(shù)字將配對位置的數(shù)字劃分，以及將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列一致性的百分比。包括了具有與本文所述參比序列(參見，例如，序列表)任意一個至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核苷酸和多肽，其中多肽變體通常保持有該參比多肽的至少一個生物活性。

“統(tǒng)計學顯著的”，指的是結(jié)果并不是偶然發(fā)生的。統(tǒng)計學顯著可以通過本領(lǐng)域任何已知的方法來確定。通常用p值來衡量顯著性，它表示當原假設(shè)為真時所得到的樣本觀察結(jié)果或更極端結(jié)果出現(xiàn)的概率。如果所獲得的p值小于顯著性水平，則該原假設(shè)被拒絕。一般情況下，如果p值小于或等于0.05，則認為是顯著的。

“大體上”或“基本上”是指幾乎完全或完全，例如，95％，96％，97％，98％，99％或更大一些給定的數(shù)量。

“轉(zhuǎn)化”是指，從攝取和摻入到宿主細胞基因組中的外源dna得到的；或者是外源基因從一個生物體轉(zhuǎn)移進入另一生物體的基因組中得到的永久性遺傳改變。

術(shù)語“野生型”是指，基因或基因產(chǎn)物具有從天然來源中分離得到的基因或基因產(chǎn)物的特點。一個野生型的基因或基因產(chǎn)物(如一段多肽)是在野生群體中觀察到的最高頻率的表型，因此也是在“正?！被颉耙吧汀钡幕蛐问街腥我舛x的。

本文的實施方案涉及可以通過與主要相容性復(fù)合物ii(mhcii)的生物合成或運輸途徑相關(guān)的內(nèi)源基因的破壞可獲得低免疫原性(例如，免疫原性降低)和相容性干細胞。與這些低免疫原性和相容性干細胞分化的細胞不具有組成型和ifn-γ誘導(dǎo)的hlaii，并且可以降低例如t細胞介導(dǎo)的對細胞治療作用的排斥反應(yīng)。

人t細胞的激活基于兩個信號(tcr-hla信號和共刺激信號)。hla分子由大的基因家族編碼并分為i類和ii類。首先，專職或非專職抗原呈遞細胞(apc)將蛋白質(zhì)降解成肽，然后將這些肽加載到hla分子上。然后，cd4⁺和cd8⁺t細胞的tcr分別識別hlaii和hlai呈遞的肽。同時，這些apc表達一系列共刺激分子(例如cd80和cd86)，其將與t細胞的互補分子(例如cd28和細胞毒性t淋巴細胞抗原4(ctla4))相互作用。

需要tcr-hla信號和共刺激信號來激活t細胞。因此，如果抑制任何一種，t細胞不會攻擊同種異體移植物。已經(jīng)證明，表達ctla4-免疫球蛋白融合蛋白(ctla4-ig)和程序性死亡配體-1(pd-l1)的hesc可以通過同時破壞共刺激途徑和激活t細胞抑制途徑來抑制同種異體免疫應(yīng)答。這個策略是有用的，但不是普遍適用的。例如，來自hesc的t細胞不能用ctla4-ig和pd-l1的表達來活化。因此，這種方法限制了hesc在臨床免疫治療中的應(yīng)用，例如hesc衍生的嵌合抗原受體(car)-t，這是癌癥治療中的有效治療方法。

此外，與小鼠t細胞不同，活化的人t細胞表達hlaii。生產(chǎn)低免疫原性和相容性car-t可能會阻止受體t細胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。此外，dcs可以來自沒有hlaii的那些hescs。雖然這些dcs不能正常呈遞抗原，car技術(shù)(car-dcs)和人造hla-肽可以使這些被修飾細胞對癌癥更具特異性和敏感性。

在每個有核細胞的表面上發(fā)現(xiàn)hlai分子。組成型hlaii分子主要表達于胸腺上皮細胞和專職的apc，包括dcs，b淋巴細胞，單核細胞和巨噬細胞。在炎性細胞因子(例如ifn-γ和tnf-α)的壓力下，非專職apc如成纖維細胞和上皮細胞也可以表達hlaii分子，這被稱為“誘導(dǎo)hlaii”。每個經(jīng)典hlai分子結(jié)構(gòu)上由多態(tài)性重鏈(例如hla-a，hla-b和hla-c)組成，其結(jié)合相同的輕鏈β2m。敲除β2m的hescs證明了hlai分子的損失，其使hesc具有避免cd8⁺t細胞介導(dǎo)的排斥的能力。然而，沒有報告已經(jīng)證明產(chǎn)生具有分化為沒有組成型和ifn-γ誘導(dǎo)的hlaii的細胞的能力的hesc。

