本發(fā)明涉及用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述藥物治療沒有α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏癥的受試者的與炎癥和/或不想要的免疫應(yīng)答相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥，其中所述干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含可操作地連接于(ii)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合的(i)α-1抗胰蛋白酶(aat)編碼區(qū)。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)是存在于骨髓和其他組織中的非造血來源的細(xì)胞。msc一般被認(rèn)為是多能成體祖細(xì)胞，其具有分化為有限數(shù)目的細(xì)胞譜系如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力?；谶@種直接分化為這些末期表型的能力，已經(jīng)對(duì)msc作為治療實(shí)體的用途進(jìn)行了研究，包括msc促進(jìn)或提高骨修復(fù)和用于修復(fù)軟骨缺損的用途(vilquin和rosset,再生醫(yī)學(xué)(regenerativemedicine)2006:1,4,p589以及veronesi等人,干細(xì)胞和發(fā)育(stemcellsanddevelopment)2013；22,p181)。已經(jīng)描述了用于許多治療性適應(yīng)癥的msc的分離和培養(yǎng)，并且這代表了針對(duì)治療炎癥相關(guān)障礙的有前途的方法(例如wo2010/119039)。

已知msc展示了施用于患者后的免疫逃逸特性。已經(jīng)顯示msc展示了在移植同種異體供體材料情況下有利的免疫調(diào)節(jié)作用(leblanc等人,lancet2004:363,p1439)，從而減少了潛在致病的同種異體反應(yīng)性和排斥。此外，已知msc顯示了抗腫瘤發(fā)生的作用，例如抗卡波西肉瘤(khakoo等人,jexpmed2006:203,p1235)。msc治療還可以在創(chuàng)傷愈合中起治療作用?？梢越?jīng)由全身注射進(jìn)行msc的治療遞送，然后msc歸巢并移入損傷的部位(kidd等人,干細(xì)胞(stemcells)2009:27,p2614)。雖然msc對(duì)受傷的組織具有再生作用是明顯的，但是它們作為感興趣的治療性轉(zhuǎn)基因蛋白的遞送載體的用途尚未被充分地探索。

炎性疾病和與不想要的免疫應(yīng)答有關(guān)的疾病代表了世界上健康問題和死亡率的重要原因。例如，炎性疾病(如肺部疾病或自身免疫性疾病)代表了需要改善炎癥調(diào)節(jié)以提供有效治療的醫(yī)學(xué)病癥。

肺部疾病(如呼吸系統(tǒng)疾病)可能嚴(yán)重影響患者的健康，并且涵蓋影響肺的器官和組織的許多病理狀況。作為肺部疾病的一個(gè)例子，呼吸系統(tǒng)疾病包括上呼吸道、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、肺泡、胸膜和胸膜腔以及呼吸的神經(jīng)和肌肉的病癥。呼吸系統(tǒng)疾病是全球死亡的主要原因之一。肺部感染(如肺炎和肺結(jié)核)、肺癌和慢性阻塞性肺疾病(copd)在2008年期間在世界上一共造成950萬人死亡，占全球死亡總數(shù)的六分之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織，四種呼吸系統(tǒng)疾病類別出現(xiàn)在全球十大死因之中，它們共占死亡人數(shù)的六分之一，以及損失的傷殘調(diào)整生命年(disability-adjustedlife-years)的十分之一。在歐盟的28個(gè)國(guó)家中，這些疾病占死亡人數(shù)的八分之一。為了減少炎癥，治療通常涉及抗炎藥物(如皮質(zhì)類固醇)的使用。鑒于肺部疾病的流行，需要新的治療策略。

自身免疫疾病是與個(gè)體對(duì)抗其身體的細(xì)胞、物質(zhì)或組織的免疫應(yīng)答相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥。一般人群中很少數(shù)人患有可能是急性或慢性的自身免疫性疾病，并且往往在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)衰弱。在自身免疫性疾病和炎性疾病兩者中，例如針對(duì)身體自身組織或蛋白質(zhì)的自身免疫性疾病中，醫(yī)學(xué)病癥通常通過人類適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和/或固有免疫系統(tǒng)的反應(yīng)產(chǎn)生。

具有重要意義的自身免疫性疾病的一個(gè)例子是1型糖尿病。1型糖尿病占所有糖尿病病例的5％至10％。全球每年約有80000名青年被診斷出患有1型糖尿病，據(jù)估計(jì)在美國(guó)共有300萬人患有1型糖尿病(chiang等人,糖尿病護(hù)理(diabetescare)2014:37,pp2034-55)。在患有1型糖尿病的患者中，胰腺β-細(xì)胞被β-細(xì)胞自身抗原、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞和t細(xì)胞淋巴細(xì)胞參與的自身免疫反應(yīng)破壞。由于這些患者缺乏胰腺β細(xì)胞，所以胰島素的產(chǎn)生減少，導(dǎo)致血液和尿液中的葡萄糖水平升高。目前的治療方法通常依賴于調(diào)節(jié)胰島素水平，而不直接解決潛在的免疫系統(tǒng)病理學(xué)。

具有重要意義的炎性疾病的一個(gè)例子是關(guān)節(jié)炎，例如痛風(fēng)(痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎)。痛風(fēng)是一種醫(yī)學(xué)病癥，其特征通常是在特定位置的復(fù)發(fā)性急性炎癥性關(guān)節(jié)炎，其導(dǎo)致腫脹和關(guān)節(jié)疼痛。大腳趾底部的跖趾關(guān)節(jié)是通常受影響的區(qū)域。痛風(fēng)通常被公認(rèn)是由血液中尿酸水平升高所引起，導(dǎo)致尿酸結(jié)晶，晶體沉積在患者體內(nèi)的關(guān)節(jié)、肌腱和周圍組織中。治療通常涉及抗炎藥的使用，例如非類固醇抗炎藥(nsaid)或皮質(zhì)類固醇，或阻止尿酸產(chǎn)生的藥物。

許多抗炎劑是已知的，如類固醇和非類固醇藥劑，其用于治療如關(guān)節(jié)炎的病癥。然而，這些藥物中的許多經(jīng)常導(dǎo)致不想要的副作用，尤其是長(zhǎng)時(shí)間使用后。對(duì)進(jìn)一步的抗炎劑的需求是明顯的，特別是在治療對(duì)輕度或短期治療反應(yīng)不良和/或?qū)е滦枰L(zhǎng)期治療的患者的不想要的副作用的炎性疾病或自身免疫性疾病的情況下。

