發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明一般性涉及用于哺乳動(dòng)物輔助生殖技術(shù)的組合物和方法。具體地，本發(fā)明涉及用于哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟的組合物和方法。

發(fā)明背景

在人類不育實(shí)踐中，傳統(tǒng)的體外受精(ivf)或胞質(zhì)內(nèi)精子注射(icsi)技術(shù)在用昂貴的激素療法進(jìn)行超排卵后仍然使用，以獲得大卵泡(即直徑至少17mm)。激素的成本、其與急性和長期并發(fā)癥相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)以及反復(fù)的醫(yī)院就診監(jiān)測(cè)卵泡生長的不便，都會(huì)激勵(lì)人們?yōu)檎?高卵泡儲(chǔ)備的不育夫婦開發(fā)一種成本更低、耐受性更好的治療方法。

卵母細(xì)胞體外成熟(ivm)是一種技術(shù)，其可以使得封閉在牢固凝聚的冠狀卵丘層中生發(fā)泡(gv)期卵母細(xì)胞(卵母細(xì)胞復(fù)合物(coc))成熟?？梢栽谕ㄟ^施用人絨毛膜促性腺激素(hcg)或hcg施用之后的早期觸發(fā)排卵之前通過超聲引導(dǎo)的針穿刺獲得這些卵母細(xì)胞。因此，卵母細(xì)胞ivm有可能簡化生育治療或降低與正常卵巢卵泡儲(chǔ)備或高卵巢卵泡儲(chǔ)備患者激素(hcg)刺激相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)和成本。這種卵泡儲(chǔ)備通常通過測(cè)量抗苗勒激素水平和通過月經(jīng)周期的第3天超聲引導(dǎo)的卵泡計(jì)數(shù)來確定。

對(duì)于使用超聲引導(dǎo)針穿刺的卵母細(xì)胞ivm，可以在最小刺激或未刺激的卵巢中從小(<10mm)卵泡中收集卵母細(xì)胞，并且體外成熟。然而，在發(fā)育的早期階段干擾卵母細(xì)胞的正常發(fā)育(例如當(dāng)卵泡僅達(dá)到10mm或更小的直徑時(shí))不僅產(chǎn)生較少的成熟卵母細(xì)胞，而且降低隨后的胚胎發(fā)育和植入。特別是ivm后每個(gè)胚胎的成功植入率通常低于10％，只有常規(guī)ivf或icsi程序的成功率的一半。早期流產(chǎn)的發(fā)生率似乎是可變的，但通常大于ivf/icsi后的發(fā)生率。對(duì)于人類患者，目前降低的減數(shù)分裂成熟率(50％)與觀察到成熟卵母細(xì)胞胚胎發(fā)育的缺陷一起是當(dāng)前ivm技術(shù)的主要瓶頸(devosetal.,fertil.steril.2011；96(4)860-864；guzmanetal.,fertil.steril.2012；98(2):503-507)。因此，在該方法可以廣泛接受之前，需要解決ivm胚胎發(fā)育潛力和植入率的降低。

ivm培養(yǎng)的基石是為獲得發(fā)育能力提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境。這主要需要激素干預(yù)和激活必要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，通過使用允許卵母細(xì)胞內(nèi)核細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)成熟過程同步的化學(xué)化合物。體外延長卵母細(xì)胞成熟期的原理是促進(jìn)未成熟卵母細(xì)胞與充分調(diào)節(jié)的卵丘細(xì)胞之間更長的相互作用。

負(fù)責(zé)減數(shù)分裂阻滯的卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)途徑已被廣泛研究。通過產(chǎn)生高水平的環(huán)腺苷酸(camp)來維持減數(shù)分裂阻滯。通過降解camp的磷酸二酯酶(pde)酶的活性調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞內(nèi)的camp濃度。最近的研究表明，cgmp在激活鳥苷酸-環(huán)化酶偶聯(lián)的利尿鈉肽2型受體(npr2)后在卵丘細(xì)胞中產(chǎn)生。npr2活性由其配體利尿鈉肽前體c(nppc)誘導(dǎo)，主要由壁顆粒細(xì)胞合成并切割成c型利尿鈉肽(cnp)。然后將cgmp轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中，其中它通過磷酸二酯酶pde3a抑制camp的水解。這種抑制保持高濃度的camp，從而阻止減數(shù)分裂進(jìn)展。(tsafririetal.dev.biol.1996,178(2):393-402；contietal.,mol.cell.endocrinol.1998,145(1-2):9-14；contietal.,mol.cell.endocrinol.2002,187(1-2):153-159)。

以前，為了促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯并允許獲取卵母細(xì)胞能力，已經(jīng)嘗試了衍生自不同物種如小鼠、牛、人的體外成熟卵母細(xì)胞中camp水平的藥理學(xué)干擾(nogueiraetal.biol.reprod.2003,69(6):2045-2052；thomasetal.biol.reprod.2004,71(4):1142-1149；shuetal.hum.reprod.2008,23(3):504-513；vanhoutteetal.hum.reprod.2009,24(3):658-669)。然而，在胚胎發(fā)育潛力水平方面沒有報(bào)道重大改善。

最近，cnp/npr2信號(hào)傳導(dǎo)途徑已被證明是在中等大小和完全生長的卵泡中維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的重要調(diào)節(jié)機(jī)制(zhangetal.j.cell.physiol.2015,230(1):71-81；satoetal.mol.endocrinol.2012,26:1158-1166,franciosietal.biol.reprod.2014,91(3):61,santiquetetal.biol.reprod.2014,91(1):16)。然而，上述研究中的主要問題是coc只能在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)保持較短時(shí)間，因此，只有中等大小至答的卵泡的體外成熟才能成功，小的早期竇卵泡的成熟失敗了。因此，延緩啟動(dòng)小的早期竇卵泡的減數(shù)分裂恢復(fù)以及為了改善ivm過程是目前的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。特別地，這樣的操作方案不應(yīng)影響進(jìn)一步的體外成熟。對(duì)于這種小的早期竇卵泡，這種挑戰(zhàn)甚至更高，因?yàn)樗鼈冃枰@得或保持完成核成熟的能力(即從非包圍核仁(nsn)變成包圍核仁(sn)期)，然后進(jìn)入下一步驟潛在發(fā)育，甚至保持卵母細(xì)胞和卵丘之間的互連，允許從卵丘中轉(zhuǎn)移營養(yǎng)物質(zhì)(例如rna貨物)。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及用于哺乳動(dòng)物輔助生殖技術(shù)的組合物和方法。特別地，本發(fā)明提供了用于未成熟卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(coc)的體外成熟的組合物和方法，從而增強(qiáng)胚胎學(xué)結(jié)果。

在本發(fā)明的背景中，無需在先的hcg刺激或在hcg刺激之后，收集未成熟的哺乳動(dòng)物coc。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在體內(nèi)收集coc之前避免任何觸發(fā)劑，包括高劑量的fsh、lhrh及其激動(dòng)劑，重組lh或lh類似物。

在第一方面，本發(fā)明提供用于哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(coc)的體外成熟的獲能培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含0.1至50nmc型利尿鈉肽(cnp)，雌二醇和fsh。在具體實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含10至25nmcnp，甚至更特別是25nmcnp。

在具體實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含1至1000nm雌二醇，最優(yōu)選10nm雌二醇。在另一實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10miu/mlfsh，特別是1至5miu/ml的fsh，甚至更特別是2.5miu/ml的fsh或1miu/ml的fsh。在又一實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含25nmcnp，10nm雌二醇和2.5或1miu/mlfsh。在又一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的重組fsh、fsh類似物或fsh模擬分子。

在又一實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10ng/ml胰島素，特別是5ng/ml胰島素。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包含等量劑量的胰島素類似物或胰島素模擬分子。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含卵母細(xì)胞分泌因子。本文所用的卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何組合；特別是在獲能培養(yǎng)基中的濃度各自分別為10至100ng/ml。在具體實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞分泌因子是重組蛋白。在又一方面，卵母細(xì)胞分泌因子是異二聚體蛋白。

在又一個(gè)另外的實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至50nmcnp，最優(yōu)選25nmcnp；1至1000nm雌二醇，最優(yōu)選10nm雌二醇；0.1至10miu/mlfsh，最優(yōu)選2.5miu/mlfsh或1miu/mlfsh；0.1至10ng/ml胰島素，最優(yōu)選5ng/ml胰島素；和選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何等同物或組合的卵母細(xì)胞分泌因子。

本發(fā)明還提供了用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟方法。

在第一方面，該方法包括在收集培養(yǎng)基中收集未成熟的coc，使哺乳動(dòng)物coc與包含0.1至50nmcnp、雌二醇和fsh的獲能培養(yǎng)基接觸，并進(jìn)一步使哺乳動(dòng)物coc與成熟培養(yǎng)基接觸。在所述方法中，未成熟的coc通常與收集培養(yǎng)基接觸最少30分鐘至最多2小時(shí)。同樣在所述方法中，并且在與收集培養(yǎng)基接觸后，使哺乳動(dòng)物coc與維持減數(shù)分裂阻滯的獲能培養(yǎng)基接觸。特別地，coc與獲能培養(yǎng)基接觸足以達(dá)到晚期發(fā)育階段的時(shí)間，例如通過將卵母細(xì)胞的染色質(zhì)重組進(jìn)入凝聚期或所謂的包圍核仁(sn)構(gòu)型，如gv期觀察到的那樣所證明的。在此期間，在用于減數(shù)分裂恢復(fù)的刺激之后，卵母細(xì)胞將能夠經(jīng)歷生發(fā)泡破裂(gvbd)。甚至更特別地，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸最少2小時(shí)和最多96小時(shí)。在另一具體實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小確定的時(shí)間。更具體地，在coc取出時(shí)確定卵泡大小，例如通過超聲成像。直徑為1至5mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少48h。對(duì)于直徑>5至10mm的卵泡，優(yōu)選coc在獲能培養(yǎng)基中保持至少24小時(shí)，直徑大于10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少2小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與成熟培養(yǎng)基接觸以允許卵母細(xì)胞的進(jìn)一步減數(shù)分裂成熟。

在具體實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的體外方法中，獲能培養(yǎng)基包含1至1000nm雌二醇，更特別是10nm雌二醇。在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的體外方法中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10miu/mlfsh，更特別是2.5miu/mlfsh或1miu/mlfsh。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的重組fsh、fsh類似物或fsh模擬分子。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10ng/ml胰島素，更特別是5ng/ml胰島素。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的胰島素類似物或胰島素模擬分子。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的體外方法中，獲能培養(yǎng)基包含卵母細(xì)胞分泌因子。本文所用的卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何組合；特別是在獲能培養(yǎng)基中的濃度各自分別為10至100ng/ml。在具體實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞分泌因子是重組蛋白。在另一實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞分泌因子是異二聚體蛋白。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的體外方法中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸至少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。這個(gè)時(shí)間足以達(dá)到晚期發(fā)育階段，例如通過將卵母細(xì)胞的染色質(zhì)重組進(jìn)入凝聚期或所謂的包圍核仁(sn)構(gòu)型所證明的。在另一具體實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小確定的時(shí)間。更具體地，在coc取出時(shí)確定卵泡大小，例如通過超聲成像。直徑為1至5mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少48h。直徑>5至10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少24小時(shí)，并且直徑大于10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少2小時(shí)。獲能期使得卵母細(xì)胞獲得恢復(fù)減數(shù)分裂的能力，這僅在減數(shù)分裂刺激被觸發(fā)后才進(jìn)行評(píng)估。在另一實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與成熟培養(yǎng)基(減數(shù)分裂刺激)接觸以允許卵母細(xì)胞的進(jìn)一步減數(shù)分裂成熟，這在倒置顯微鏡下通過生發(fā)泡破裂(gvbd)和第一極體(pb)的排出證明。

在具體實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的體外方法中，哺乳動(dòng)物coc與非貼壁或貼壁培養(yǎng)板中、特別是非貼壁培養(yǎng)板中的獲能培養(yǎng)基接觸。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的體外方法中，將未成熟的coc與收集培養(yǎng)基接觸最少30分鐘至最多2小時(shí)。

在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的體外方法是輔助生殖技術(shù)的一部分。在具體實(shí)施方案中，所述輔助生殖技術(shù)包括體外受精或icsi。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物coc是人類coc。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的試劑盒。所述試劑盒包含如本文所述的獲能培養(yǎng)基。在具體實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至50nmcnp、雌二醇和fsh。在更具體的實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含10至25nmcnp，優(yōu)選25nmcnp。在具體實(shí)施方案中，試劑盒中的獲能培養(yǎng)基包含1至1000nm雌二醇，優(yōu)選10nm雌二醇。在另一實(shí)施方案中，試劑盒中的獲能培養(yǎng)基包含0.1至10miu/mlfsh，更特別是2.5miu/mlfsh或1miu/mlfsh。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的重組fsh、fsh類似物或fsh模擬分子。在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10ng/ml胰島素，更特別是5ng/ml胰島素。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的胰島素類似物或胰島素模擬分子。在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至50nmcnp，優(yōu)選25nmcnp；1至1000nm雌二醇，優(yōu)選10nm雌二醇；0.1至10miu/mlfsh，優(yōu)選2.5miu/mlfsh或1miu/mlfsh；和0.1至10ng/ml胰島素，優(yōu)選5ng/ml胰島素。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含卵母細(xì)胞分泌因子。本文使用的卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何組合。特別是在獲能培養(yǎng)基中的濃度各自分別為10至100ng/ml。在具體實(shí)施方案中，本文使用的卵母細(xì)胞分泌因子是重組蛋白或異二聚體蛋白。