本文的實施方案涉及被修飾細胞，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞的mhcii較少。在某些情況下，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞具有降低的免疫原性，而且被修飾細胞是被修飾的干細胞或源于該被修飾的干細胞的細胞。

本文的實施方案涉及制造被修飾細胞用于生物移植。該方法包括培養(yǎng)該被修飾細胞，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞的mhcii較少。在某些情況下，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞具有降低的免疫原性，而且被修飾細胞是被修飾的干細胞或源于該被修飾的干細胞的細胞。

本文的實施方案涉及治療病癥的方法。該方法包括向受試者施用治療有效量的該被修飾細胞，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞的mhcii較少。在某些情況下，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞具有降低的免疫原性，而且被修飾細胞是被修飾的干細胞或源于該被修飾的干細胞的細胞。

在一些實施方案中，該病癥可以包括帕金森病，亨廷頓舞蹈病，阿爾茨海默病，肌萎縮性側(cè)索硬化，脊髓性肌萎縮，神經(jīng)變性疾病精神病以及脊髓損傷，中風，燒傷，心臟病，肝臟疾病，糖尿病，血癌，器官移植缺損和損傷再生的至少一種。

在一些實施方案中，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞的mhcii的生物合成或轉(zhuǎn)運途徑的一個或多個基因的表達有所降低。

在一些實施方案中，與相應(yīng)的野生型細胞相比，被修飾細胞上累積mhcii減少。

在一些實施方案中，修飾的干細胞包括具有與mhcii的生物合成或運輸途徑相關(guān)的內(nèi)源基因(例如，rfx因子(rfxap，rfx5，rfxank)和ciita)的破壞。在某些實施方案中，該破壞包括mhcii類反式激活因子(ciita)的破壞。例如，由于刪除ciita的至少一部分而導(dǎo)致破壞。

hlaii基因由相同的調(diào)節(jié)復(fù)合物調(diào)控，由三個rfx因子(rfxap，rfx5，rfxank)和ciita組成。該復(fù)合物不僅調(diào)節(jié)編碼經(jīng)典hlaii分子(hla-dp，hla-dq和hla-dr)的基因，而且調(diào)節(jié)編碼hlaii分子的細胞內(nèi)運輸和肽負載所需的輔助蛋白的基因，包括非經(jīng)典hlaii分子(不變鏈(ii)，hla-dm和hla-do)。在某些情況下，腫瘤細胞和病毒感染的細胞將通過干擾hlaii合成而逃避cd4⁺t細胞介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)。在這里使用talens技術(shù)，通過敲除ciita(hlaii分子的主調(diào)節(jié)子)來破壞hesc的hlaii分子。ciita的主要功能是調(diào)控hlaii，因此它們具有幾乎相同的細胞分布。ciita不直接結(jié)合dna，但與由環(huán)amp應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(creb)，核因子y復(fù)合物(nf-y)和rfx因子(rfx5，rfxank，rfxap)組成的其他元件相互作用。沒有功能性ciita的患者患有裸淋巴細胞綜合征(bls)，其特征在于組織細胞中hlaii的表達不足。mhcii類介導(dǎo)的同種異體反應(yīng)中，ciita^-/-小鼠也受損。

ciita有四個啟動子，它們可以以組織特異性方式調(diào)節(jié)hlaii表達。為了完全針對ciita，talens設(shè)計針對的是所有轉(zhuǎn)錄公共外顯子(外顯子2和3)。即使在胚狀體(ebs)分化或ifn-γ誘導(dǎo)期間，hescs也不體外表達hlaii和ciita。分別檢查了hescs衍生的dc和成纖維細胞上的組成型和誘導(dǎo)的hlaii分子。ciita的缺失可能會顯著降低hlaii分子的組成型和誘導(dǎo)型表達。