α-1抗胰蛋白酶(也稱為a1at、aat、pi、serpina1)是約52kda的糖蛋白，其是最豐富的內(nèi)源絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin超家族)之一。aat被認(rèn)為是急性期蛋白，從而在急性炎癥時(shí)aat濃度可以提高許多倍。

α-1抗胰蛋白酶缺乏癥(α-1抗胰蛋白酶缺乏癥，a1ad)是導(dǎo)致α1-抗胰蛋白酶(a1at)生產(chǎn)缺陷的醫(yī)學(xué)障礙，導(dǎo)致血液和肺部中a1at活性降低和肝細(xì)胞中過多的異常a1at蛋白的沉積。serpina1中存在多于75種已知的不同突變，由此90％的aatd病例是由于pi*z錯(cuò)義突變：glu342lys。aat缺乏癥導(dǎo)致慢性的不受抑制的組織分解，由此嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶自由地分解肺泡間隙彈性蛋白，導(dǎo)致呼吸道并發(fā)癥如氣道炎癥和肺氣腫。

盡管已經(jīng)提出了用于重組功能性aat的基因治療方法，但aat缺乏癥的治療仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。例如，us2014/0142161a描述了通過使用基于重組腺相關(guān)病毒(raav)的載體增強(qiáng)aat的表達(dá)來用于治療aat缺乏癥的基因治療方法。

li等人(jhepatol2011:54,pp930-8)、ghaedi等人(tissueandcell2010:42,pp181-9)和li等人(molther2010:18,pp1553-8)描述了表達(dá)aat的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，并討論了其在治療aat缺乏癥方面，特別是在治療肝臟疾病方面的潛在用途。鑒于a1ad引起的疾病的嚴(yán)重程度，需要新的策略來增強(qiáng)患病受試者的aat產(chǎn)生。

盡管最近在治療aat缺乏癥中取得了初步進(jìn)展，但是在未患有aat缺乏癥的受試者中，aat在細(xì)胞治療方法中的治療潛能仍然很大程度上未被探索。ghaedi等人(jgenemed2011:13,pp171-80)證明了表達(dá)aat的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)的細(xì)胞毒作用，并討論了所述間充質(zhì)干細(xì)胞作為血管生成抑制劑的可能用途。根據(jù)本發(fā)明人的認(rèn)識(shí)，基于通過msc的轉(zhuǎn)基因aat的表達(dá)在治療炎性或自身免疫疾病中的細(xì)胞治療的應(yīng)用之前未被提出。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)，基于本發(fā)明的技術(shù)問題是提供供選擇的和/或改進(jìn)的治療炎性疾病和與不想要的免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病的手段。

通過獨(dú)立權(quán)利要求的特征解決這個(gè)問題。通過從屬權(quán)利要求提供了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。

因此，本發(fā)明涉及用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述藥物治療沒有α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏癥的受試者的與炎癥和/或不想要的免疫應(yīng)答相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥，其中所述干細(xì)胞包含外源核酸，所述外源核酸包含(i)α-1抗胰蛋白酶(aat)編碼區(qū)，所述α-1抗胰蛋白酶(aat)編碼區(qū)可操作地連接于(ii)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合。這樣的msc可以被稱為“aat修飾的msc”。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞(aat修飾的msc)，所述遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞用作藥物，所述藥物治療沒有α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏癥的受試者的與炎癥和/或不想要的免疫應(yīng)答相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥，其中醫(yī)學(xué)病癥選自由肺部炎性疾病、痛風(fēng)、慢性纖維化和自身免疫性疾病(尤其是1型糖尿病)組成的組。

通過沒有α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏癥的受試者的炎癥和/或不想要的免疫應(yīng)答的共同特征，統(tǒng)一化根據(jù)本發(fā)明的用aat修飾的msc治療的各種醫(yī)學(xué)指征(尤其是肺部炎性疾病、痛風(fēng)、慢性纖維化、自身免疫性疾病(尤其是1型糖尿病))?？紤]到aat修飾的msc的使用以前沒有被提出用于治療與α-1抗胰蛋白酶(aat)缺乏癥不相關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病，本發(fā)明的各種用途代表了統(tǒng)一的組的醫(yī)學(xué)指征。

尤其令人驚訝的是，aat修飾的msc能夠治療未顯示aat缺乏癥的受試者的與不想要的炎癥和/或免疫應(yīng)答相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥。

已經(jīng)提出了對(duì)aat缺乏癥受試者的aat補(bǔ)充，并且所述aat補(bǔ)充似乎代表了治療由功能性aat水平降低引起的許多病理狀況的有用方法。然而，之前沒有提出在具有功能性aat的患者中，通過msc介導(dǎo)的遞送增加的aat向炎癥部位的局部遞送可以為不想要的炎癥或免疫應(yīng)答提供治療方案。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員可能假設(shè)，將msc-aat施用于沒有aat缺乏癥的受試者可能導(dǎo)致由于aat過量而產(chǎn)生的潛在的副作用。此外，根據(jù)具有aat缺乏癥的受試者的aat替代療法，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果不會(huì)被認(rèn)為是顯而易見的，這是因?yàn)樘峁┻^量的aat不會(huì)照此被假設(shè)為在具有功能性aat的患者中提供治療益處。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)α1-抗胰蛋白酶缺乏癥(α1-抗胰蛋白酶缺乏癥，a1ad)是指導(dǎo)致α1-抗胰蛋白酶(a1at)產(chǎn)生缺損的任何病癥，如導(dǎo)致血液和肺中a1at活性降低，以及肝細(xì)胞中多多異常的a1at蛋白的沉積的遺傳疾病。例如，aat缺乏癥可以由serpina1中的75種已知的不同突變中的一種或多種表征，由此90％的aatd病例是由于pi*z錯(cuò)義突變：glu342lys。

因此，沒有這樣的aat缺乏癥的受試者是本文描述的醫(yī)療治療的優(yōu)選的預(yù)期受試者。

由于msc遷移到炎癥區(qū)域的能力，msc代表了用于遞送治療劑的合適工具。不受理論約束，本發(fā)明的msc代表了用于有效遞送在所述msc中由外源核酸表達(dá)的治療劑(即aat蛋白)的藥物遞送載體。此外，msc與aat的組合提供了意料不到的協(xié)同效應(yīng)。msc本身在歸巢和/或移植入發(fā)炎組織后，表現(xiàn)出關(guān)于炎癥區(qū)域的抗炎作用的有益特性，并且當(dāng)msc與作為治療性轉(zhuǎn)基因的aat偶聯(lián)時(shí)，msc提供增強(qiáng)的抗炎功能。