在另一實(shí)施方案中，用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的試劑盒包含(a)收集培養(yǎng)基，其包含抑制天然存在的磷酸二酯酶的天然或人造化學(xué)化合物或卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的天然抑制劑；(b)如本文所述的獲能培養(yǎng)基；(c)成熟培養(yǎng)基；(d)貼壁和/或非貼壁培養(yǎng)板；和(e)使用該試劑盒的說明。

另一方面，本發(fā)明提供了用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的獲能培養(yǎng)基的用途。如本文所述，所述獲能培養(yǎng)基包含0.1至50nmcnp、雌二醇和fsh。在具體實(shí)施方案中，所述獲能培養(yǎng)基包含1至1000nm雌二醇。在另一實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10miu/mlfsh，優(yōu)選2.5miu/mlfsh或1miu/mlfsh。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的重組fsh、fsh類似物或fsh模擬分子。在另一實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10ng/ml胰島素，優(yōu)選5ng/ml胰島素。另一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的胰島素類似物或胰島素模擬分子。在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基的用途中，獲能培養(yǎng)基包含卵母細(xì)胞分泌因子。本文所用的卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何組合。在具體實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞分泌因子是重組蛋白。在另一方面，卵母細(xì)胞分泌因子是異二聚體蛋白。

在具體實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸至少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。更具體地，在獲能培養(yǎng)基的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸以維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯并允許獲得細(xì)胞質(zhì)成熟。特別地，使coc與獲能培養(yǎng)基接觸足以達(dá)到晚期發(fā)育的時(shí)間，例如通過將卵母細(xì)胞的染色質(zhì)重組進(jìn)入凝聚期或所謂的包圍核仁(sn)構(gòu)型所證明的。在另一具體實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小確定的時(shí)間。更具體地，在coc取出時(shí)確定卵泡大小，例如通過超聲成像。直徑為1至5mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少48h。直徑>5至10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少24小時(shí)，優(yōu)選的是直徑大于10mm的卵泡在獲能培養(yǎng)基中保持至少2小時(shí)。在熒光顯微鏡下評(píng)估評(píng)估在核水平的卵母細(xì)胞成熟，即卵母細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)重塑。

在具體實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與非貼壁或貼壁培養(yǎng)板中、特別是非貼壁培養(yǎng)板中的獲能培養(yǎng)基接觸。

在另一實(shí)施方案中，所述獲能培養(yǎng)基的用途，用于使哺乳動(dòng)物coc的卵母細(xì)胞維持在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)?；诰S持卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂阻滯中而不影響其進(jìn)一步成熟的能力，當(dāng)與當(dāng)前使用的ivm方法相比時(shí)，使用本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基創(chuàng)建了靈活的ivm方法。由于體外培養(yǎng)的擴(kuò)展可能具有靈活性，即獲能間隔-所有重要的技術(shù)工作(如微注射卵母細(xì)胞)現(xiàn)在都可以在正常工作時(shí)間內(nèi)。顯然，這是對(duì)當(dāng)前ivm操作步驟的重要實(shí)踐改進(jìn)。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基的用途是輔助再現(xiàn)技術(shù)的一部分。在具體實(shí)施方案中，所述輔助生殖技術(shù)包括體外受精或icsi。

基于使用本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基的其它應(yīng)用在于比通常使用的從較小卵泡獲得的coc的ivm性能的提高。

通過能夠使較小的卵泡成熟，人們；

-有可能低溫保存從小竇卵泡發(fā)育良好的成熟卵母細(xì)胞；

-有可能從小竇卵泡培養(yǎng)coc(在癌癥治療的情況下對(duì)于生育力保存領(lǐng)域是重要的)，其中coc將從比通過超聲引導(dǎo)的陰道前檢查穿刺的更小的卵泡解剖獲得。

本發(fā)明的另一方面是基于包含哺乳動(dòng)物coc體外成熟的獲能培養(yǎng)基的試劑盒的用途。所述試劑盒包含如本文所述的獲能培養(yǎng)基。在具體實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至50nmcnp、雌二醇和fsh。在具體實(shí)施方案中，試劑盒中的獲能培養(yǎng)基包含1至1000nm雌二醇。在另一實(shí)施方案中，試劑盒中的獲能培養(yǎng)基包含0.1至10miu/mlfsh。在又一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10ng/ml胰島素。在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至50nmcnp，優(yōu)選25nmcnp；1至1000nm雌二醇，優(yōu)選10nm雌二醇；和0.1至10miu/mlfsh，優(yōu)選2.5miu/mlfsh或1miu/mlfsh。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包含等量劑量的重組fsh、fsh類似物或fsh模擬分子。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10ng/ml胰島素，更特別是5ng/ml胰島素。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包含等量劑量的胰島素類似物或胰島素模擬分子。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含卵母細(xì)胞分泌因子。本文使用的卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何組合。在具體實(shí)施方案中，本文所用的卵母細(xì)胞分泌因子是重組蛋白或異二聚體蛋白。

在另一實(shí)施方案中，包含用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的獲能培養(yǎng)基的試劑盒的用途包括使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸至少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。更具體地，在包含獲能培養(yǎng)基的試劑盒的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸以誘導(dǎo)減數(shù)分裂阻滯并允許成熟。特別地，使coc與獲能培養(yǎng)基接觸足以達(dá)到晚期發(fā)育的時(shí)間，例如通過將卵母細(xì)胞的染色質(zhì)重組進(jìn)入凝聚期或所謂的包圍核仁(sn)構(gòu)型所證明的。在另一具體實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小確定的時(shí)間。更特別地，通過超聲成像在coc取出時(shí)確定卵泡大小。直徑為1至5mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少48h。直徑>5至10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少24小時(shí)，并且直徑大于10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少2小時(shí)。在熒光顯微鏡下評(píng)估核水平的卵母細(xì)胞成熟，即卵母細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)重塑。

本發(fā)明的另一方面是基于試劑盒的用途，試劑盒包含(a)收集培養(yǎng)基，其包含抑制天然存在的磷酸二酯酶的天然或人造化合物或天然的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂抑制劑；(b)如本文所述的獲能培養(yǎng)基；(c)成熟培養(yǎng)基；(d)貼壁和/或非貼壁培養(yǎng)板；和(e)使用該試劑盒的說明。

在本發(fā)明的特定方面，用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的試劑盒的用途包括使coc與收集培養(yǎng)基接觸至少30分鐘至最多2小時(shí)。在另一方面，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸至少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。更具體地，在包含收集培養(yǎng)基，獲能培養(yǎng)基，成熟培養(yǎng)基，貼壁和/或非貼壁培養(yǎng)板和使用說明的試劑盒的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸以誘導(dǎo)減數(shù)分裂阻滯并允許成熟。特別地，使coc與獲能培養(yǎng)基接觸足以達(dá)到晚期發(fā)育的時(shí)間，例如通過將卵母細(xì)胞的染色質(zhì)重組進(jìn)入凝聚期或所謂的包圍核仁(sn)構(gòu)型所證明的。在另一具體實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小確定的時(shí)間。更具體地，在coc取出時(shí)確定卵泡大小，例如通過超聲成像。直徑為1至5mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少48h。直徑>5至10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少24小時(shí)，并且直徑大于10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少2小時(shí)。

獲能期使得卵母細(xì)胞獲得恢復(fù)減數(shù)分裂的能力，這僅在減數(shù)分裂刺激被觸發(fā)后才進(jìn)行評(píng)估。在另一實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與成熟培養(yǎng)基(減數(shù)分裂刺激)接觸以允許卵母細(xì)胞的進(jìn)一步減數(shù)分裂成熟，這在倒置顯微鏡下通過生發(fā)泡破裂(gvbd)和第一極體(pb)的排出證明。

在具體實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與非貼壁或貼壁培養(yǎng)板中的獲能培養(yǎng)基接觸。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的用途中，獲能培養(yǎng)基使哺乳動(dòng)物coc的卵母細(xì)胞維持在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的用途誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物coc的成熟。

在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的用途是輔助生殖技術(shù)的一部分。在具體實(shí)施方案中，所述輔助生殖技術(shù)包括體外受精或icsi。

本發(fā)明的編號(hào)實(shí)施方案如下：

1.用于未成熟哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟的獲能培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含0.1至50nmc型利尿鈉肽(cnp)、雌二醇和卵泡刺激素(fsh)；特別是包含10至50nmc型利尿鈉肽(cnp)；更特別是25nmcnp。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲能培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含1至1000nm雌二醇。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲能培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含0.1至10miu/ml卵泡刺激素(fsh)。

4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基還包含0.1至10ng/ml胰島素。

5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含卵母細(xì)胞分泌因子。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的獲能培養(yǎng)基，其中所述卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8，它們的類似物或其任何組合；特別是在獲能培養(yǎng)基中每個(gè)所述因子的濃度分別為10至100ng/ml。

7.用于未成熟哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟的方法，所述方法包括將未成熟的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體收集在收集培養(yǎng)基中，使哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體與包含0.1至50nmcnp(特別是10至50nmcnp)、雌二醇和fsh的獲能培養(yǎng)基接觸，并進(jìn)一步使哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體與成熟培養(yǎng)基接觸。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述獲能培養(yǎng)基包含1至1000nm雌二醇。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述獲能培養(yǎng)基包含0.1至10miu/mlfsh。

10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述獲能培養(yǎng)基還包含0.1至10ng/ml胰島素。

11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述獲能培養(yǎng)基包含卵母細(xì)胞分泌因子。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8，它們的類似物或其任何組合；特別是在獲能培養(yǎng)基中每個(gè)所述因子的濃度分別為10至100ng/ml。

13.根據(jù)權(quán)利要求7至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體是人卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。

14.根據(jù)權(quán)利要求7至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體與所述獲能培養(yǎng)基接觸至少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。

15.根據(jù)權(quán)利要求7至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體在非貼壁或貼壁培養(yǎng)板、特別是非貼壁培養(yǎng)板中與所述獲能培養(yǎng)基接觸。

16.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述未成熟卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體與收集培養(yǎng)基接觸最少30分鐘至最多2小時(shí)。

17.根據(jù)權(quán)利要求7至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法是輔助生殖技術(shù)的一部分。

18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述輔助生殖技術(shù)包括體外受精或icsi或生育力保存。

19.用于未成熟哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基。

20.用于未成熟哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟的試劑盒，所述試劑盒包含：

(a)收集培養(yǎng)基，其包含抑制天然存在的磷酸二酯酶的天然或人造化學(xué)化合物或卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的天然抑制劑；

(b)根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基；

(c)成熟培養(yǎng)基；

(d)非貼壁和/或貼壁培養(yǎng)板；和

(e)使用該試劑盒的說明。

21.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基用于哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟的用途。

22.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基的用途，其中所述哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體與所述獲能培養(yǎng)基接觸至少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。

23.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基的用途，其中所述哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體在非貼壁或貼壁培養(yǎng)板中與所述獲能培養(yǎng)基接觸；特別是用非貼壁培養(yǎng)板。

24.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基的用途，所述用途用于使哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中的卵母細(xì)胞維持在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)。

25.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基作為輔助生殖技術(shù)的一部分的用途。

26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的獲能培養(yǎng)基的用途，其中所述輔助生殖技術(shù)包括體外受精或icsi。

27.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基在生育力保存方法中的用途，例如在癌癥治療的情況下或在卵母細(xì)胞儲(chǔ)備入庫的情況下(后者，特別是年齡儲(chǔ)備者(35-40歲))。

28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途，其中所述生育力保存方法包括來自小竇卵泡的低溫保存。

29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的用途，其中所述獲能培養(yǎng)基用于所述低溫保存的小竇卵泡的體外成熟。

30.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基在癌癥治療的生育力保存中的用途。

31.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的獲能培養(yǎng)基在卵母細(xì)胞儲(chǔ)備入庫的生育力保存中的用途。

32.根據(jù)權(quán)利要求19或20的試劑盒用于哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟的用途。

33.根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒的用途，其中所述未成熟的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體與收集培養(yǎng)基接觸最少30分鐘至最多2小時(shí)。

34.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的試劑盒的用途，其中所述哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體與所述獲能培養(yǎng)基接觸至少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。

35.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的試劑盒的用途，其中所述哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體在非貼壁或貼壁培養(yǎng)板中與所述獲能培養(yǎng)基接觸；特別是用非貼壁培養(yǎng)板。

36.根據(jù)權(quán)利要求19或20的試劑盒的用途，所述用途用于使哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中的卵母細(xì)胞維持在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)。

37.根據(jù)權(quán)利要求19或20的試劑盒的用途，所述用途用于誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟。

38.根據(jù)權(quán)利要求19或20的試劑盒作為輔助生殖技術(shù)的一部分的用途。

39.根據(jù)權(quán)利要求38的試劑盒的用途，其中輔助生殖技術(shù)包括體外受精或icsi。

40.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的試劑盒作為生育力保存方法的一部分的用途；特別是在癌癥治療的情況下的生育力保存。