在一些實施方案中，mhcii包含人白細胞抗原ii(hlaii)。在此情況下，修飾的干細胞包含人胚胎干細胞。

在一些實施方案中，修飾的干細胞包括全能干細胞，多能干細胞，胚胎干細胞，誘導(dǎo)多能干細胞或多能干細胞中的至少一種。

在一些實施方案中，與相應(yīng)的野生型細胞相比，例如當將被修飾細胞移植到受試者時，降低的免疫原性包括由被修飾細胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的死亡水平。

在一些實施方案中，被修飾細胞的核型與相應(yīng)野生型細胞的核型相同。

在一些實施方案中，被修飾細胞的多能性水平與相應(yīng)野生型細胞的多能性水平基本相同。在這些情況下，來自修飾的干細胞分化的細胞(例如成纖維細胞和上皮細胞)不具有組成型和ifn-γ誘導(dǎo)的hlaii。

可以組合上述各種實施方案以提供更進一步的實施方案。如果需要使用各專利、申請和公開的概念以提供其它實施方案，可對各實施方案的特征進行修改。

可以根據(jù)上述具體描述對這些實施方案作出這些和其它改變。通常，在隨后的權(quán)利要求中，所使用的術(shù)語應(yīng)當不被視為將權(quán)利要求限于本說明書和權(quán)利要求書所公開的具體實施方案，而是應(yīng)當被視為包含全部可能的實施方案，連同這些權(quán)利要求所具有的等價方案的全部范圍。因此，權(quán)利要求不受本公開內(nèi)容的限制。

talens破壞hescs中ciita

使用talens在hescs中敲除ciita。ciita的talen是針對外顯子2和外顯子3設(shè)計。選自293t試驗中最有效的talen對(2l2和2r2)，并用于靶向x1hescs中的ciita(圖1)。在一輪中獲得了雜合子(ciita^+/-)和純合(ciita^-/-)hesc，效率為70％(圖1)。

數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。使用graphpadprism5.1(graphpadsoftwareinc.，usa)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。通過不配對的student'st檢驗分析性能變量。除非另有說明，顯著是基于*p<0.05。

hescs培養(yǎng)

在用matrigel(becton-dickinson)包被的t25燒瓶(corning)上培養(yǎng)hescs，照射cf1飼養(yǎng)細胞(3×10⁴個細胞/cm²)。將hesc培養(yǎng)在dmem/f12(invitrogen)，該培養(yǎng)基含有20％敲除血清替代物(invitrogen)，4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bfgf；invitrogen)，2mmol/l1-谷氨酰胺(invitrogen)，1％非必需氨基酸(invitrogen)和0.1mmol/lβ-巰基乙醇(sigma-aldrich)。hescs每周大約傳播一次。使用膠原酶iv將細胞從進料器中分離為細胞團，在被傳送到新制備的飼養(yǎng)細胞之前將其解離成適當?shù)拇笮　?/p>

talens效率檢測

設(shè)計了ciita的talen靶向外顯子2(2l1：gctgaccccctgtgcct(seqidno：1)；2l2：gaccccctgtgcctct(seqidno：2)；2r1：ctccagccaggtccatct(seqidno：3)；2r2：tctccagccaggtccat(seqidno：4))和外顯子3(3l1：tcagcaggctgttgt(seqidno：5)；3l2：tcagcaggctgttgtgt(seqidno：6)；3r1：ccctggtctcttcat(seqidno：7)；3r2：aagcctccctggtctt(seqidno：8)；3r3：aagcctccctggtct(seqidno：9))。talens用fasttaletalen裝配工具(斯丹賽)構(gòu)建，其活性在293t細胞中得到證實(如前所述)。將構(gòu)建的talen轉(zhuǎn)染到293t細胞中，并用2μg/ml嘌呤霉素(sigma)選擇。選擇后收獲293t細胞的基因組dna。然后，進行pcr和測序以檢查talens的效率。