驚人地，在全身，優(yōu)選在靜脈內(nèi)施用細(xì)胞后，本文所述的msc的施用導(dǎo)致msc遷移至炎癥部位。除了來自aat修飾的msc中存在的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的增強(qiáng)的aat的局部抗炎作用以外，msc能夠在發(fā)炎組織的區(qū)域遷移和/或移植，從而提供來自msc自身的抗炎信號(hào)。本發(fā)明中使用的msc在全身或靜脈內(nèi)施用后還能在血流中循環(huán)，并且可以移植或結(jié)合于體內(nèi)的發(fā)炎區(qū)域，從而以局部方式發(fā)揮其功能。在由不想要的炎癥和/或不想要的免疫應(yīng)答限定的醫(yī)學(xué)病癥的治療中顯示aat表達(dá)增加(由于aat轉(zhuǎn)基因)的msc的組合提供了意想不到的協(xié)同作用，由此除了msc自身和aat轉(zhuǎn)基因兩者的抗炎特性之外，歸巢至炎癥升高的區(qū)域的msc提供了比以單獨(dú)的方式考慮時(shí)的每個(gè)獨(dú)立效應(yīng)之和更大的協(xié)同治療效果。

例如，當(dāng)aat作為治療性蛋白質(zhì)全身施用或在基因治療中以病毒載體施用時(shí)，由于缺乏靶向體內(nèi)發(fā)炎區(qū)域和可能出現(xiàn)脫靶作用導(dǎo)致的不想要的副作用，僅獲得了有限的益處。當(dāng)全身施用msc時(shí)，由于msc定位于發(fā)炎組織，可以從msc自身獲得一些積極作用，雖然由未修飾的msc誘導(dǎo)的抗炎反應(yīng)的強(qiáng)度可能不足以顯示出顯著的治療效果。在組成型啟動(dòng)子或條件型啟動(dòng)子下，表達(dá)作為轉(zhuǎn)基因的aat的msc的組合能夠以靶向和有效的方式協(xié)同組合aat和msc的固有性質(zhì)。例如，aat的局部作用對(duì)于治療各種炎性疾病是有益的，例如由不想要的免疫反應(yīng)表征的炎性疾病。aat能夠保護(hù)組織免于遭受炎性細(xì)胞的酶，并可以減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

通過msc的局部遞送提供過量的aat，在沒有aat缺乏癥的患者中提供所希望的治療益處，同時(shí)使由于脫靶效應(yīng)導(dǎo)致的過量aat的潛在副作用最小化。在該過程中，msc的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)與aat的抗炎作用協(xié)同作用以產(chǎn)生治療有效劑量的aat。由此，aat修飾的msc避免由于全身施用aat蛋白或編碼aat的核酸載體而導(dǎo)致的潛在的副作用和/或使所述的潛在的副作用最小化。由于msc向發(fā)炎組織的歸巢能力，使用msc作為施用aat的載體，在身體的患病區(qū)域中提供了aat的局部生產(chǎn)。

aat編碼區(qū)優(yōu)選是編碼天然存在或合成的aat蛋白序列的任意核酸，所述aat蛋白序列顯示了aat功能，與人aat相比具有減少的、相同的、相似的或增加的活性，或者功能上類似于aat。aat的氨基酸序列可從ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)1313184b獲得。分子生物學(xué)或遺傳學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以提供編碼aat的相應(yīng)核酸序列。本發(fā)明涵蓋顯示功能上類似于未修飾的人形式的aat的aat的序列變體的使用。

公布于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_000295.4上的serpina1編碼序列(cds)是一種優(yōu)選的實(shí)施方式，并且其包括全序列的第262至1518位堿基(seqidno1)：

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，cds是密碼子優(yōu)化的以提高蛋白生產(chǎn)。密碼子優(yōu)化后的編碼序列優(yōu)選閱讀如下(seqidno2)：

ggcatcaccaaggtgttcagcaacggcgccgatctgagcggcgtgacagaagaggcccctctgaagctgtccaaggccgtgcacaaagccgtgctgaccatcgacgagaagggcaccgaagccgctggcgccatgtttctggaagccatccccatgagcatcccccctgaagtgaagttcaacaagcccttcgtgttcctgatgatcgagcagaacaccaagagccccctgttcatgggcaaggtcgtgaaccccacccagaaa

根據(jù)seqidno1和/或2的核苷酸序列編碼根據(jù)seqidno3的氨基酸序列的人aat蛋白，所述seqidno3的氨基酸序列是本發(fā)明中優(yōu)選的：

mpssvswgilllaglcclvpvslaedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk

因此，本發(fā)明涵蓋如本文描述的遺傳修飾的msc，所述遺傳修飾的msc包括選自由以下組成的組的核酸分子：

a)包括編碼aat蛋白的核苷酸序列的核酸分子，所述aat蛋白如根據(jù)seqidno3的aat蛋白，優(yōu)選由根據(jù)seqidno1或2的核苷酸序列編碼；

b)與根據(jù)a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子；

c)包括具有充分的序列一致性的核苷酸序列的核酸分子，所述具有充分的序列一致性的核苷酸序列功能上相似/等價(jià)于根據(jù)a)或b)的核苷酸序列，優(yōu)選與根據(jù)a)或b)的核苷酸序列具有至少70％、80％、優(yōu)選90％、更優(yōu)選95％的序列一致性；

d)作為遺傳密碼的結(jié)果，被簡(jiǎn)化(degenerated)為根據(jù)a)至c)的核苷酸序列的核酸分子；以及

e)根據(jù)a)至d)的通過缺失、添加、置換、易位、倒置和/或插入來修飾的核苷酸序列，并且功能上相似/等價(jià)于根據(jù)a)至d)的核苷酸序列的核酸分子。

因此，本發(fā)明涵蓋本文描述的遺傳修飾的msc，所述遺傳修飾的msc包含編碼根據(jù)seqidno3的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋seqidno3的序列變體，尤其是與seqidno3具有至少70％的序列一致性的序列變體，優(yōu)選與seqidno3具有至少80％、85％、90％，或至少95％序列一致性的序列變體。這樣的序列變體優(yōu)選在功能上類似于或等價(jià)于本文公開的人類aa。在維持seqidno3的人aat的功能等價(jià)的情況下，本發(fā)明還涵蓋了蛋白長(zhǎng)度的變化。例如高達(dá)50個(gè)氨基酸，40、30、20或10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度的截短或伸長(zhǎng)可以維持aat活性，因此被涵蓋于本發(fā)明中。