附圖的簡要說明

現(xiàn)在具體參考附圖，要強(qiáng)調(diào)的是，所示出的細(xì)節(jié)是通過舉例的方式并且僅用于說明性討論本發(fā)明的不同實(shí)施方案的目的。提供它們是為了提供被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的原理和概念方面最有用和容易理解的描述。在這方面，沒有試圖去示出比基本上理解本發(fā)明所需的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)更詳細(xì)的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。就附圖進(jìn)行的描述是用來指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐中如何可以實(shí)施本發(fā)明的若干形式。

圖1：cnp-22對(duì)減數(shù)分裂成熟進(jìn)展的劑量依賴性影響

在0(對(duì)照)、1、10、100nmcnp-22(a)以及與4ng/mlegf組合(b)的存在下，使排卵前coc體外成熟18小時(shí)。成熟期后，評(píng)估卵母細(xì)胞核成熟。每個(gè)條表示從三個(gè)重復(fù)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±sd(至少33個(gè)卵母細(xì)胞/處理)。不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖2：cnp-22延緩egfr依賴性減數(shù)分裂重新啟動(dòng)

(a)在0(對(duì)照)或25nmcnp-22+4ng/mlegf的存在下，將排卵前coc置于培養(yǎng)物中，在收集后2、4和6小時(shí)評(píng)估早期減數(shù)分裂恢復(fù)。(b)在25nmcnp-22或25nmcnp-22+4ng/mlegf的存在下，將排卵前coc置于培養(yǎng)物中，24小時(shí)后評(píng)估減數(shù)分裂成熟(減數(shù)分裂完成直至pb排出)。每個(gè)條表示從三個(gè)重復(fù)獲得的數(shù)據(jù)的平均值±sd(至少41個(gè)卵母細(xì)胞/處理)。不同字母或*表示顯著性差異(p<0.05)。

圖3：e2、fsh劑量和gdf9補(bǔ)充對(duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的影響

在25nmcnp-22單獨(dú)存在或與10nme2一起存在下，將未成熟的coc置于培養(yǎng)物中。評(píng)估了在48小時(shí)培養(yǎng)期間單獨(dú)加入2.5miu/ml或5miu/mlfsh或與50ng/mlgdf9組合對(duì)維持減數(shù)分裂阻滯的潛在影響。每個(gè)條表示從三個(gè)重復(fù)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±sd(至少38個(gè)卵母細(xì)胞/處理)。不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖4：48小時(shí)培養(yǎng)期(預(yù)ivm)對(duì)gv卵母細(xì)胞染色質(zhì)構(gòu)型和直徑的影響

在25nmcnp-22+10nme2的存在下，將未成熟的coc置于培養(yǎng)物中。評(píng)估了2.5miu/mlfsh或2.5miu/mlfsh+50ng/mlgdf9對(duì)卵母細(xì)胞的染色質(zhì)構(gòu)型(a)或卵母細(xì)胞直徑(b)的潛在補(bǔ)充作用。如材料和方法所述評(píng)估染色質(zhì)構(gòu)型，并評(píng)分為nsn、nsn/sn(過渡)和nsn。此外，還在分離后、培養(yǎng)前(0h)立即評(píng)估卵母細(xì)胞直徑。在(a)中，每個(gè)條代表從三個(gè)重復(fù)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±sd(至少46個(gè)卵母細(xì)胞/處理)。在(b)中，測(cè)量了至少31個(gè)gv卵母細(xì)胞/處理。不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

圖5：在預(yù)ivm+ivm之后評(píng)估卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量

在48小時(shí)預(yù)ivm期和18小時(shí)ivm期之后，卵母細(xì)胞體外受精，胚胎培養(yǎng)至多5天。評(píng)估參數(shù)為2-細(xì)胞率(受精)(a)、第5天的胚泡形成(第5天胚泡/2-細(xì)胞)(b)。(a)和(b)中的每個(gè)條表示從四個(gè)重復(fù)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(至少64個(gè)卵母細(xì)胞/處理)；結(jié)果顯示為平均值±sd。

(c)顯示兩個(gè)參考對(duì)照的2-細(xì)胞率和第5天的胚泡率(第5天胚泡/2-細(xì)胞)。從20日齡小鼠的小竇卵泡獲得未成熟的coc，并在100ng/mlereg[20do(ivm))的存在下體外成熟18小時(shí)。類似地，在48小時(shí)ecg激發(fā)(priming)接著14小時(shí)hcg之后，從25-27日齡小鼠獲得金標(biāo)準(zhǔn)、體內(nèi)生長的卵母細(xì)胞(對(duì)照)。這些對(duì)照的數(shù)據(jù)來自2個(gè)重復(fù)(至少56個(gè)卵母細(xì)胞/處理)(p<0.05)。

圖6：cnp對(duì)體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞連接的影響

在pde3抑制劑或cnp存在下培養(yǎng)48小時(shí)后，小鼠coc中的跨區(qū)域凸出物(transzonalprojection，tzp)。左圖是在存在pdp3抑制劑的情況下，右圖是在存在cnp的情況下。圍繞卵母細(xì)胞的透明帶被描繪并用箭頭指示。在pde3抑制劑的存在下，透明帶是黑色的，表示幾乎沒有任何跨區(qū)域凸出物。超出預(yù)期的是，在cnp的存在下，透明帶充滿了跨區(qū)域凸出物，充分表明卵丘卵母細(xì)胞連接。

圖7：體外培養(yǎng)的卵丘卵母細(xì)胞連接透明帶中的肌動(dòng)蛋白絲染色

暴露于cnp或pde3抑制劑的coc透明帶上的平均像素強(qiáng)度。在(a)中，org9935用作pde3的抑制劑，肌動(dòng)蛋白絲用結(jié)合德克薩斯紅的鬼筆環(huán)肽證實(shí)；而在(b)中，環(huán)己喹酰胺用作pde3的抑制劑，肌動(dòng)蛋白絲用actingreen^tm證實(shí)。(n＝分析的coc數(shù))。使用mannwhitney檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)比較cnp和pde3i組，其中a圖的p值為0.0082，而b圖的p值<0.0001。

圖8：在獲能培養(yǎng)過程中cnp和pde3i的存在對(duì)卵丘封閉卵母細(xì)胞從早期竇卵泡小鼠發(fā)育能力的差異化作用

獲能培養(yǎng)接著ivm之后受精率(a)和胚泡形成(b)。在兩種情況下，包括來自兩個(gè)參考對(duì)照的數(shù)據(jù)：1)無預(yù)先獲能培養(yǎng)的ivm對(duì)照&2)標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)對(duì)照(完全生長成熟的卵母細(xì)胞)。

圖9：18小時(shí)后減數(shù)分裂恢復(fù)。cnp-22對(duì)減數(shù)分裂成熟進(jìn)展的劑量依賴性影響。在cnp劑量范圍為0.1nm至1μm的情況下培養(yǎng)排卵前coc。包括對(duì)照條件(不含cnp的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。每個(gè)條表示從三次重復(fù)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±sd(平均為54個(gè)卵母細(xì)胞/處理)。星號(hào)表示相對(duì)于不含cnp的對(duì)照條件有顯著性差異(p<0.01)。圖a提供了具有完整生發(fā)泡(gv)的卵母細(xì)胞的百分比率(％)，其中完整的gv的存在指示減數(shù)分裂阻滯。圖b提供在生發(fā)泡破裂(gvbd)期卵母細(xì)胞的百分比，在減數(shù)分裂阻滯的情況下預(yù)期為低，并且圖c提供排出第一極體(pb)的卵母細(xì)胞的百分比，再次在分裂阻滯的情況下預(yù)期為低。

圖10：18小時(shí)后減數(shù)分裂恢復(fù)。cnp-53對(duì)減數(shù)分裂成熟進(jìn)展的劑量依賴性影響。在cnp劑量范圍為0.1nm至1μm的情況下培養(yǎng)排卵前coc。包括對(duì)照條件(不含cnp的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含有25nmcnp-22的陽性對(duì)照)。每個(gè)條表示從三次重復(fù)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±sd(平均為54個(gè)卵母細(xì)胞/處理)。星號(hào)表示相對(duì)于不含cnp的對(duì)照條件有顯著性差異(p<0.01)。圖a提供具有完整生發(fā)泡(gv)的卵母細(xì)胞的百分比率。圖b提供在生發(fā)泡破裂(gvbd)期卵母細(xì)胞的百分比。圖c提供排出第一極體(pb)的卵母細(xì)胞的百分比。

圖11：以每受精卵數(shù)(2pn)或每個(gè)初始coc數(shù)(coc)表示的優(yōu)質(zhì)胚胎(gqe)的成熟率、受精率和數(shù)量。黑條(n＝374名患者)：來自“常規(guī)ivf(icsi)領(lǐng)域的結(jié)果：反映歐洲當(dāng)前的icsi實(shí)踐。這些數(shù)據(jù)是從最常用的刺激療法(gnrh拮抗劑+hp-hmg)獲得的：來自公布的“megaset”數(shù)據(jù)的胚胎學(xué)數(shù)據(jù)：ferringpharmaceuticals的歐洲多中心多國研究，其中將所有胚胎培養(yǎng)至胚泡期。灰條(n＝413名患者)：當(dāng)從非-hcg觸發(fā)周期獲得卵母細(xì)胞時(shí)，用常規(guī)ivm(origiokit)獲得的結(jié)果。白條(n＝15)：對(duì)來自15名患者(其也給出用于獲能培養(yǎng)的coc)的卵母細(xì)胞使用“新獲能培養(yǎng)”步驟的結(jié)果。條紋白條(n＝15名患者)：這些結(jié)果來自15名患者的一部分卵母細(xì)胞的常規(guī)ivm(方法)，該組患者獲得獲能培養(yǎng)的coc(即與green組相關(guān)的“同胞(sibling)”)。

圖12：以每受精卵數(shù)(2pn)表示、每mii卵母細(xì)胞或每個(gè)初始coc數(shù)(coc)表達(dá)表示的第5天-第6天胚泡形成。黑條(n＝374名患者)來自“常規(guī)ivf(icsi)領(lǐng)域的結(jié)果：反映歐洲當(dāng)前的icsi實(shí)踐。這些數(shù)據(jù)是從最常用的刺激療法(gnrh拮抗劑+hp-hmg)獲得的：來自公布的“megaset”數(shù)據(jù)的胚胎學(xué)數(shù)據(jù)：ferringpharmaceuticals的歐洲多中心多國研究，其中將所有胚胎培養(yǎng)至胚泡期。灰條(n＝98名患者)：是來自98名患者的亞組的結(jié)果，如果有4個(gè)或更多的良好第3天胚胎，其胚胎只能進(jìn)一步培養(yǎng)至胚泡培養(yǎng)基。白條(n＝15)：對(duì)來自15名患者(其也給出用于獲能培養(yǎng)的coc)的卵母細(xì)胞使用“新獲能培養(yǎng)”步驟的結(jié)果。條紋白條(n＝5名患者)：是5名患者的亞組的結(jié)果，如果他們有4個(gè)或更多的“優(yōu)質(zhì)”第3天胚胎，那么胚胎才能進(jìn)一步培養(yǎng)成胚泡培養(yǎng)基。注意：這是常規(guī)ivm最傾向的“偏見”。點(diǎn)狀白條(n＝7)：來自“新獲能培養(yǎng)”步驟的7名同胞患者的亞組的結(jié)果；在它們具有4個(gè)或更多“優(yōu)質(zhì)”第3天胚胎的情況下，胚胎僅在胚泡培養(yǎng)基中才考慮它們的發(fā)育。注意：進(jìn)行這個(gè)亞組分析，以便對(duì)在常規(guī)ivm(條紋白條)中胚泡培養(yǎng)的策略進(jìn)行理想的比較。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及用于哺乳動(dòng)物輔助生殖技術(shù)的組合物和方法。具體地，本發(fā)明涉及用于哺乳動(dòng)物卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(coc)的體外成熟的組合物和方法。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：低劑量的cnp、雌二醇和fsh的組合成功地允許早期竇卵泡、特別是直徑低于9mm的小的早期竇卵泡的體外成熟。

本文所用的術(shù)語“卵泡”是指卵巢卵泡，其是雌性生殖生物學(xué)的基本單位，并且由在卵巢中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞的大致球形聚集體組成。卵泡含有單個(gè)卵母細(xì)胞。卵泡定期開始生長和發(fā)育，最終排卵通常是單個(gè)感受態(tài)卵母細(xì)胞。卵巢卵泡的細(xì)胞是卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和內(nèi)外膜(theca)層的細(xì)胞。

本文所用的術(shù)語“卵母細(xì)胞”包括單獨(dú)的卵母細(xì)胞或者與一種或多種其它細(xì)胞關(guān)聯(lián)的卵母細(xì)胞，例如作為卵母細(xì)胞復(fù)合物(coc)的一部分的卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞核被稱為生發(fā)泡。

本文所用的術(shù)語“卵丘細(xì)胞”是指發(fā)育中的卵巢卵泡中的細(xì)胞，其直接靠近或非常接近卵母細(xì)胞。卵丘細(xì)胞參與提供卵母細(xì)胞在受精時(shí)產(chǎn)生可用胚胎所必需的一些營養(yǎng)、能量和/或其它要求。

本文所用的術(shù)語“卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體”是指彼此物理結(jié)合的至少一個(gè)卵母細(xì)胞和至少一個(gè)卵丘細(xì)胞。通常，卵母細(xì)胞被緊密堆積的卵丘細(xì)胞層包圍，從而形成卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。