生成ciita缺陷型hescs

為了制備用于轉(zhuǎn)染的細胞，將收獲的hesc接種在用matteig包被的六孔板中，六孔板含有mtesr^tm1培養(yǎng)基(stemcelltechnologies)。第二天，通過fugenehd轉(zhuǎn)染試劑(promega)將最有效的talen(2l2和2r2)質(zhì)粒和egfp-puro質(zhì)粒(斯丹賽)(1：1：1)轉(zhuǎn)染入hesc。將fugenehd轉(zhuǎn)染試劑/質(zhì)粒/opti-mem(lifetechnologies)混合物(15μl/6ug/300ul)在室溫下孵育15分鐘，然后將混合物加入細胞培養(yǎng)物中。兩天后將嘌呤霉素加入培養(yǎng)基中。用0.5μg/ml嘌呤霉素選擇后，使用tryple(invitrogen)將存活菌落解離成單個細胞，并以500個細胞/cm²的密度接種到cf1包被的平板上。傳代后兩周，將衍生自單細胞的菌落轉(zhuǎn)移到新鮮的cf1包被的孔中，并行使用直接細胞pcr試劑盒鑒定突變體。

針對ciita的hesc的多能性

hescs的多能性對于其在細胞替代療法中的應(yīng)用是必需的。因此，對已建立的ciita靶向hescs的多能性進行了調(diào)查。免疫染色顯示，ciita^-/-hescs對oct4，nanog，tra-1-60和ssea3呈陽性(圖2a)。當將ciita^-/-hescs注射入非肥胖型糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷型(nod/scid)小鼠時，2個月后形成畸胎瘤，在蘇木精-伊紅(he)染色部分觀察到來自3個胚層的組織(圖2b)。從ciita^-/-hescs衍生的eb進行rt-pcr以顯示三個胚層分子標記的表達(圖2c)。此外，ciita^-/-和ciita^+/-hescs均具有正常核型(圖2d)。正常核型譜系用于以下的實驗。因此，靶向hesc在多能性和核型中沒有顯示任何差異。rt-pct的引物列于表1。

表格1

來自ciita靶向hescs細胞中的ciita和hlaii表達

對于細胞替代治療，分化的細胞被直接移植到受試者體內(nèi)。一些組織細胞(例如專職apc和胸腺上皮細胞)具有hlaii分子和一些其他組織細胞(例如，成纖維細胞和上皮細胞)的組成型表達已經(jīng)誘導(dǎo)hlaii分子的表達。為了確保hlaii的功能性破壞，研究了從ciita靶向hesc衍生的定義類型的細胞中的兩種hlaii表達。

首先檢測ifn-γ可誘導(dǎo)的hlaii對hescs來源的成纖維細胞的影響，并進行5天的500uifn-γ處理。使用ccd-1079sk(ccd)細胞系，人成纖維細胞系作為陽性對照。ifn-γ誘導(dǎo)可增加組織細胞中β2m的表達。沒有ifn-γ治療，所有細胞均顯示hlaii基因(ciita，dra，dpa，dqa，ii)和β2m的低水平表達。通過ifn-γ處理，所有組中β2m和ciitamrna都增加(圖3a)。ciita靶向不影響ciita的轉(zhuǎn)錄。ciita^+/+和ciita^+/-成纖維細胞增加了ccd細胞在ifn-γ處理后的hlaii基因(dra，dpa，dqa，ii)的mrna表達(圖3a)。然而，ifn-γ處理的ciita^-/-成纖維細胞沒有明顯增加hlaii基因(dra，dpa，dqa，ii)的mrna表達(圖3a)。表明在ifn-γ處理的ciita^-/-成纖維細胞中檢測到的ciitamrna功能失調(diào)，不能轉(zhuǎn)化為功能性蛋白質(zhì)以調(diào)節(jié)hlaii的表達(圖3a)。通過以下蛋白質(zhì)印跡和免疫化學數(shù)據(jù)證明了這一點(圖3b，c)。它還表明，ciita^+/-成纖維細胞的ciita和hlaii蛋白的水平升高滯后于mrna的增加(圖3b，c)。所有組的facs分析顯示，在ifn-γ誘導(dǎo)下，細胞表面上幾乎沒有細胞表達hlaii。ifn-γ誘導(dǎo)后，ccd和ciita^+/+成纖維細胞顯著增加hlai和ii的表達。然而，ciita^+/-和ciita^-/-都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的hlaii表達的增加(圖3d)。