功能類似的序列是指編碼功能性aat基因產(chǎn)物，并且使能夠?qū)崿F(xiàn)與人aat相同或相似的功能效應(yīng)的能力。aat功能可以通過其體外抑制多種蛋白酶(如胰蛋白酶)的能力或通過其抑制嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的能力來確定(如下所述)。用于確定蛋白酶活性或用于確定嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性的適當(dāng)測(cè)定是技術(shù)人員已知的。

可以通過氨基酸序列中的置換來發(fā)生的aat蛋白的蛋白修飾物和編碼這些分子的核酸序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所定義的置換是對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行的修飾，由此一個(gè)或多個(gè)氨基酸被相同數(shù)量的(不同)氨基酸替代，產(chǎn)生含有與原始蛋白不同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，這種修改不會(huì)顯著地改變蛋白的功能。如添加一樣，置換可以是天然或人工的。本領(lǐng)域熟知，可以進(jìn)行氨基酸置換而不顯著改變蛋白質(zhì)的功能。當(dāng)修飾涉及“保守”氨基酸置換時(shí)，這是尤其正確的，所述“保守”氨基酸置換是將一種氨基酸置換為另一種具有相似性質(zhì)的氨基酸的置換。這樣的“保守”氨基酸可以是天然的或合成的氨基酸，因?yàn)樗觥氨Ｊ亍卑被岬拇笮?、電荷、極性和構(gòu)象，所述“保守”氨基酸可被置換而不會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。通常，許多氨基酸可以被保守的氨基酸置換，而不會(huì)有害地影響蛋白質(zhì)的功能。通常，非極性氨基酸gly、ala、val、ile和leu；非極性芳香族氨基酸phe、trp和tyr；中性極性氨基酸ser、thr、cys、gln、asn和met；帶正電荷的氨基酸lys、arg和his；帶負(fù)電荷的氨基酸asp和glu，代表了保守氨基酸的組。該清單不是詳盡的。例如，熟知的是，ala、gly、ser以及有時(shí)候cys可以互相置換，即使它們屬于不同的組。

用于遺傳修飾msc的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。wo2010/119039和wo2008/150368中公開了遺傳修飾msc的適合方法的實(shí)例。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的細(xì)胞的特征在于，所述細(xì)胞獲得自骨髓、臍帶、脂肪組織或羊水。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的細(xì)胞的特征在于，所述細(xì)胞是cd34陰性的。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的細(xì)胞的特征在于，所述細(xì)胞是人細(xì)胞。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，外源核酸包含病毒載體，例如病毒表達(dá)構(gòu)建體形式的病毒載體，更優(yōu)選為反轉(zhuǎn)錄病毒載體，特別是γ反轉(zhuǎn)錄病毒載體。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，外源核酸是或包括非病毒表達(dá)構(gòu)建體。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，所述細(xì)胞進(jìn)一步包括(iii)選擇性標(biāo)記基因，所述選擇性標(biāo)記基因可操作地連接于組成型啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合是組成型啟動(dòng)子。

在另一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合是cmv或ef2啟動(dòng)子。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，組成型啟動(dòng)子是efs啟動(dòng)子。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，組成型啟動(dòng)子是pgk啟動(dòng)子。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，組成型啟動(dòng)子是ef1α啟動(dòng)子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合是誘導(dǎo)型或條件型啟動(dòng)子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，在所述細(xì)胞在施用后分化時(shí)啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的。在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是tie2啟動(dòng)子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是炎癥特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選地，其中所述啟動(dòng)子由炎性介質(zhì)或炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)和/或當(dāng)遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞接近于發(fā)炎組織時(shí)誘導(dǎo)。

啟動(dòng)子的誘導(dǎo)型形式被設(shè)計(jì)為顯示aat蛋白的炎癥特異性表達(dá)和/或局部表達(dá)。結(jié)合msc的歸巢和/或遷移特性，實(shí)現(xiàn)了協(xié)同作用，使得非常少的aat蛋白質(zhì)在受試者體內(nèi)的與患病組織或器官不同的區(qū)域中表達(dá)或產(chǎn)生。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是rantes啟動(dòng)子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是hsp70啟動(dòng)子。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)，令人驚訝的是，本文提及的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)導(dǎo)致在適當(dāng)刺激炎癥部位時(shí)治療性蛋白aat充分表達(dá)。本文提供的啟動(dòng)子顯示了合適的誘導(dǎo)性質(zhì)，以便在其與發(fā)炎組織接近時(shí)快速?gòu)?qiáng)烈地表達(dá)aat。此外，當(dāng)aat的表達(dá)受所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制時(shí)，aat對(duì)組織的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用尤其明顯。這導(dǎo)致了協(xié)同作用，由此，當(dāng)施用在tie2和/或rantes控制下表達(dá)aat的遺傳修飾的msc時(shí)，對(duì)具有與不想要的炎癥和/或免疫應(yīng)答有關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的患者的治療是尤其有效的。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及aat修飾的細(xì)胞本身，而不限于特定的醫(yī)學(xué)用途。在這方面，本文描述的aat修飾的細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)特征，比如下文和實(shí)施例中所述的轉(zhuǎn)基因序列、啟動(dòng)子、另外的載體組件，以及其組合，表現(xiàn)了對(duì)以前未描述的現(xiàn)有技術(shù)的貢獻(xiàn)。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，通過將治療有效數(shù)目的細(xì)胞引入患者的血流來施用所述細(xì)胞。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及治療肺部疾病的如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，肺部疾病是肺部炎性疾病。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，肺部疾病是呼吸道疾病(respiratorydisease)。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，肺部疾病是急性肺損傷、慢性阻塞性肺疾病(包括慢性支氣管炎、肺氣腫、支氣管擴(kuò)張和細(xì)支氣管炎)、急性呼吸窘迫綜合征、哮喘、結(jié)節(jié)病、過敏性肺炎和/或肺纖維化。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，通過將治療有效數(shù)目的細(xì)胞通過吸入引入患者的肺部，任選地結(jié)合將所述細(xì)胞引入患者的血流來施用所述細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的肺部疾病可以涉及但不限于以下的一種或多種：急性支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合征(ards)、石棉沉滯癥、哮喘、支氣管擴(kuò)張、細(xì)支氣管炎、閉塞性細(xì)支氣管炎伴機(jī)化性肺炎(boop)、支氣管肺發(fā)育不良、棉屑沉著病、慢性支氣管炎、球孢子菌病(cocci)、copd、隱源性機(jī)化性肺炎(cop)、囊性纖維化、肺氣腫、漢坦病毒肺綜合征、組織胞漿菌病、人偏肺病毒、過敏性肺炎、流感、淋巴管瘤病、間皮瘤、中東呼吸綜合征、非結(jié)核分枝桿菌病、百日咳、塵肺病(黑肺病)、肺炎、原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)障礙、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、肺動(dòng)脈高血壓、肺纖維化、肺血管疾病、呼吸道合胞病毒、結(jié)節(jié)病、重度急性呼吸綜合征、矽肺、睡眠呼吸暫停、嬰兒猝死綜合征或結(jié)核病。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，肺部疾病選自炎性肺部疾病或限制性肺部疾病、呼吸道感染和/或肺血管疾病或病癥。