本文所用的輔助生殖技術(shù)或art包括處理雌性配子(卵母細(xì)胞)和雄性配子(精子)的所有生育治療(fertilitytreatment)。體外受精(ivf)是用于幫助不育夫婦妊娠的幾種輔助生殖技術(shù)之一。ivf是指從雌性卵巢中取出卵母細(xì)胞并在實(shí)驗(yàn)室程序中與精子受精的過程。

在常規(guī)art中，促性腺激素用于刺激卵巢在體內(nèi)產(chǎn)生許多具有成熟卵母細(xì)胞的大卵泡，而ivm主要旨在通過從來自未刺激或最小刺激的卵巢的小卵泡(直徑<12mm)取出(retrieve)未成熟卵母細(xì)胞來避免卵巢刺激的副作用。然而，與常規(guī)art相比，ivm后，卵母細(xì)胞的內(nèi)在發(fā)育能力降低。

卵母細(xì)胞的核成熟包括過程在前期i恢復(fù)減數(shù)分裂阻滯，并刺激減數(shù)分裂過程進(jìn)行到中期ii(mii期)，在該期通常發(fā)生受精。阻滯在前期i中的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出所謂的生發(fā)泡(gv-期)，其中核膜和核仁通過顯微鏡可見。當(dāng)卵母細(xì)胞經(jīng)歷所謂的gv破裂(gvbd期)，進(jìn)入mii期并排出第一極體(pb)時(shí)，核成熟變得明顯。細(xì)胞質(zhì)成熟是指準(zhǔn)備卵母細(xì)胞進(jìn)行活化，形成原核的過程以及直到植入完成之前進(jìn)行的發(fā)育路徑。經(jīng)歷gv期卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟的能力通常以逐步方式獲得。

卵母細(xì)胞體外成熟(ivm)是一種技術(shù)，其可以使得封閉在牢固凝聚的冠狀卵丘細(xì)胞層中g(shù)v期卵母細(xì)胞(如coc)成熟。通過施用人絨毛膜促性腺激素(hcg)觸發(fā)排卵之前或之后，可以通過超聲引導(dǎo)針穿刺獲得這些卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞ivm有可能簡化生育治療或降低與正常卵巢卵泡儲(chǔ)備或高卵巢卵泡儲(chǔ)備患者激素(hcg)刺激相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)和成本。這種卵泡儲(chǔ)備通常通過測(cè)量抗苗勒激素(amh)水平和通過月經(jīng)周期的第3天超聲引導(dǎo)的卵泡計(jì)數(shù)來確定。

art和ivm的成功在很大程度上取決于受精前卵母細(xì)胞的成熟度。從放置在培養(yǎng)物中時(shí)，從竇性細(xì)胞卵泡收獲的卵母細(xì)胞經(jīng)歷自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂，即進(jìn)行核成熟。這種核成熟可能常常發(fā)生在卵母細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷了完整的細(xì)胞質(zhì)成熟之前。這被認(rèn)為最終影響了受精的成功以及可能隨后的胚胎發(fā)育和植入。因此，ivm的主要挑戰(zhàn)是卵母細(xì)胞內(nèi)核細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)成熟過程的同步。延長的卵母細(xì)胞成熟期將促進(jìn)未成熟卵母細(xì)胞與充分調(diào)節(jié)的卵丘細(xì)胞之間的更長的相互作用。此外，小卵泡的ivm似乎更具挑戰(zhàn)性。從文獻(xiàn)中已知小的人卵泡不能表達(dá)足夠量的lh受體和/或egf和egf樣因子的受體系統(tǒng)。因此，誘導(dǎo)成熟的egf樣因子的主要級(jí)聯(lián)不能被激活。

在本發(fā)明中，不經(jīng)過在先hcg刺激或僅在hcg刺激后收集未成熟的哺乳動(dòng)物coc。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在coc收集之前沒有發(fā)生hcg刺激。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在體內(nèi)收集coc之前必須避免任何觸發(fā)劑，包括高劑量的fsh、lhrh、重組lh或lh類似物。

本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)：特定范圍的“低”劑量的c型利尿鈉肽(cnp)與雌二醇和fsh組合顯著地改善了哺乳動(dòng)物coc的ivm過程，特別是來自直徑小于9mm的小早期竇卵泡的那些coc。從下文的實(shí)例中可以進(jìn)一步看出，與應(yīng)用pde3抑制劑使coc維持在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)明顯不同，cnp具有鐘形劑量曲線。出乎意料的是，不僅非常低的劑量如0.1nm，而且非常高的劑量如1μm，均證明在將卵母細(xì)胞維持阻滯在gv期中不是最佳劑量。劑量曲線的這種差異意味著不同的內(nèi)在機(jī)制，使cnp治療不僅僅是延緩小的早期竇卵泡中減數(shù)分裂恢復(fù)的開始，如下文進(jìn)一步詳述。

因此，本發(fā)明的第一方面是提供用于哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的獲能培養(yǎng)基。獲能培養(yǎng)基包含0.1至50nmc型利尿鈉肽(cnp)、雌二醇和fsh。在具體實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含1至1000nm雌二醇。在另一實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含0.1-10miu/ml的fsh。在又一方面，獲能培養(yǎng)基包含等量劑量的重組fsh、fsh類似物或fsh模擬分子。在又一實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含0.1-10ng/ml胰島素。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的胰島素類似物或胰島素模擬分子。在又一實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至50nmcnp，優(yōu)選10-50nmcnp，最優(yōu)選10-25nmcnp，甚至更優(yōu)選25nmcnp；1至1000nm雌二醇，最優(yōu)選10nm雌二醇；0.1至10miu/mlfsh，最優(yōu)選2.5或1miu/mlfsh；和0.1至10ng/ml胰島素，最優(yōu)選5ng/ml胰島素。此外，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含卵母細(xì)胞分泌因子或卵母細(xì)胞分泌因子的組合。本文所用的卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何組合。在具體實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞分泌因子是重組蛋白。在又一方面，卵母細(xì)胞分泌因子是異二聚體蛋白。在又一另外的實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基優(yōu)選包含0.1至50nmcnp，優(yōu)選10-50nmcnp，最優(yōu)選10至25nmcnp，甚至更優(yōu)選25nmcnp；1至1000nm雌二醇，甚至更優(yōu)選10nm雌二醇；0.1至10miu/mlfsh，甚至更優(yōu)選2.5或1miu/mlfsh；0.1至10ng/ml胰島素，甚至更優(yōu)選5ng/ml胰島素；和選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何等同物或組合的卵母細(xì)胞分泌因子。

心房利尿鈉肽(anp)、腦利尿鈉肽(bnp)和c型利尿鈉肽是利尿鈉肽家族中研究最多的成員。cnp由利尿鈉肽前體c(nppc)基因編碼，其在不同的細(xì)胞類型中表達(dá)，其中前體nppc蛋白被切割成22個(gè)氨基酸的肽cnp。cnp激活其同源受體鳥苷酸環(huán)化酶b(gc-b)，也稱為利尿鈉肽受體b(nprb)，而anp和bnp刺激鳥苷酸環(huán)化酶a(gc-a)，也稱為利尿鈉肽受體a(npra)。gc-a和gc-b是通過生產(chǎn)第二信使cgmp發(fā)出信號(hào)的膜錨定鳥苷酸環(huán)化酶。cnp以自分泌/旁分泌方式起作用以誘導(dǎo)血管松弛和血管重塑，并調(diào)節(jié)骨生長。

cnp長度為22個(gè)氨基酸殘基(cnp-22)，并且還描述了具有53個(gè)氨基酸殘基的n-末端伸長形式(cnp-53)。anp、bnp和cnp以通過分子內(nèi)二硫鍵形成的17-殘基環(huán)結(jié)構(gòu)高度同源。nppc基因的遺傳序列可以在genbank、基因座nm_024409獲得。anp和bnp主要作為主要由心房和心室產(chǎn)生的心臟激素。cnp被認(rèn)為主要在腦中表達(dá)。然而，其他研究表明由培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和體內(nèi)血管產(chǎn)生cnp，通過各種細(xì)胞因子和生長因子增加cnp的產(chǎn)生。研究報(bào)道了nppc和nprb的卵巢表達(dá)及其由促性腺激素調(diào)節(jié)。最近的研究表明nppcmrna在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)以及cnp刺激卵丘細(xì)胞cgmp產(chǎn)生的能力。cgmp然后通過間隙連接從卵丘細(xì)胞擴(kuò)散到卵母細(xì)胞，并防止3型磷酸二酯酶(pde3)依賴性camp降解，因此維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。

從以下實(shí)例將會(huì)變得明顯，低劑量的cnp與雌二醇和fsh的組合對(duì)于延長cnp誘導(dǎo)的減數(shù)分裂阻滯是至關(guān)重要的。cnp在coc中有效地維持減數(shù)分裂阻滯至少24小時(shí)，但僅cnp不足以維持減數(shù)分裂阻滯48小時(shí)。因此，單獨(dú)的cnp不允許小的早期竇卵泡的ivm，長期體外培養(yǎng)期對(duì)于成功成熟是至關(guān)重要的。然而，低劑量的cnp與雌二醇的組合允許coc長期維持減數(shù)分裂阻滯，但是ivf后卵母細(xì)胞的最終胚胎質(zhì)量不足。此外，除了cnp和雌二醇之外，向獲能培養(yǎng)基補(bǔ)充fsh也能使coc長期維持在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)。另外，補(bǔ)充fsh改善減數(shù)分裂恢復(fù)，增加卵母細(xì)胞直徑，并提高ivf過程后的胚胎質(zhì)量。

fsh是由垂體前葉促性腺激素細(xì)胞合成和分泌的一種激素。fsh調(diào)節(jié)人體的發(fā)育、生長、青春期成熟和生殖過程。fsh和促黃體激素(lh)在生殖中協(xié)同作用。在卵巢中，fsh刺激未成熟卵泡生長成熟。隨著卵泡生長，它釋放阻斷fsh生產(chǎn)的抑制素。fsh是二聚糖蛋白。lh、fsh、tsh和hcg的α亞單位是相同的，并含有92個(gè)氨基酸。fsh具有118個(gè)氨基酸的β亞單位，其賦予其特異性生物學(xué)作用并且負(fù)責(zé)與fsh受體的相互作用。

對(duì)于臨床使用，可以使用各種制劑。它通常用于不孕癥治療以刺激卵泡發(fā)育。fsh可以例如pergonal或menopur(其是尿純化的促性腺激素)以及作為重組fsh(例如gonalf、puregon)的純形式并且作為例如gonal-f、gonal-frff、gonal-frffpen與lh或hcg。fsh的類似物也是臨床有用的，并且包括所有生物活性突變體形式(例如其中一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多氨基酸從天然形式改變)，聚乙二醇化fsh，單鏈雙功能突變體，fsh-ctp等。還開發(fā)了長效fsh療法，包括fsh-ctp(corifollitropinalfa，其中fsh的β亞單位通過hcg的c末端肽(ctp)部分連接)如elonva。

胰島素是在調(diào)節(jié)體內(nèi)碳水化合物和脂肪代謝中發(fā)揮重要作用的激素。在靶細(xì)胞中，胰島素通過激活具有酪氨酸激酶活性的膜受體起始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致葡萄糖攝取和儲(chǔ)存增加。同樣在卵母細(xì)胞中，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)是有活性的。胰島素與fsh協(xié)同促進(jìn)顆粒細(xì)胞分化和功能。對(duì)于臨床用途，重組胰島素也是可用的。胰島素作為人工血清替代品(syntheticserumreplacement，ssr)的一部分用于診所中。ssr是廣泛用于胚胎培養(yǎng)的不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)基成分。

卵母細(xì)胞分泌因子是卵母細(xì)胞分泌的旁分泌因子，是正常粒細(xì)胞和膜細(xì)胞功能所必需的。本文所用的術(shù)語“卵母細(xì)胞分泌因子”應(yīng)被理解為是指由卵母細(xì)胞分泌的作用于顆粒細(xì)胞以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞中的關(guān)鍵功能如增殖、分化、葡萄糖代謝和膽固醇生物合成的因子。卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何等同物。gdf-9是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員。卵母細(xì)胞的gdf-9表達(dá)從初級(jí)卵泡期開始，并通過排卵持續(xù)。本文所用的“gdf-9”是指gdf-9蛋白、其單個(gè)亞單位、其單個(gè)亞單位的多聚體、gdf-9的功能片段或部分、gdf-9的功能等同物和/或類似物。本文所定義的“gdf-9”的功能等同物或片段包括經(jīng)修飾的gdf-9蛋白，使得所得gdf-9產(chǎn)物具有類似于gdf-9的活性。

bmp-15是轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)超家族的成員。它被作為前原肽(prepropeptide)合成、切割，然后加工成二聚體蛋白質(zhì)。bmp-15可形成同二聚體，也可與gdf-9形成異二聚體。本文所用的“bmp-15”是指bmp-15蛋白、其單個(gè)亞單位、其單個(gè)亞單位的多聚體、bmp-15的功能片段或部分、以及bmp-15的功能等同物和/或類似物。本文所定義的“bmp-15”的功能等同物或片段包括經(jīng)修飾的bmp-15蛋白，使得所得bmp-15產(chǎn)物具有類似于bmp-15的活性。

fgf-8是成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)家族的成員。在成人卵巢中，fgf-8在卵母細(xì)胞中表達(dá)，并且在顆粒細(xì)胞中報(bào)道了fgf受體的表達(dá)。在卵母細(xì)胞成熟期間，fgf-8與其他卵母細(xì)胞分泌因子一起促進(jìn)卵丘細(xì)胞中的糖酵解。本文所用的“fgf-8”是指fgf-8蛋白、其單個(gè)亞單位、其單個(gè)亞單位的多聚體、fgf-8的功能片段或部分、以及fgf-8的功能等同物和/或類似物。本文所定義的“fgf-8”的功能等同物或片段包括經(jīng)修飾的fgf-8蛋白，使得所得fgf-8產(chǎn)物具有類似于fgf-8的活性。