其次，在來自hesc的dcs上，測試了組成型hlaii的表達。為了臨床使用方案，選擇具有明確化學成分培養(yǎng)基的方案，該培養(yǎng)基不包括血清，飼料以及其他動物的產(chǎn)品。衍生自hescs的dc表達cd83和cd86(圖4a，b)。與ciita^+/+和ciita^+/-dcs相比，ciita^-/-dcs中發(fā)現(xiàn)較低水平的經(jīng)典hlaii分子(dra，dqa和dpa)的mrna表達(圖4a)。然而，非經(jīng)典hlaii基因(ii)的mrna表達沒有顯示任何差異(圖4a)。經(jīng)典hlaii基因(hla-dp，hla-dq和hla-dr)和非經(jīng)典hlaii基因(hla-dm，hla-do，ii)具有相同的特異性調(diào)節(jié)模塊，可被rfx-ciita綜合體識別。該結(jié)果表明hla-dr表達完全依賴于ciita，其可能導(dǎo)致ciita靶向細胞中其他hlaii分子的殘留表達(圖3a，4a)。因此，ii在dcs和成纖維細胞之間具有不同的趨勢，并且表明獨立于ciita的ii的不同調(diào)節(jié)途徑。ifn-γ誘導(dǎo)的成纖維細胞和dcs中ii的表達可能主要依賴于ciita，而dcs分化持續(xù)這么長時間才能激活沒有ciita的替代調(diào)節(jié)途徑。似乎ii編碼輔助蛋白是hlaii分子的肽加載所必需的，并且不能拯救細胞表面上的dra，dpa和dqa的損失(圖3d，4b)。

dcs用cd83和cd86來定義，同時比較了cd83⁺cd86⁺dcs中hlaii⁺細胞的百分比。pbm衍生的dcs顯示出這三種標記的高度重疊(圖4b)。ciita^-/-dcs具有1.98％的hlaii⁺細胞，而ciita^+/+和ciita^+/-dcs的hlaii⁺細胞百分比分別為39.1％和24.8％。

畸胎瘤的人成纖維細胞的畸胎形成和衍生

肌內(nèi)注射hescs至6-8周nod/scid小鼠(每個位點約5×106個細胞)。約2個月后，腫瘤取樣并且進行蘇木精-伊紅(he)染色。

成纖維細胞樣細胞也衍生于畸胎瘤。將tertomas用剪刀切成塊，并在補充有10％血清，1％pen-strep和50umβ-甲基乙醇的dmem中培養(yǎng)。經(jīng)過幾次傳代之后，貼壁細胞變成均勻的成纖維細胞樣細胞。進行細胞形態(tài)觀察和rt-pcr(圖5)。建立了10個細胞系(3個為+/+；3為+/-；4為-/-)。并分析了建立的細胞系中的一些間充質(zhì)干細胞標記(n>3)。ccd和間充質(zhì)干細胞(msc)作為對照。那些細胞系更像是成纖維細胞。表明該方法在這些實驗中是可重現(xiàn)的。

從hescs衍生人dcs

由先前報道的，dcs與hescs的分化是ebs懸浮培養(yǎng)中逐步通過生長因子來誘導(dǎo)的。在前5天，hescs培養(yǎng)在x-vivo^tm15培養(yǎng)基(lonza)中，該培養(yǎng)基進一步包括1mm丙酮酸鈉，1×非必需氨基酸，2mml-谷氨酰胺，50mm2-巰基乙醇，四種生長因子：包括重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(rhbmp-4；bd)，重組人血管內(nèi)皮生長因子(rhvegf；r&d)，重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rhgm-csf；r&d)和重組人干細胞因子(rhscf；r&d)，hescs顯示中胚層。從第6天到第10天，除去rhbmp-4，細胞成為造血干細胞(hscs)。從第11天到第15天，除去rhvegf，將hsc變成常見的骨髓祖細胞(cmp)。從第16天到第20天，去除rhscf，逐漸出現(xiàn)并累積單核細胞樣細胞作為dc前體。在未來4-6天內(nèi)，治療rhgm-csf和重組人白細胞介素4(rhil-4；r&d)將dc前體誘導(dǎo)成為不成熟的dcs(idc)。dcs的成熟需要用混合因子進一步孵育1-2天，混合因子包括rhgm-csf，重組人白細胞介素-1β(rhil1-β；r&d)，重組人干擾素γ(rhifn-γ；r&d)，前列腺素e2(pge-2；sigma)和重組人腫瘤壞死因子α(rhtnf-α；r&d)。