炎性肺部疾病通常以高嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)為特征，例如哮喘、囊性纖維化、肺氣腫、慢性阻塞性肺病或急性呼吸窘迫綜合征。限制性肺部疾病是一類以肺順應(yīng)性喪失為特征的呼吸疾病，其導(dǎo)致肺擴(kuò)張不全和肺僵硬性增加，如具有呼吸窘迫綜合征的嬰兒。

呼吸道感染可影響呼吸系統(tǒng)的任何部分。習(xí)慣上，它們分為上呼吸道感染和下呼吸道感染。最常見的上呼吸道感染是普通感冒。然而，上呼吸道的特定器官感染如鼻竇炎、扁桃體炎、中耳炎、咽炎和喉炎也被認(rèn)為是上呼吸道感染。最常見的下呼吸道感染是肺炎，在西方國(guó)家，肺炎通常是由細(xì)菌，尤其是肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)引起的肺部感染。在世界范圍內(nèi)，結(jié)核病是肺炎的重要原因。其他病原體如病毒和真菌可引起肺炎，例如重度急性呼吸綜合征和肺孢子蟲肺炎。肺炎可能會(huì)發(fā)生并發(fā)癥如肺膿腫(其是感染引起的肺部圓形腔)，或可能擴(kuò)散到胸膜腔。

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及使用如本文描述的遺傳修飾的aat修飾的msc治療血管疾病。肺血管疾病是影響肺循環(huán)的病癥。實(shí)例是肺栓塞，其是在靜脈中形成、脫離、經(jīng)過心臟并停留在肺中的血塊(血栓栓塞)。大的肺栓塞是致命的，其導(dǎo)致猝死。許多其他物質(zhì)也可以(通過血液流動(dòng))引起肺部栓塞，但是它們是罕見的，例如脂肪栓塞(尤其在骨損傷后)、羊水栓塞(伴有分娩并發(fā)癥)或空氣栓塞(醫(yī)源性-由侵入性醫(yī)療過程引起)。根據(jù)本發(fā)明，還可以治療以下肺部疾?。悍蝿?dòng)脈高壓，即肺動(dòng)脈血壓升高；肺水腫，流體從肺毛細(xì)血管滲漏進(jìn)肺泡(或氣室)；導(dǎo)致血液滲漏進(jìn)肺泡的肺出血、炎癥和肺部毛細(xì)血管損傷。

本文所述的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞也可以用作治療具有或不具有α1-抗胰蛋白酶缺乏癥的患者的、與α1-抗胰蛋白酶缺乏癥(α1-抗胰蛋白酶缺乏癥，a1ad)相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的藥物。

與α1-抗胰蛋白酶缺乏癥相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的實(shí)例是肝硬化、copd、氣胸、哮喘、韋格納肉芽腫病、胰腺炎、膽結(jié)石、支氣管擴(kuò)張、盆腔器官脫垂、原發(fā)性硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、肺氣腫，主要涉及下肺葉并引起大泡的α1-抗胰蛋白酶缺乏癥和繼發(fā)性膜增生性腎小球腎炎。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本文描述的用作治療炎性疾病的藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，炎性疾病是血管炎、腎炎、炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和/或移植物抗宿主病。

在一種實(shí)施方式中，本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，要治療的炎性疾病是痛風(fēng)。痛風(fēng)是一種醫(yī)學(xué)病癥，其特征通常是在特定位置的導(dǎo)致腫脹和關(guān)節(jié)疼痛的復(fù)發(fā)性急性炎癥性關(guān)節(jié)炎。大腳趾底部的跖趾關(guān)節(jié)是通常受影響的區(qū)域。痛風(fēng)通常被公認(rèn)是由血液中尿酸水平升高所引起，導(dǎo)致尿酸結(jié)晶，晶體沉積在患者體內(nèi)的關(guān)節(jié)、肌腱和周圍組織中。在一些情況下，痛風(fēng)可能表現(xiàn)為痛風(fēng)石、腎結(jié)石或尿酸性腎病。

驚人地，本發(fā)明的aat修飾的msc能夠成為治療痛風(fēng)的有效治療選項(xiàng)，其導(dǎo)致受影響區(qū)域的腫脹和疼痛減少。通過炎癥減少和關(guān)節(jié)液中的尿酸晶體的減少可以觀察成功的治療。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本文描述的用作治療慢性纖維化的藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，炎性纖維化疾病和/或慢性纖維化疾病是受試者的腎臟，肝臟和/或結(jié)腸的纖維化疾病。