在另一實(shí)施方案中，獲能培養(yǎng)基包含與選自gdf-9、bmp-15、fgf-8的卵母細(xì)胞分泌因子或組合的卵母細(xì)胞分泌因子組合的cnp、雌二醇和fsh或其任何組合。如下文所述的實(shí)施例所證明的，生長因子和激素的這種組合顯著改善了來自小竇卵泡的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力和最終胚胎質(zhì)量。特別地，將gdf-9添加到獲能培養(yǎng)基中促進(jìn)了卵母細(xì)胞染色質(zhì)構(gòu)型重塑進(jìn)入凝聚期、卵母細(xì)胞直徑和卵母細(xì)胞以及胚胎質(zhì)量。

本發(fā)明的另一方面是如上文所述的用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的獲能培養(yǎng)基的用途。所述用途包括使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸最少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。特別地，coc與獲能培養(yǎng)基接觸足以達(dá)到晚期發(fā)育的時(shí)間，例如通過將卵母細(xì)胞的染色質(zhì)重組進(jìn)入凝聚期或所謂的包圍核仁(sn)構(gòu)型所證明的。在另一具體實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小確定的時(shí)間段。

在未成熟的哺乳動(dòng)物coc中使用包含cnp、雌二醇和fsh的獲能培養(yǎng)基誘導(dǎo)減數(shù)分裂阻滯。本發(fā)明典型地，并且從下文的實(shí)施例可以看出，使用包含cnp、雌二醇和fsh的獲能培養(yǎng)基可使卵母細(xì)胞能夠進(jìn)行最多96小時(shí)的延長的“獲能”培養(yǎng)。結(jié)果，這種延長的減數(shù)分裂阻滯期允許來自小卵泡的卵母細(xì)胞存活、生長并進(jìn)入進(jìn)一步的晚期發(fā)育階段，目的是獲得更高的生殖能力。到目前為止，這些小卵泡的體外成熟一直是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)槁涯讣?xì)胞在減數(shù)分裂阻滯下能夠存活的培養(yǎng)條件和時(shí)間太短而不能獲得充分的核和發(fā)育能力。如實(shí)施例中進(jìn)一步所示，在沒有cnp的情況下，自發(fā)地恢復(fù)減數(shù)分裂的卵泡卵母細(xì)胞最少。相比之下，當(dāng)用1nm、10nm、25nm或50nmcnp處理時(shí)，幾乎100％的卵母細(xì)胞可以維持在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)。

本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基不僅可以延長卵母細(xì)胞的培養(yǎng)，而且cnp的存在同樣維持卵丘-卵母細(xì)胞連接，對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育能力有顯著的改善，特別是當(dāng)與本發(fā)明使用的pde3抑制劑使coc維持在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)時(shí)相比較。

在使用如本文所述的獲能培養(yǎng)基之后，卵母細(xì)胞將能夠達(dá)到晚期發(fā)育階段。通過用hoechst染色并在熒光顯微鏡下分析，在gv卵母細(xì)胞中評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞的染色質(zhì)構(gòu)型。根據(jù)核仁周圍染色質(zhì)聚集的模式，染色質(zhì)構(gòu)型分為非包圍核仁(nsn)、包圍核仁(sn)或過渡(nsn/sn)期。還記錄在用hoechst染色之前卵母細(xì)胞的直徑。此外，在獲能期后，可以誘導(dǎo)并通過在倒置顯微鏡下評(píng)估核成熟期來分析減數(shù)分裂能力。卵母細(xì)胞的核成熟評(píng)分為gv(生發(fā)泡)期、gvbd(生發(fā)泡破裂)期和mii(中期)-或pb(極體)。隨著卵母細(xì)胞生長，它們獲得重新開始減數(shù)分裂的能力，這一過程也稱為減數(shù)分裂恢復(fù)。在該期，卵母細(xì)胞經(jīng)歷生發(fā)泡膜的破裂和染色體彼此分開。

在本發(fā)明中，coc與獲能培養(yǎng)基接觸足以達(dá)到晚期發(fā)育階段的時(shí)間，例如通過將卵母細(xì)胞的染色質(zhì)重組進(jìn)入凝聚期或sn構(gòu)型來證明。此外，哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小決定的時(shí)間段。卵泡大小在coc取出時(shí)、例如通過超聲成像確定。直徑為1至5mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少48h。直徑>5至10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少24小時(shí)，并且直徑大于10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少2小時(shí)。

在另一實(shí)施方案中，使用獲能培養(yǎng)基是輔助生殖技術(shù)、特別是體外受精和icsi的一部分。

本發(fā)明還提供了用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟方法。在所述方法中，將未成熟的coc收集在收集培養(yǎng)基中并與收集培養(yǎng)基接觸最少30分鐘至最多2小時(shí)。同樣在所述方法中，并且在與收集培養(yǎng)基接觸之后，哺乳動(dòng)物coc與如上所述的獲能培養(yǎng)基接觸以維持減數(shù)分裂阻滯并促進(jìn)卵丘-卵母細(xì)胞相互作用。最后，使哺乳動(dòng)物coc與成熟培養(yǎng)基進(jìn)一步接觸以使卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟。

在具體實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，將未成熟的coc與收集培養(yǎng)基接觸最少30分鐘至最多2小時(shí)。

所述收集培養(yǎng)基包含抑制天然存在的磷酸二酯酶的天然或人造藥物化合物，或包含通常稱為減數(shù)分裂阻滯劑(arrester)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)天然抑制劑。所述天然抑制劑可以選自cnp、次黃嘌呤或其類似物。使用這種收集培養(yǎng)基允許從非常小的竇卵泡取出coc，而不必在發(fā)情或月經(jīng)周期的任何時(shí)刻強(qiáng)制需要卵巢刺激。在收集培養(yǎng)基中存在減數(shù)分裂阻滯劑的目的是阻止camp從收集的coc中的減少，特別是防止在具有這種能力的那些中重新開始減數(shù)分裂，即那些核成熟-并且保持卵母細(xì)胞和卵丘之間的互連條件“正確”。所述收集培養(yǎng)基在coc收集期間使用，作為穿刺coc從穿刺針轉(zhuǎn)移入的培養(yǎng)基。在該收集培養(yǎng)基中，新鮮分離的coc優(yōu)選保持最少30分鐘至最多2小時(shí)。該收集培養(yǎng)基的主要目的是使coc在與卵泡液和其它污染細(xì)胞分開的同時(shí)保持最佳的功能狀態(tài)。coc作為分開的實(shí)體被分離以被轉(zhuǎn)移到“獲能培養(yǎng)基”。

在根據(jù)本發(fā)明的體外方法的另一實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與如上所述的獲能培養(yǎng)基接觸。在所述方法中，使哺乳動(dòng)物coc與包含cnp、雌二醇和fsh的獲能培養(yǎng)基接觸最少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。特別地，在體外成熟方法中，使coc與獲能培養(yǎng)基接觸足以達(dá)到晚期發(fā)育階段的時(shí)間，例如通過將卵母細(xì)胞的染色質(zhì)重組進(jìn)入凝聚期或所謂的包圍核仁(sn)構(gòu)型所證明的。更特別地，在體外成熟方法中，通過在倒置顯微鏡下評(píng)估核成熟期來分析減數(shù)分裂重新開始。卵母細(xì)胞的核成熟被評(píng)分為gv(生發(fā)泡)期、gvbd(生發(fā)泡破裂)期和mii(中期)期或pb(極體)期。在另一具體實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小確定的時(shí)間。如本文已經(jīng)描述的，在coc取出時(shí)確定卵泡大小，例如通過超聲成像。直徑為1至5mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少48h。直徑>5至10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少24小時(shí)，并且直徑大于10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少2小時(shí)。

在具體實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與非貼壁或貼壁培養(yǎng)板中的獲能培養(yǎng)基接觸。從以下實(shí)施例將會(huì)變得明顯，低劑量的cnp與雌二醇和fsh的組合對(duì)于延長cnp介導(dǎo)的減數(shù)分裂阻滯是至關(guān)重要的。cnp在coc中有效地維持減數(shù)分裂阻滯至少24小時(shí)，但單獨(dú)的cnp不足以維持減數(shù)分裂阻滯48小時(shí)。然而，低劑量的cnp與雌二醇的組合允許coc長期維持減數(shù)分裂阻滯，但是ivf后卵母細(xì)胞的最終胚胎質(zhì)量不是足夠高。除了cnp和雌二醇之外，向獲能培養(yǎng)基補(bǔ)充fsh也使coc長期維持在減數(shù)分裂阻滯狀態(tài)，但也增加了卵母細(xì)胞直徑，并提高了ivf過程后的胚胎質(zhì)量。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的體外方法中，將卵母細(xì)胞分泌因子如gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何組合加入到包含cnp、雌二醇和fsh的獲能培養(yǎng)基。類似于fsh，這些卵母細(xì)胞分泌因子改善了小竇卵泡卵母細(xì)胞的發(fā)育能力及其最終的胚胎質(zhì)量。

如前所述，在本發(fā)明的體外方法中，使coc進(jìn)一步與成熟培養(yǎng)基接觸。在該期并給予使用根據(jù)本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基的情況下，可以在補(bǔ)充有精選的生長因子的具有任意基礎(chǔ)組成的成熟培養(yǎng)基中成熟獲能的卵丘封閉的gv期卵母細(xì)胞。這些生長因子選自但不限于egf樣因子，例如雙調(diào)蛋白或上皮調(diào)節(jié)蛋白、fsh、lh、camp調(diào)節(jié)劑或其組合。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的體外成熟方法包括使coc與本文所述的獲能培養(yǎng)基接觸，并使coc與成熟培養(yǎng)基接觸，其特征在于成熟培養(yǎng)基由補(bǔ)充如本文所述精選的生長因子。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的試劑盒。所述試劑盒包含如本文所述的獲能培養(yǎng)基，其包含0.1-50nmcnp、雌二醇和fsh。在具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括包含1至1000nm雌二醇的獲能培養(yǎng)基。在另一實(shí)施方案中，試劑盒包含0.1至10miu/mlfsh。在又一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的重組fsh、fsh類似物或fsh模擬分子。在又一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至10ng/ml胰島素。在另一方面，獲能培養(yǎng)基包括等量劑量的胰島素類似物或胰島素模擬分子。在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含0.1至50nmcnp，優(yōu)選10至25nmcnp，甚至更優(yōu)選25nmcnp；1至1000nm雌二醇，優(yōu)選10nm雌二醇；0.1至10miu/mlfsh，優(yōu)選2.5或1miu/mlfsh；和0.1至10ng/ml胰島素。

在另一實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中，獲能培養(yǎng)基包含卵母細(xì)胞分泌因子。本文使用的卵母細(xì)胞分泌因子選自gdf-9、bmp-15、fgf-8或其任何組合。在具體實(shí)施方案中，本文使用的卵母細(xì)胞分泌因子是重組蛋白或異二聚體蛋白。在另一實(shí)施方案中，用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的試劑盒包含(a)收集培養(yǎng)基，其包含抑制天然存在的磷酸二酯酶的天然或人造化學(xué)化合物或卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的天然抑制劑，(b)如上所述的獲能培養(yǎng)基，(c)成熟培養(yǎng)基，(d)貼壁和非貼壁培養(yǎng)板，和(e)使用該試劑盒的說明。如本文所述，試劑盒可用于執(zhí)行本文所述的方法以及包含在試劑盒中的用于實(shí)施方法的說明。

本發(fā)明的另一方面公開了如上所述的用于哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的試劑盒的用途。在具體實(shí)施方案中，公開了如上所述包含獲能培養(yǎng)基的試劑盒的用途。該用途包括使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸至少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。更特別地，在包含獲能培養(yǎng)基的試劑盒的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸以維持減數(shù)分裂阻滯并允許核和細(xì)胞質(zhì)成熟。特別地，使coc與獲能培養(yǎng)基接觸足以達(dá)到晚期發(fā)育的時(shí)間，例如通過染色質(zhì)重塑成包圍核仁(sn)所證明的。在另一具體實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小確定的時(shí)間。如本文已經(jīng)描述的，在coc取出時(shí)確定卵泡大小，例如通過超聲成像。直徑為1至5mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少48h。直徑>5至10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少24小時(shí)，并且直徑大于10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少2小時(shí)。

獲能期使得卵母細(xì)胞能夠獲得恢復(fù)減數(shù)分裂的能力，這僅在減數(shù)分裂刺激被觸發(fā)(例如與成熟培養(yǎng)基接觸)之后評(píng)估。在倒置顯微鏡下進(jìn)行卵母細(xì)胞核成熟的評(píng)估，并且由生發(fā)泡破裂(gvbd)和第一極體(pb)的進(jìn)一步排出而證明。

在另一實(shí)施方案中，公開了包含以下內(nèi)容的試劑盒的用途：(a)收集培養(yǎng)基，其包含抑制天然存在的磷酸二酯酶的天然或人造化學(xué)化合物或卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的天然抑制劑，(b)如上所述的獲能培養(yǎng)基，(c)成熟培養(yǎng)基，(d)貼壁和/或非貼壁培養(yǎng)板，以及(e)使用試劑盒的說明。典型的是，用于未成熟哺乳動(dòng)物coc的體外成熟的試劑盒的用途包括使coc與收集培養(yǎng)基接觸至少30分鐘至最多2小時(shí)。在另一方面，在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸至少2小時(shí)至最多96小時(shí)的時(shí)間段。更特別地，在包含收集培養(yǎng)基、獲能培養(yǎng)、成熟培養(yǎng)基、貼壁和/或非貼壁培養(yǎng)板和使用說明的試劑盒的用途中，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸以維持減數(shù)分裂阻滯并允許成熟。特別地，使coc與獲能培養(yǎng)基接觸足以達(dá)到gvbd期并重新開始減數(shù)分裂的時(shí)間，從而達(dá)到晚期發(fā)育階段，例如通過包圍核仁(sn)所證明的。此外，使哺乳動(dòng)物coc與獲能培養(yǎng)基接觸一段由卵泡大小確定的時(shí)間。如本文已經(jīng)描述的，在coc取出時(shí)確定卵泡大小，例如通過超聲成像。直徑為1至5mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少48h。直徑>5至10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少24小時(shí)，并且直徑大于10mm的卵泡優(yōu)選在獲能培養(yǎng)基中保持至少2小時(shí)。

獲能期使卵母細(xì)胞能夠獲得恢復(fù)減數(shù)分裂的能力，這僅在減數(shù)分裂刺激被觸發(fā)(例如與成熟培養(yǎng)基接觸)之后評(píng)估。在倒置顯微鏡下進(jìn)行卵母細(xì)胞核成熟的評(píng)估，并且由生發(fā)泡破裂(gvbd)和第一極體(pb)的進(jìn)一步排出而證明。

在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物coc是人類coc。

本發(fā)明的其它方面是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，從受試者獲得卵母細(xì)胞的方法，用于操作卵母細(xì)胞的工具和設(shè)備，低溫保存方法，ivf方法，體外胚胎培養(yǎng)以及將胚胎置于患者生殖道中的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且本領(lǐng)域已知的任意此類合適的方法可以與本發(fā)明的方法和組合物結(jié)合使用。

可以通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。

實(shí)施例

實(shí)施例1

材料和方法

動(dòng)物模型

用于本研究的動(dòng)物是cbab6f1(c57bl/6jxcba/ca的f1雜交種)。這些動(dòng)物遵循國家法規(guī)進(jìn)行圈養(yǎng)和飼喂并得到了布魯塞爾自由大學(xué)(vrijeuniversiteitbrussel)倫理委員會(huì)的同意(項(xiàng)目編號(hào)：09-216-1)。

來自小竇卵泡的未成熟卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(coc)的收集和來自大竇卵泡的排卵前coc

為了收集未成熟的coc，在沒有預(yù)先的促性腺激素給藥的情況下，從青春期前小鼠(19-21日齡)的小竇卵泡收集第一波卵泡發(fā)育波的致密的coc。為了收集排卵前的coc(對(duì)照)，在用2.5iu馬絨毛膜促性腺激素(ecg,folligon,intervet,oss,thenetherlands)激發(fā)48小時(shí)后，通過穿刺青春期前雌性小鼠(25-27日齡)的大竇卵泡收集致密的coc。收集培養(yǎng)基由leibovitzl-15組成，含有10％熱滅活的胎牛血清(fbs)、100iu/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(均來自lifetechnologies，gent，belgium)并補(bǔ)充200μm3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(ibmx；sigma，schnelldorf，germany)，以在收集和預(yù)培養(yǎng)處理期間防止減數(shù)分裂重新啟動(dòng)。

coc培養(yǎng)

用于培養(yǎng)coc(預(yù)ivm和ivm期)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基由α-mem、2.5％fbs(二者均來自lifetechnologies，gent，belgium)和5ng/ml胰島素、5ug/mlapo-轉(zhuǎn)鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉(均來自sigma，schnelldorf，germany)。

對(duì)于預(yù)ivm實(shí)驗(yàn)，cnp-22得自phoenixeurope(karlsruhe,germany)，17-β-雌二醇得自sigma(schnelldorf,germany)并且生長和分化因子9(gdf9)得自r&dsystemseurope(oxon,unitedkingdom)。

對(duì)于涉及ivm的實(shí)驗(yàn)，使用重組表皮生長因子(r-egf)(roche；mannheim，germany)和重組小鼠上皮調(diào)節(jié)蛋白(ereg)(r&dsystemseurope；oxon，unitedkingdom)作為排卵刺激物，并且培養(yǎng)持續(xù)18小時(shí)。

其中所提及的將重組卵泡刺激素(fsh)(merck-serono，geneva，switzerland)加入到預(yù)ivm和ivm培養(yǎng)基中。

評(píng)估減數(shù)分裂重新啟動(dòng)

在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)，通過使用細(xì)孔玻璃移液管控制的口從致密或擴(kuò)展的卵丘細(xì)胞中機(jī)械游離卵母細(xì)胞。通過在裝備有hoffman調(diào)制對(duì)比度系統(tǒng)(nikon，tokyo，japan)的倒置顯微鏡下評(píng)估核成熟期分析減數(shù)分裂重新啟動(dòng)。核成熟評(píng)分為gv(生發(fā)泡期)、gvbd(當(dāng)gv不可見時(shí))、pb(在卵周隙中觀察到的第一極體)或deg(當(dāng)卵母細(xì)胞退化時(shí))。

評(píng)估卵母細(xì)胞的染色質(zhì)構(gòu)型

在預(yù)ivm培養(yǎng)前后，在生發(fā)泡卵母細(xì)胞中評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞的染色質(zhì)構(gòu)型。簡而言之，在評(píng)估減數(shù)分裂重新啟動(dòng)后，將gv卵母細(xì)胞用10μg/mlhoechst33258(sigma；schnelldorf,germany)染色5分鐘。在熒光顯微鏡(ix70；olympus)下分析核仁染色質(zhì)構(gòu)型。根據(jù)核仁周圍染色質(zhì)聚集的模式，染色質(zhì)構(gòu)型分為非包圍核仁(nsn)、包圍核仁(sn)或過渡(nsn/sn)期[27-29]。在用hoechst染色之前記錄這些卵母細(xì)胞中一些卵母細(xì)胞的直徑。

體外受精程序(ivf)

在評(píng)估卵母細(xì)胞發(fā)育能力的最終測(cè)試中，在預(yù)ivm+ivm培養(yǎng)期后，進(jìn)行體外受精(ivf)，然后進(jìn)行胚胎培養(yǎng)至胚泡期。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，使用100ng/mlereg作為減數(shù)分裂恢復(fù)的觸發(fā)劑。

用于ivf的培養(yǎng)基由m16培養(yǎng)基、3％牛血清白蛋白級(jí)分v(bsa)(二者均來自sigma，schnelldorf，germany)和非必需氨基酸(lifetechnologies，gent，belgium)組成。胚胎培養(yǎng)基由m16培養(yǎng)基和必需和非必需氨基酸(lifetechnologies，gent，belgium)組成。

從不同條件收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，并在ivf培養(yǎng)基中洗滌一次。使用獲自雄性cbab6f1的獲能精子(2×10⁶個(gè)精子/ml的最終稀釋度)在ivf培養(yǎng)基中進(jìn)行體外受精。在37℃、5％co2、5％o2和100％濕度下共孵育3.5小時(shí)后，推測(cè)的合子被剝離，洗滌兩次，并在20μl鋪了油的胚胎培養(yǎng)基中的10-15個(gè)受精卵組中在37℃、5％co2、5％o2和100％濕度下培養(yǎng)以進(jìn)行胚胎培養(yǎng)(irvinescientific，alere；sintdenijswestrem，belgium)。ivf后24小時(shí)對(duì)分裂(2-細(xì)胞)率進(jìn)行評(píng)分。在第5天，記錄胚泡發(fā)育和孵化。

還評(píng)估了20日齡小鼠的小竇卵泡未成熟的coc的能力，其經(jīng)歷了用100ng/mlereg的18小時(shí)ivm。

從用2.5iu的馬絨毛膜促性腺激素(ecg,)處理14小時(shí)然后用2.5iuhcg()(均來自intervet,thenetherlands)激發(fā)48小時(shí)的25-27日齡的雌性小鼠獲得體內(nèi)生長的卵母細(xì)胞(對(duì)照)。用相同的精子樣品給這些卵母細(xì)胞授精并在與ivm卵母細(xì)胞完全相同的條件下培養(yǎng)卵母細(xì)胞/胚胎。

統(tǒng)計(jì)分析

除非另有說明，否則結(jié)果顯示為平均值±sd。在不同體外條件下ivf后卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)率(每個(gè)減數(shù)分裂期)、染色質(zhì)構(gòu)型和胚胎發(fā)育的差異通過anova之后通過tukey多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，p<0.05。當(dāng)比較2個(gè)條件時(shí)，使用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較減數(shù)分裂恢復(fù)率。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前，轉(zhuǎn)換(反正弦)成百分比數(shù)據(jù)。

結(jié)果

cnp有效維持減數(shù)分裂阻滯并延緩egfr依賴性減數(shù)分裂恢復(fù)

在存在0(對(duì)照)、1、10、100nmcnp-22并結(jié)合4ng/mlegf的情況下，將從促性腺激素激發(fā)的小鼠(26-27日齡)取出的排卵前coc置于培養(yǎng)中18小時(shí)。

cnp-22對(duì)減數(shù)分裂阻滯的維持具有劑量依賴性作用。在100和10nm的劑量下，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的gv率顯著高于1nm和對(duì)照(96％、93％、48％和0％)(圖1a)

在egf存在下，觀察到cnp-22對(duì)pb率的劑量依賴性作用。在10和100nmcnp-22的劑量下，許多卵母細(xì)胞保持在gvbd期，因此與對(duì)照組和1nmcnp-22(分別為98％和92％)相比，pb率保持顯著更低(分別為35％和15％)(圖1b)。由于用10和100nmcnp處理觀察到的gvbd卵母細(xì)胞的比例更高，進(jìn)行了追蹤實(shí)驗(yàn)，以探索減數(shù)分裂恢復(fù)過程更慢的可能性。

將從促性腺激素激發(fā)的小鼠取出的排卵前coc在不存在(對(duì)照)或存在25nmcnp-22+4ng/mlegf的情況下置于培養(yǎng)中，并在2、4和6小時(shí)評(píng)估減數(shù)分裂成熟。在對(duì)照組中減數(shù)分裂恢復(fù)增加了2至6小時(shí)，但在相同時(shí)間段內(nèi)，cnp-22+egf處理組誘導(dǎo)的gvbd較少(≤11％)(圖2a)。此外，置于cnp-22+egf培養(yǎng)基中24小時(shí)的coc具有高發(fā)生的pb卵母細(xì)胞(93％)，這個(gè)數(shù)字比僅就cnp-22培養(yǎng)相同時(shí)間段的coc明顯更高(圖2b)。

總而言之，這些數(shù)據(jù)表明，cnp-22能夠維持減數(shù)分裂阻滯至少24小時(shí)，egfr信號(hào)傳導(dǎo)能夠誘導(dǎo)由cnp保持減數(shù)分裂阻滯的coc的減數(shù)分裂恢復(fù)，但速度較慢(vs對(duì)照6小時(shí)延緩)。

延長cnp誘導(dǎo)的未成熟的coc的減數(shù)分裂阻滯依賴于培養(yǎng)環(huán)境中雌二醇的存在

與上述研究類似；進(jìn)行了未成熟的coc的重復(fù)研究(高減數(shù)分裂/發(fā)育不足)。從小竇卵泡取出這樣的coc(如材料和方法中所述)并置于培養(yǎng)中48小時(shí)。結(jié)果表明，cnp-22可以維持減數(shù)分裂阻滯24小時(shí)但不能維持48小時(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)，因此設(shè)計(jì)了一種通過補(bǔ)充有e2、fsh和gdf9的培養(yǎng)基對(duì)cnp-22的反應(yīng)性的研究。

從19-20日齡的雌性小鼠的小竇卵泡中取出未成熟的coc，并在存在25nmcnp-22和存在或不存在10nm17-β-雌二醇的情況下置于培養(yǎng)中48小時(shí)；另外評(píng)估進(jìn)一步加入2.5或5miu/mlfsh和/或50ng/mlgdf9的效果。

在25nmcnp(單獨(dú))存在下培養(yǎng)的coc的卵母細(xì)胞主要不能維持減數(shù)分裂阻滯，因此在培養(yǎng)48小時(shí)后，gv率僅占coc總數(shù)的26％。相比之下，在25nmcnp-22加10nm17-β-雌二醇(e2)的存在下培養(yǎng)的coc的大多數(shù)卵母細(xì)胞有效維持在gv期(≥89％；圖3)中，而不管用fsh或gdf9補(bǔ)充。

fsh和gdf9補(bǔ)充對(duì)卵母細(xì)胞染色質(zhì)凝聚狀態(tài)、卵母細(xì)胞直徑和coc對(duì)egfr排卵信號(hào)傳導(dǎo)的反應(yīng)性的影響