纖維化通常被認(rèn)為是過量纖維結(jié)締組織在器官或組織中的形成。纖維化可以是反應(yīng)狀態(tài)、良性狀態(tài)或病理狀態(tài)。結(jié)締組織的不想要的沉積可以去除作為基礎(chǔ)的器官或組織的結(jié)構(gòu)和功能，從而導(dǎo)致病理狀態(tài)。纖維化可以在體內(nèi)的許多組織中發(fā)生，這通常是由于與不想要的炎癥和/或免疫應(yīng)答潛在相關(guān)的炎癥或損傷。纖維化的實(shí)例包括肺的纖維化(肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、囊性纖維化)、肝纖維化(肝硬化)、心臟纖維化(心內(nèi)膜纖維化、老年心肌梗塞、心房纖維化)或其他原因的纖維化(縱隔(縱隔軟組織)纖維化)、骨髓纖維化(骨髓)、腹膜后纖維化(腹膜后的軟組織)、進(jìn)行性大塊纖維化(肺)；煤礦工人塵肺病并發(fā)癥、腎源性全身纖維化(mephrogenicsystemicfibrosis)(皮膚)、克羅恩病(腸)、瘢痕疙瘩(皮膚)、硬皮病/系統(tǒng)性硬化癥(皮膚、肺部)、關(guān)節(jié)纖維化(膝蓋、肩部、其他關(guān)節(jié))、杜普伊特倫攣縮(dupuytren'scontracture)(手、手指)或粘連性關(guān)節(jié)囊炎(肩部))。

令人驚訝的是，aat在纖維化區(qū)域的局部表達(dá)可能導(dǎo)致增強(qiáng)的治療效果。msc可以顯示朝向纖維化組織的意料不到的遷移特性，并且通過aat的表達(dá)導(dǎo)致纖維組織形成的減少。在該方法中，aat-msc特別用作抗炎治療劑和/或免疫調(diào)節(jié)治療劑。

使用本文描述的aat修飾的msc治療1型糖尿病代表了本發(fā)明的進(jìn)一步的方面。因此，本發(fā)明還涵蓋i型糖尿病并發(fā)癥的治療。與1型糖尿病相關(guān)的潛在并發(fā)癥包括心血管疾病，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化的加速進(jìn)展以及心臟病發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)升高和/或中風(fēng)、腎病、神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜病變。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，受試者是人。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，所述遺傳修飾的細(xì)胞相對(duì)于受試者是同種異體的。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的用作藥物的遺傳修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，所述遺傳修飾的細(xì)胞是相對(duì)于受試者自體的。

本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及本文描述的用于治療炎性疾病或自身免疫性疾病如本文所述的那些疾病的aat修飾的msc，其中癌癥被排除治療的疾病的組之外。

在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，通常提供遺傳修飾或未修飾的msc用作治療肺部疾病的藥物。相對(duì)于aat修飾的msc，本文提及的細(xì)胞的特征也適用于本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式。根據(jù)該實(shí)施方式，msc不包含aat編碼核酸。遺傳修飾可能不存在，或者msc可以包含編碼治療性蛋白質(zhì)(如aat)的外源核酸。因此，本發(fā)明涉及使用msc治療肺部疾病，而依賴于發(fā)生了msc的修飾還是發(fā)生了特定的遺傳修飾。如本文描述的，msc的抗炎特性導(dǎo)致在治療肺部疾病方面令人驚訝的良好功效。相對(duì)于用aat修飾的msc治療，本文提及的要治療的潛在肺部疾病也適用于本發(fā)明的該具體實(shí)施方式。

在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，如本文描述的msc可以包含編碼蛋白質(zhì)cxcr4的外源核酸與適合于表達(dá)所述蛋白質(zhì)的進(jìn)一步的核酸序列的組合。cxcr4是參與到msc移動(dòng)的細(xì)胞表面趨化因子受體，并且在小部分的msc的表面上表達(dá)。已經(jīng)提出cxcr4的表達(dá)在msc朝組織損傷歸巢的效率中起作用。最近的結(jié)果表明，cxcr4在msc中的表達(dá)增強(qiáng)了體外細(xì)胞的趨化性和旁分泌特征，并且改善了體內(nèi)受損肺組織的msc歸巢和定植。cxcr4編碼序列可以存在于編碼aat的相同外源核酸分子中，或存在于單獨(dú)的外源核酸中。多個(gè)整合的核酸構(gòu)建體或核酸盒可以存在于本發(fā)明的msc中，每個(gè)所述核酸構(gòu)建體或表達(dá)盒攜帶一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因，例如治療基因(如aat或參與細(xì)胞移動(dòng)的其它基因(如cxcr4))。

具體實(shí)施方式

所有引用的專利文獻(xiàn)和非專利文獻(xiàn)的文件通過引用全文并入本文。

本文公開的“間充質(zhì)細(xì)胞”(在一些實(shí)施方式中也稱為“間充質(zhì)干細(xì)胞”或“msc”)可以產(chǎn)生結(jié)締組織、骨、軟骨和循環(huán)系統(tǒng)與淋巴系統(tǒng)中的細(xì)胞。在間充質(zhì)中發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞，所述間充質(zhì)是由寬松包裹的梭形或星形非特化細(xì)胞組成的胚胎中胚層的一部分。如本文使用的，間充質(zhì)干細(xì)胞包括但不限于cd34陰性干細(xì)胞。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，間充質(zhì)細(xì)胞是成纖維細(xì)胞樣的塑料貼附性細(xì)胞(plastic-adherentcells)，在某些實(shí)施方式中定義為多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，并且還包括cd34陰性細(xì)胞。

為了避免任何疑問，術(shù)語(yǔ)間充質(zhì)細(xì)胞涵蓋多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，該多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞也包括間充質(zhì)細(xì)胞、msc和它們的前體的亞群，所述亞群由能夠在體內(nèi)分化為多種細(xì)胞類型的多能(multipotent)或多能(pluripotent)自我更新細(xì)胞組成。

如本文使用的，cd34陰性細(xì)胞應(yīng)該是指在其表面缺少cd34的細(xì)胞或僅表達(dá)可以忽略水平的cd34的細(xì)胞。cd34陰性細(xì)胞和分離這樣的細(xì)胞的方法，例如描述于langec.等人,“在無動(dòng)物血清的培養(yǎng)基中快速和安全地?cái)U(kuò)增人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞用于移植和再生醫(yī)學(xué)(acceleratedandsafeexpansionofhumanmesenchymalstromalcellsinanimalserum-freemediumfortransplantationandregenerativemedicine)”.j.cellphysiol.2007,apr.25中。

可以通過許多指標(biāo)將間充質(zhì)細(xì)胞與造血干細(xì)胞(hsc)區(qū)別開。例如已知hsc在培養(yǎng)物中漂浮并且不黏著于塑料表面。相反，間充質(zhì)細(xì)胞黏著于塑料表面。本發(fā)明的cd34陰性的間充質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)物中是粘附的。