在25nmcnp-22和10nm17-β-雌二醇的存在下，從雌性小鼠(19-20日齡)的小竇卵泡取出未成熟的coc，并置于培養(yǎng)中48小時(shí)(預(yù)ivm條件)并加入2.5miu/mlfsh或2.5miu/mlfsh+50ng/mlgdf9。這些預(yù)處理之后是含有egf的培養(yǎng)基的18小時(shí)的排卵刺激(ivm條件)。

預(yù)ivm處理前后卵母細(xì)胞的染色質(zhì)凝聚分析顯示培養(yǎng)48小時(shí)期間，卵母細(xì)胞的染色質(zhì)從主要的非包圍核仁(nsn)分散構(gòu)型轉(zhuǎn)變成包圍核仁(sn)凝聚構(gòu)型。事實(shí)上，在預(yù)ivm之前，34％的卵母細(xì)胞具有過渡nsn/sn構(gòu)型(66％nsn)，而在預(yù)ivm前，≥68％的卵母細(xì)胞在每種條件下顯示sn模式(圖4a)。在2.5miu/mlfsh+50ng/mlgdf9存在下培養(yǎng)的卵母細(xì)胞中觀察到sn模式無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但絕對(duì)數(shù)量較高(86％)。

此外，在含有fsh的培養(yǎng)基(w/ogdf9)中預(yù)ivm培養(yǎng)之后獲得的卵母細(xì)胞的平均直徑比在沒有fsh的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵母細(xì)胞顯著更大。因此，緊接從卵泡分離后(預(yù)ivm前)，卵母細(xì)胞直徑為71.9±2.1μm，而培養(yǎng)48小時(shí)后，卵母細(xì)胞直徑如下：cnp+e2、cnp+e2+fsh和cnp+e2+fsh+gdf9分別為72.1±1.7μm；73.5±1.7μm和73.3±1.4μm(圖4b)。

在預(yù)ivm之后，用egf刺激一些coc減數(shù)分裂恢復(fù)，18小時(shí)后評(píng)估其pb率。由于在ivm培養(yǎng)基中在cnp存在下延緩減數(shù)分裂重新啟動(dòng)(見前面的實(shí)驗(yàn)：cnp有效維持減數(shù)分裂阻滯并延緩egfr依賴性減數(shù)分裂恢復(fù))；出于實(shí)際原因，在該實(shí)驗(yàn)中，從ivm培養(yǎng)基中省略了cnp。來自3個(gè)培養(yǎng)條件的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出較高的減數(shù)分裂恢復(fù)率：cnp+e2、cnp+e2+fsh和cnp+e2+fsh+gdf9的pb率分別為79％、78％和82％。

在cnp、fsh和gdf9存在下預(yù)ivm改善卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量

研究了經(jīng)歷預(yù)ivm接著ivm培養(yǎng)期的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精，并且胚胎培養(yǎng)直至第5天。

對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，在ivm期期間使用ereg作為減數(shù)分裂觸發(fā)劑，并且僅將cnp和gdf9添加到預(yù)ivm培養(yǎng)基中并從ivm培養(yǎng)基中省略。

在預(yù)ivm和ivm培養(yǎng)期之后，來自所有處理的卵丘細(xì)胞表現(xiàn)出響應(yīng)于ereg的大量擴(kuò)展和粘液化。

不同處理方式2-細(xì)胞(受精)率沒有差異(cnp+e2、cnp+e2+fsh和cnp+e2+fsh+gdf9分別為60％、54％和56％)。與cnp+e2條件相比，在含有fsh或fsh+gdf9的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵母細(xì)胞的第5天胚泡/2-細(xì)胞的比率較高；后者顯著(圖5)。

作為參考，1)經(jīng)歷ivm(沒有預(yù)ivm培養(yǎng))的未成熟的coc和2)用ecg接著hcg卵巢過度刺激之后體內(nèi)生長的卵母細(xì)胞的能力顯示在圖5c中。

實(shí)施例2

上述實(shí)驗(yàn)表明，根據(jù)本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基的用途不僅使卵母細(xì)胞維持在減數(shù)分裂阻滯下，而且是在不影響這些coc進(jìn)行ivm的能力的情況下這樣做的。然而，cnp的作用不能僅僅視為經(jīng)作用于磷酸二酯酶(pde，負(fù)責(zé)減數(shù)分裂恢復(fù)期間卵母細(xì)胞內(nèi)camp降解的酶)而具有該作用；因?yàn)楂@能培養(yǎng)期間卵母細(xì)胞發(fā)育能力大大提高。因此，假設(shè)在“低”劑量下，通過保持卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間良好的通訊，cnp(特別是濃度范圍為1nm至50nmcnp)具有進(jìn)一步的(另外的)改善卵母細(xì)胞發(fā)育能力的作用。

在存在camp調(diào)節(jié)劑(特別是在使用pde3抑制劑的預(yù)成熟培養(yǎng)中)的情況下，在培養(yǎng)coc時(shí)，已經(jīng)清楚地報(bào)道了長期培養(yǎng)中卵丘-冠和卵母細(xì)胞之間斷開的問題是pde抑制劑方法的局限性(nogueiraetal.,2003,nogueiraetal.,2006,vanhoutteetal.,2009a)。

為了證明包含cnp的獲能培養(yǎng)基實(shí)際上維持卵母細(xì)胞連接，將來自cbab6f1小鼠早期竇卵泡的卵母細(xì)胞復(fù)合物(coc)(同上)置于用于培養(yǎng)coc的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并暴露于cnp和作為比較物的兩種眾所周知的磷酸二酯酶抑制劑pde3-i(org9935和環(huán)己喹酰胺)。

材料和方法

動(dòng)物模型

用于本研究的動(dòng)物是cbab6f1(c57bl/6jxcba/ca的f1雜交種)。這些動(dòng)物遵循國家法規(guī)進(jìn)行圈養(yǎng)和飼喂并得到了布魯塞爾自由大學(xué)(vrijeuniversiteitbrussel)倫理委員會(huì)的同意(項(xiàng)目編號(hào)：14-216-1)。

coc培養(yǎng)

用于培養(yǎng)coc(預(yù)ivm和ivm期)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基由α-mem、2.5％fbs(二者均來自lifetechnologies，gent，belgium)和5ng/ml胰島素、5ug/mlapo-轉(zhuǎn)鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉(均來自sigma，schnelldorf，germany)。獲能培養(yǎng)基由補(bǔ)充有與10nme217-β-雌二醇組合的25nmcnp或1μmorg9935或1μm環(huán)己喹酰胺的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成。cnp獲自phoenixeurope(karlsruhe，germany)，而環(huán)己喹酰胺獲自enzolifesciences(antwerpen,belgium)。由于實(shí)驗(yàn)的目的是為了明白cnp和pde3抑制劑之間存在的潛在差異，避免fsh的潛在干擾是至關(guān)重要的，因此后者從獲能培養(yǎng)基中省略。在fsh存在的情況下進(jìn)行測(cè)試時(shí)，后者掩蓋了cnp對(duì)卵母細(xì)胞和周圍卵丘細(xì)胞層之間連接的影響，其自身對(duì)所述連接有貢獻(xiàn)，甚至在存在pde3抑制劑時(shí)也是明顯的(數(shù)據(jù)未示出)。

染色和圖像分析

通過用德克薩斯紅-鬼筆環(huán)肽或actingreen^tm熒光標(biāo)記f-肌動(dòng)蛋白，證明了跨區(qū)域凸出物(tzp，與卵母細(xì)胞連接的顆粒細(xì)胞的膜性延伸)，并且顯示為穿過透明帶的細(xì)絲(箭頭)。

結(jié)果

雖然三種化合物能夠維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯，但是出乎意料地顯示cnp是能夠保持卵母細(xì)胞和周圍卵丘細(xì)胞層之間雙向通訊所必需的跨區(qū)域凸出物的因子(圖6和圖7)。在圖7中，使用平均像素強(qiáng)度作為量化穿過透明帶的陽性肌動(dòng)蛋白染色(tzp)的工具。使用imagej進(jìn)行圖像分析，并且包括計(jì)算在卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間概括的感興趣區(qū)域(roi)上的平均像素強(qiáng)度，透明帶位于該區(qū)域。根據(jù)圖像分析，觀察到暴露于cnp的coc通過跨區(qū)域凸出物(tzp)保持更好的卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的連通性。在圖7(a)中，使用org9935作為pde3的抑制劑，用結(jié)合德克薩斯-紅的鬼筆環(huán)肽證實(shí)肌動(dòng)蛋白絲；而在圖7(b)中，使用環(huán)己喹酰胺作為pde3的抑制劑，用actingreen^tm證實(shí)肌動(dòng)蛋白絲。使用mannwhitney檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)比較cnp和pde3i組，其中圖a的p值為0.0082，圖b的p值<0.0001。

實(shí)施例3

如果上述結(jié)果表明cnp增強(qiáng)了coc中卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的連通性，以下結(jié)果旨在確定這是否會(huì)對(duì)早期竇卵泡培養(yǎng)的此類coc的發(fā)育能力產(chǎn)生影響。在本研究中，評(píng)估了在獲能培養(yǎng)過程中cnp和pde3i對(duì)來自早期竇卵泡的小鼠卵丘封閉卵母細(xì)胞發(fā)育能力的差異作用。由于實(shí)驗(yàn)的目的是為了明白cnp和pde3抑制劑之間存在的潛在差異，避免fsh的潛在干擾是至關(guān)重要的；因此，在該實(shí)驗(yàn)中，后者從獲能培養(yǎng)基中省略。

設(shè)置：

類似于實(shí)施例2；從早期竇卵泡(未刺激的19-20日齡小鼠)分離未成熟的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。在cnp或環(huán)己喹酰胺(pde3抑制劑)存在下，使coc置于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中48小時(shí)。

包括兩個(gè)參考對(duì)照：

1)對(duì)照條件，其在ivm之前不進(jìn)行獲能培養(yǎng)，

2)標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)對(duì)照，來自26-27日齡小鼠的完全生長成熟的卵母細(xì)胞。這些coc通過給予23-24日齡的小鼠48小時(shí)pmsg接著hcg獲得(ivf操作方案)。

在獲能培養(yǎng)之后，coc在表皮生長因子(egf)和體外受精的存在下成熟。評(píng)估受精后胚胎發(fā)育。

通過其成熟、受精(2-細(xì)胞率)和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)胚泡(通過第5天胚胎培養(yǎng))的能力來評(píng)估在每種條件下卵母細(xì)胞能力的獲取。

統(tǒng)計(jì)分析

通過卡方檢驗(yàn)評(píng)估cnp和環(huán)己喹酰胺組之間的受精率和胚泡形成率差異。

結(jié)果

雖然在兩種處理的受精率上沒有觀察到差異(參見圖8(a))，但在cnp存在下獲能培養(yǎng)后，每個(gè)受精卵形成的胚泡數(shù)量顯著更高(見圖8(b))。

實(shí)施例2和3的結(jié)論

觀察到這兩項(xiàng)比較pde抑制劑和cnp的補(bǔ)充(complimentary)研究中關(guān)于卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量的出乎意料差異可歸因于cnp。這些結(jié)果表明，cnp具有超過那些經(jīng)3型磷酸二酯酶調(diào)節(jié)介導(dǎo)的作用。除了抑制pde3的作用外，cnp增加了卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的物理連通性，從而增強(qiáng)了完成卵母細(xì)胞最終發(fā)育(細(xì)胞質(zhì)成熟)所必需的因子的獲取。

實(shí)施例4

在實(shí)施例1中，已證實(shí)cnp-22對(duì)減數(shù)分裂阻滯的維持具有劑量依賴性作用。在以下研究中，進(jìn)行了包括更廣泛的cnp范圍的額外實(shí)驗(yàn)。

設(shè)置：

在本進(jìn)一步實(shí)施例中使用的材料和方法相應(yīng)地與實(shí)施例1中使用的材料和方法相同。從在48h馬絨毛膜促性腺激素(ecg,folligon,intervet,oss,thenetherlands)刺激后體內(nèi)生長的竇卵泡中分離24-26日齡小鼠的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。當(dāng)小鼠為22-24日齡大時(shí)，注射2.5iuecg。在下列劑量的cnp存在下，將具有至少2層卵丘細(xì)胞的完整coc置于培養(yǎng)中18小時(shí)的時(shí)間段：

-對(duì)照(無cnp)*

-0.1nm**

-1nm

-10nm

-50nm**

-100nm

-1μm**

*對(duì)照條件，其中培養(yǎng)基中不存在cnp。

**0.1nm、50nm和1μm新測(cè)試劑量(包括在權(quán)利要求書中)。

根據(jù)實(shí)施例1中提供的小鼠的先前劑量實(shí)驗(yàn)收集和培養(yǎng)coc。

統(tǒng)計(jì)分析

通過anova之后通過tukey多重比較檢驗(yàn)評(píng)估(每個(gè)減數(shù)分裂期)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)率的差異，p<0.01。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前，轉(zhuǎn)換(反正弦)成百分比數(shù)據(jù)。

結(jié)果：

總之，本發(fā)明的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)證實(shí)，cnp-22對(duì)減數(shù)分裂阻滯的維持具有劑量依賴性作用。通過在倒置顯微鏡下存在完整的生發(fā)泡(gv)證實(shí)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。

圖9a顯示1nm、10nm、50nm和100nm的劑量以≥80％(分別為80％、98％、94％和87％)的比率維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯。然而，與不含cnp的對(duì)照條件相比，僅10nm和50nm的劑量顯著更高(分別為98％、94％vs50％，p<0.01)。

在生發(fā)泡破裂(gvbd)期的卵母細(xì)胞百分比沒有記錄到顯著差異(圖9b)。

cnp劑量為1nm、10nm、50nm和100nm時(shí)，排出第一極體的卵母細(xì)胞比例低或缺乏排出第一極體的卵母細(xì)胞(pb率，圖9c)(與不含cnp的對(duì)照條件相比，后三個(gè)劑量顯著不同，p<0.001)，這匹配以下發(fā)現(xiàn)：在這些劑量cnp顯示更有效的維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的效果。

出乎意料的是，不僅非常低的劑量如0.1nm，而且非常高的劑量如1μm，被證明在維持卵母細(xì)胞阻滯在gv期中不是最佳劑量。

結(jié)論：

總而言之，這些數(shù)據(jù)表明，cnp-22能夠以1nm至100nm的劑量間隔以高于80％的比率在排卵前卵母細(xì)胞中維持減數(shù)分裂阻滯，并且與要求保護(hù)的優(yōu)選用于為了維持卵母細(xì)胞阻滯在gv期中的cnp劑量一致，其優(yōu)選為10-50nm，更優(yōu)選為10-25nm的劑量。因此，這種行為與pde3抑制劑的用途不同，其中增加劑量確實(shí)使卵母細(xì)胞持續(xù)阻滯。

實(shí)施例5

為了支持上述cnp效果不限于cnp-22本身，進(jìn)行了另外的實(shí)驗(yàn)以測(cè)試這些效果是否可以由cnp類似物再現(xiàn)。進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)以測(cè)試cnp類似物：cnp-53的作用。與cnp-22類似，cnp-53是含有53個(gè)氨基酸的序列的c型利尿鈉肽的主要內(nèi)源形式之一。

設(shè)置：

除了替代性使用cnp-53外，在本進(jìn)一步實(shí)施例中使用的材料和方法相應(yīng)地與實(shí)施例4中使用的材料和方法相同。從在48小時(shí)ecg刺激后體內(nèi)生長的竇卵泡中分離24-25日齡小鼠的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體。當(dāng)小鼠為22-23日齡大時(shí)，注射2.5iuecg。在下列劑量的cnp-53存在下，將完整的coc置于培養(yǎng)中18小時(shí)的時(shí)間段：

-對(duì)照(無cnp)*

-0.1nm

-1nm

-10nm

-50nm

-100nm

-1μm

-對(duì)照25nmcnp-22*

*包括兩個(gè)對(duì)照條件：1)25nmcnp-22(標(biāo)準(zhǔn)劑量已知并用于之前的實(shí)驗(yàn)中以維持減數(shù)分裂阻滯),2)對(duì)照條件，其中培養(yǎng)基中不存在cnp。

統(tǒng)計(jì)分析

通過anova之后通過tukey多重比較檢驗(yàn)評(píng)估(每個(gè)減數(shù)分裂期)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)率的差異，p<0.001。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前，轉(zhuǎn)換(反正弦)成百分比數(shù)據(jù)。

結(jié)果：

與使用cnp-22的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，cnp-53證實(shí)對(duì)維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯具有出乎意料的(最大)劑量依賴性作用。

圖10a顯示，與不含cnp的對(duì)照條件相比，1nm、10nm、50nm和100nm的cnp-53劑量以顯著更高的比率維持卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂阻滯(分別為66％、98％、72％和69％vs.18％，p<0.001)，與cnp-22對(duì)照相當(dāng)(75％，p<0.01)。

在生發(fā)泡破裂(gvbd)期的卵母細(xì)胞百分比中沒有記錄到顯著差異(圖10b)。

與不含cnp的對(duì)照條件相比，劑量為1nm、10nm、50nm和100nm時(shí)，排出第一極體(pb期)的卵母細(xì)胞的比例顯著不同(p<0.001)，并且這匹配以下發(fā)現(xiàn)：這些特定劑量cnp-53在維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯中顯示出更有效的效果(圖10c)。

出乎意料的是，不僅非常低的劑量如0.1nm，而且非常高的劑量如1μm，被證明在維持卵母細(xì)胞阻滯在gv期中不是最佳劑量。

結(jié)論：

總體來說，這些數(shù)據(jù)表明，與cnp-22相當(dāng)，cnp-53能夠以高比率在排卵前卵母細(xì)胞中維持減數(shù)分裂阻滯。此外，cnp-53有效的劑量類似于cnp-22的劑量：1nm、10nm、50nm和100nm，在1nm至100nmcnp范圍內(nèi)不同的表達(dá)；在10nm至50nm的劑量范圍內(nèi)具有在排卵前卵母細(xì)胞中維持減數(shù)分裂阻滯的最佳效果。

實(shí)施例6

從臨床前實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基對(duì)來自小卵泡的卵母細(xì)胞的成熟確實(shí)具有出乎意料的影響。在本研究中，已經(jīng)評(píng)估了使用本申請(qǐng)的獲能培養(yǎng)基的ivm方法對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛能是否會(huì)有影響，是否產(chǎn)生可受精的卵母細(xì)胞以及它們的胚泡形成潛力是否增加。

患者群體：

參與本研究的患者進(jìn)行ivm治療(n＝15)同意捐贈(zèng)一部分卵母細(xì)胞用于產(chǎn)生研究胚胎，并且具有以下特征：年齡<37歲；根據(jù)鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)(rotterdameshre/asrm-sponsoredpcosconsensusworkshopgroup,2004)的多囊卵巢綜合征(pco或pcos)的臨床病史。

在卵母細(xì)胞取出之前、在最后一次超聲掃描中患者具有30個(gè)或更多個(gè)卵泡的情況下，其中一部分(通常5-10名)被分配到新的ivm方法；其余的被分配到常規(guī)臨床ivm操作方案作為患者治療的一部分。

所有患者都接受了一項(xiàng)個(gè)性化刺激操作方案，其由累積劑量為600iu的hp-hmg(來自ferringpharmaceuticalssa的高度純化的人絕經(jīng)促性腺激素)組成。

一旦患者在超聲掃描中顯示平均直徑在10-12mm范圍內(nèi)的至少1個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡，則在最后一次hp-hmg注射后42小時(shí)計(jì)劃活體采卵(ovumpickup，opu)。

這項(xiàng)原理循證研究招募了15個(gè)同胞病例：

實(shí)驗(yàn)治療＝coc獲能(使用根據(jù)本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基)+ivm

常規(guī)臨床臂＝常規(guī)ivm(ivm方法學(xué)，vub改編)

未成熟卵母細(xì)胞取出，獲能培養(yǎng)，ivm和icsi

卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(coc)采用17號(hào)單內(nèi)腔針取自2-10mm卵泡，抽吸壓力為70mmhg，并收集到含有補(bǔ)充有25iu/ml肝素(heparinleo，leopharma，belgium)的50μmibmx(sigma)的“收集培養(yǎng)基”中。

將收集的卵泡抽吸物在收集培養(yǎng)基(每管3ml預(yù)填充收集培養(yǎng)基)中立即稀釋。從污染血細(xì)胞過濾收集管的內(nèi)容物(falcon細(xì)胞過濾器；篩孔徑70mm)，并從培養(yǎng)皿中收集coc并保持在收集培養(yǎng)基中最長時(shí)間為1小時(shí)。然后將coc洗滌并在37℃、6％co2的空氣中培養(yǎng)，在4孔ivf培養(yǎng)皿(nunc；thermofisherscientific；denmark)中每孔最多10個(gè)coc分組，每個(gè)孔含有500μl具有25nmcnp的“新獲能培養(yǎng)基”(即根據(jù)本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基)。

經(jīng)過22-26小時(shí)的獲能培養(yǎng)后，將coc徹底洗滌并轉(zhuǎn)移到含有100ng/ml人重組雙調(diào)蛋白(rhareg)和100miu/ml重組fsh(gonal-f)的ivm培養(yǎng)基中，并在相同的允許體外減數(shù)分裂成熟發(fā)生的培養(yǎng)條件中孵育30小時(shí)。

在ivm培養(yǎng)30小時(shí)后，通過使用透明質(zhì)酸酶(cookmedical)，在立體顯微鏡下從卵丘層機(jī)械和酶學(xué)地游離卵母細(xì)胞，并在倒置顯微鏡下評(píng)估卵母細(xì)胞成熟。

研究臂中涉及的成熟卵母細(xì)胞(排出pb的)用普通供體的精子進(jìn)行顯微注射，并且在icsi后至第5天(最終第6天)評(píng)估胚胎發(fā)育。

在標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估時(shí)間點(diǎn)記錄受精和胚胎發(fā)育。具有良好形態(tài)并被認(rèn)為是可轉(zhuǎn)移的第3天的胚胎[根據(jù)卵裂球數(shù)量(至少5個(gè)細(xì)胞)、碎片率(最大20％)，沒有證據(jù)表明卵裂球多成核和/或早期致密化]被歸類為“優(yōu)質(zhì)胚胎”(gqe)。

結(jié)果：

圖11和12將“新獲能培養(yǎng)+ivm”結(jié)果與對(duì)同胞卵母細(xì)胞的“常規(guī)ivm”進(jìn)行比較，面對(duì)歐洲icsi數(shù)據(jù)(來自正常刺激的周期)，并在uzbrussel(2014-2015)常規(guī)應(yīng)用ivm。

第一數(shù)據(jù)集(常規(guī)icsi(megaset))在374名用hp-hmg超排卵的患者中發(fā)布常規(guī)icsi結(jié)果，并從大卵泡中收集了卵母細(xì)胞(研究：(來源：devroeyetal.fertilsteril2012mar；97(3):561-71)

第二數(shù)據(jù)集(常規(guī)ivm(origio))是來自413名使用ivm培養(yǎng)基接受常規(guī)ivm治療的患者的uzbrussel數(shù)據(jù)。

最終和第三數(shù)據(jù)集(coc獲能+ivm)是與其用ivm培養(yǎng)基治療的同胞卵母細(xì)胞相比較的“新獲能培養(yǎng)+ivm”(即本專利申請(qǐng)的方法)的結(jié)果。

在人ivm之前應(yīng)用獲能培養(yǎng)法(即根據(jù)本發(fā)明的獲能培養(yǎng)基)對(duì)未成熟的coc的培養(yǎng)顯示出重要的益處：更高的核成熟率和更高的優(yōu)質(zhì)第3天胚胎和胚泡產(chǎn)量。

圖11中的箭頭(1)顯示，與常規(guī)ivm相比，卵母細(xì)胞成熟率得到很大提高。圖11中的箭頭(2)顯示受精率與常規(guī)icsi周期或常規(guī)ivm相等。圖11中的箭頭(3)顯示，與從大卵泡icsi周期成熟卵母細(xì)胞獲得的優(yōu)質(zhì)胚胎的比率相當(dāng)，每個(gè)初始coc數(shù)的第3天的優(yōu)質(zhì)胚胎(第3天gqe)的產(chǎn)量幾乎是常規(guī)ivm的兩倍。

圖12中的箭頭(4)是指以每受精卵數(shù)量(2pn)或每個(gè)mii卵母細(xì)胞表示的培養(yǎng)的第5天或第6天的優(yōu)質(zhì)胚泡的產(chǎn)量?！矮@能培養(yǎng)”的結(jié)果略高于常規(guī)ivm。然而，常規(guī)ivm胚泡只有在第3天胚胎學(xué)有利(第3天4個(gè)或更多的優(yōu)質(zhì)胚胎)的情況下才能進(jìn)一步生長的事實(shí)會(huì)積極地影響這些結(jié)果。因此，當(dāng)將相同的方法應(yīng)用于cnp(點(diǎn)狀白條)時(shí)，結(jié)果遠(yuǎn)優(yōu)于任何其他組。

圖12中的箭頭(5)是指在cnp組中以每個(gè)初始coc數(shù)表示的培養(yǎng)的第5天或第6天的優(yōu)質(zhì)胚泡的產(chǎn)量高于常規(guī)ivm(盡管該組具有陽性選擇偏倚)和與常規(guī)icsi周期更相當(dāng)。再次，在第3天應(yīng)用于cnp組的≥4gqe的策略在所有組中產(chǎn)生最好的結(jié)果。

結(jié)論

作為ivm治療的一部分，“新獲能培養(yǎng)”培養(yǎng)步驟的應(yīng)用增強(qiáng)了卵泡從小卵泡的成熟至類似于體內(nèi)生長的卵母細(xì)胞(從刺激后的大卵泡獲得)的程度。在早期胚胎發(fā)生過程中，這種更高成熟的效果是持久的，與傳統(tǒng)的ivm相比，導(dǎo)致兩倍量的優(yōu)質(zhì)胚胎。在早期胚胎發(fā)生過程中取得如此持久的效果超出預(yù)期，與目前使用的ivm方法相比，創(chuàng)造出靈活的ivm方法。