本文描述的基因修飾的細(xì)胞可以根據(jù)其以固體、液體還是噴霧形式施用，以及對(duì)于這樣的施用途徑其作為注射劑是否需要無菌，包括不同類型的載體。本發(fā)明可以經(jīng)靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、病變內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)腔內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸腔內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、總體地(topically)、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、小泡內(nèi)(intravesicularlly)、粘膜、心包內(nèi)、臍帶內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)口、總體地(topically)、局部地(locally)，吸入(例如霧化吸入)、注射、輸注、持續(xù)輸注、局部灌注直接洗滌靶細(xì)胞，經(jīng)由導(dǎo)管、經(jīng)由灌洗，以膏狀、以脂質(zhì)組合物(例如脂質(zhì)體)，或通過如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法或上述的任意組合施用(見例如，雷明頓的藥物科學(xué)(remington'spharmaceuticalsciences),18thed.mackprintingcompany,1990，通過引用在此并入)。

本發(fā)明涵蓋了通過將治療有效數(shù)目的細(xì)胞引入受試者的血流來治療患者。如本文使用，將細(xì)胞“引入受試者的血流”應(yīng)包括但不限于將這樣的細(xì)胞通過注射引入受試者的靜脈或動(dòng)脈之一。這樣的施用也可以進(jìn)行例如一次、多次和/或在一個(gè)或多個(gè)延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)。單次注射是優(yōu)選的，但是在某些情況下經(jīng)過一段時(shí)間(例如每季度、每半年或每年一次)重復(fù)注射是必要的。這樣的施用也優(yōu)選使用cd34-陰性細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體的混合物進(jìn)行。藥學(xué)上可接受的載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，其包括但不限于0.01-0.1m和優(yōu)選0.05m磷酸鹽緩沖液或0.8％鹽水，以及通常使用的專用深低溫保存培養(yǎng)基。

可以在局部進(jìn)行施用，例如通過注射到受試者身體的接近于炎癥部位的區(qū)域中。已經(jīng)顯示msc向炎癥遷移。間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)表現(xiàn)出對(duì)組織損傷部位以及腫瘤微環(huán)境的趨向性。由傷口分泌的許多相同的炎性介質(zhì)發(fā)現(xiàn)于腫瘤微環(huán)境中，并且所述炎性介質(zhì)被認(rèn)為參與吸引msc到這些部位。細(xì)胞遷移取決于由受損細(xì)胞和/或應(yīng)答的免疫細(xì)胞分泌的范圍從生長(zhǎng)因子到趨化因子的大量信號(hào)。msc很可能具有與對(duì)損傷和炎癥部位作出響應(yīng)的其他免疫細(xì)胞相似的趨化性質(zhì)。無論如何，局部施用本文描述的細(xì)胞會(huì)在其作用部位導(dǎo)致高水平的細(xì)胞。

此外，這樣的藥學(xué)上可接受的載體可以是水溶液或非水溶液、懸浮液和乳液，最優(yōu)選是水溶液。含水載體包括水、酒精/水溶液、乳液和懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。非胃腸載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液和固定油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑如林格氏葡萄糖、基于林格氏葡萄糖的載體等。通常可以在例如雷明頓：藥學(xué)的科學(xué)與實(shí)踐(remington:thescienceandpracticeofpharmacy),20thed.,p.808,lippincottwilliamss-wilkins(2000)中找到通常用于靜脈內(nèi)施用的流體。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。

如本文使用的，“治療有效數(shù)目的細(xì)胞”包括但不限于以下的量和量的范圍：(i)約1×10²至約1×10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重；(ii)約1×10³至約1×10⁷個(gè)細(xì)胞/kg體重；(iii)約1×10⁴至約1×10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重；(iv)約1×10⁴至約1×10⁵個(gè)細(xì)胞/kg體重；(v)約1×10⁵至約1×10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重；(vi)約5×10⁴至約0.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/kg體重；(vii)約1×10³個(gè)細(xì)胞/kg體重；(viii)約1×10⁴個(gè)細(xì)胞/kg體重；(ix)約5×10⁴個(gè)細(xì)胞/kg體重；(x)約1×10⁵個(gè)細(xì)胞/kg體重；(xi)約5×10⁵個(gè)細(xì)胞/kg體重；(xii)約1×10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重；以及(xiii)約1×10⁷個(gè)細(xì)胞/kg體重。人體重預(yù)期包括但不限于約5kg、10kg、15kg、30kg、50kg、約60kg；約70kg；約80kg、約90kg；約100kg、約120kg和約150kg。這些數(shù)目基于臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試驗(yàn)以及來自cd34+造血干細(xì)胞移植的標(biāo)準(zhǔn)方案。單核細(xì)胞(包括cd34+細(xì)胞)通常含有1:23000至1:300000的cd34陰性細(xì)胞。

如本文使用的，“治療”患有疾病(如炎癥)的受試者應(yīng)該是指減慢、停止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，治療患有疾病的受試者是指理想地使疾病進(jìn)展逆轉(zhuǎn)至消除疾病本身的點(diǎn)。如本文使用的，改善疾病和治療疾病是等價(jià)的。本發(fā)明的治療也可以或供選擇地涉及所述細(xì)胞的預(yù)防性施用。這樣的預(yù)防性施用可以涉及防止任何給定的醫(yī)學(xué)病癥(如防止炎癥)，或防止所述疾病的發(fā)展，由此防止或預(yù)防在所有條件下狹義地不被解釋為絕對(duì)的防止。防止或預(yù)防可能還涉及減少受試者發(fā)展出任何給定的醫(yī)學(xué)病癥的風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選對(duì)于處于所述病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。

通常，以本領(lǐng)域公認(rèn)的意義使用的術(shù)語(yǔ)“炎癥”涉及由組織損傷、感染或破壞引起的局部或全身性保護(hù)反應(yīng)，其用于保護(hù)受試者免遭有害物質(zhì)和損傷的組織之害。炎癥優(yōu)選以微脈管穿孔、血液元素滲透入胞間隙、白細(xì)胞遷移至發(fā)炎組織為特征，這導(dǎo)致順序不受控的疼痛、發(fā)熱、發(fā)紅、腫脹以及功能喪失。

炎癥可分為急性或慢性的。急性炎癥是身體對(duì)有害刺激的初始響應(yīng)，并且是通過血漿和白細(xì)胞(特別是粒細(xì)胞)從血液向受損組織的移動(dòng)的增加而實(shí)現(xiàn)的。一系列生物化學(xué)事件使炎性響應(yīng)傳播和成熟，這涉及損傷組織內(nèi)的局部血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和各種細(xì)胞。被稱為慢性炎癥的長(zhǎng)期炎癥導(dǎo)致炎癥部位存在的細(xì)胞類型的進(jìn)行性變化，其特征在于在炎癥過程中同時(shí)破壞和愈合組織。

術(shù)語(yǔ)“不想要的炎癥”優(yōu)選地是指受試者的炎癥超過生理有益的炎癥反應(yīng)的水平，并導(dǎo)致炎癥部位的細(xì)胞，組織和/或器官的損傷。

術(shù)語(yǔ)“不想要的免疫應(yīng)答”優(yōu)選地是指受試者的免疫系統(tǒng)的反應(yīng)性的改變，所述改變對(duì)其健康具有有害作用，并且可能涉及細(xì)胞因子的刺激和/或產(chǎn)生以及免疫細(xì)胞的募集。在例如自身免疫性疾病、移植排斥、過敏或炎性疾病中發(fā)生不想要的免疫應(yīng)答。

因此，由不想要的炎癥和/或免疫應(yīng)答限定的醫(yī)學(xué)病癥是指許多疾病和/或病癥，具體地包括但不限于血管炎、腎炎、炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性纖維化、肺部炎性疾病或自身免疫性疾病。

肺部炎性疾病的實(shí)例包括但不限于肺損傷，慢性阻塞性肺病(copd)(包括慢性支氣管炎、肺氣腫、支氣管擴(kuò)張和細(xì)支氣管炎)、急性呼吸窘迫綜合征、哮喘、結(jié)節(jié)病、過敏性肺炎和/或肺纖維化。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本文描述的msc以例如局部的方式朝受疾病狀況影響的生理位置(如炎癥區(qū)域)遷移，以便提供所述msc的治療作用。

本發(fā)明還涉及治療自身免疫性疾病，尤其是具有炎性成分的自身免疫性疾病。這些疾病還可以指風(fēng)濕性疾病。這樣的疾病優(yōu)選選自高安氏動(dòng)脈炎、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、家族性地中海熱、川崎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、皮膚結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(cutanouspolyarteritisnodosa)、肝炎相關(guān)性動(dòng)脈炎、貝切特綜合征(behcet'ssyndrome)、韋格納肉芽腫病、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(churg-strausssyndrome)、顯微鏡下多血管炎、結(jié)締組織病血管炎、亨-斯二氏紫癜(hennoch-schonleinpurpura)、冷凝球蛋白性血管炎、皮膚白細(xì)胞分裂性血管炎、熱帶主動(dòng)脈炎、結(jié)節(jié)病、柯根氏綜合征、威-奧二氏綜合征(wiskott-aldrichsyndrome)、麻風(fēng)結(jié)節(jié)性動(dòng)脈炎、cns原發(fā)性脈管炎、血栓閉塞性脈管炎、癌旁動(dòng)脈炎、蕁麻疹、德格氏病(dego'sdisease)、骨髓增生異常綜合征、持久性隆起紅斑、高免疫球蛋白d、過敏性鼻炎、支氣管性哮喘、慢性阻塞性肺疾病、牙周炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、淀粉樣變性、克隆氏病(morbuschron)、潰瘍性結(jié)腸炎、自身免疫性肌炎、糖尿病、多發(fā)性硬化癥、格林-巴利綜合征、組織細(xì)胞增多癥、骨關(guān)節(jié)炎、特異反應(yīng)性皮炎、牙周炎、慢性鼻竇炎、銀屑病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、顯微鏡下結(jié)腸炎、肺纖維化、腎小球性腎炎、惠普爾氏病(whipple'sdisease)、斯提爾氏病(still'sdisease)、結(jié)節(jié)性紅斑、耳炎、冷球蛋白血癥、干燥綜合征(sjogren'ssyndrome)、紅斑狼瘡、再生障礙性貧血、骨髓纖維瘤、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、木村氏病(kimura'sdisease)、系統(tǒng)性硬化癥、慢性主動(dòng)脈周圍炎、慢性前列腺炎、特發(fā)性肺纖維化、慢性肉芽腫病、特發(fā)性失弛緩癥、博來霉素誘導(dǎo)的肺部炎癥、阿糖胞苷誘導(dǎo)的肺部炎癥、自身免疫性血小板減少癥、自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少癥、自身免疫溶血性貧血、自身免疫性淋巴細(xì)胞減少癥、恰加斯氏病(chagas'disease)、慢性自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性肝炎、橋本氏甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎、格雷夫斯氏病、自身免疫性多腺體綜合征、自身免疫性阿狄森綜合癥、尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、皰疹樣皮炎、自身免疫性脫發(fā)、白癜風(fēng)、抗磷脂綜合征、重癥肌無力、僵硬人綜合征、古德帕斯徹氏綜合征、交感性眼炎、毛囊炎、夏普綜合征和/或伊文思綜合征。

如本文使用的，“細(xì)胞遷移”意圖是指細(xì)胞朝向特定的化學(xué)或物理信號(hào)的移動(dòng)。細(xì)胞通常響應(yīng)于特定的外部信號(hào)而遷移，包括化學(xué)信號(hào)和機(jī)械信號(hào)。趨化性是關(guān)于應(yīng)答于化學(xué)刺激的細(xì)胞遷移的一個(gè)例子。體外趨化性測(cè)定如博伊登室測(cè)定(boydenchamberassays)可以用于確定在任何給定的細(xì)胞中是否有細(xì)胞遷移。例如，可以純化和分析感興趣的細(xì)胞。使用板可以進(jìn)行趨化性測(cè)定(例如根據(jù)falk等人,1980j.immuno.methods33:239-247)，在所述板中將特定的化學(xué)信號(hào)關(guān)于感興趣的細(xì)胞和遷移的細(xì)胞放置，然后收集并且分析。例如，博伊登室測(cè)定需要使用通過過濾器分離的室，用作準(zhǔn)確確定趨化行為的工具。這些室的先鋒類型由boyden構(gòu)建(boyden(1962)"多形核白細(xì)胞上的抗原和抗體的混合物的趨化作用(thechemotacticeffectofmixturesofantibodyandantigenonpolymorphonuclearleucocytes)".jexpmed115(3):453)。將游動(dòng)細(xì)胞置于上室，同時(shí)將含有測(cè)試物質(zhì)的流體過填充至下室。要研究的游動(dòng)細(xì)胞的尺寸決定過濾器的孔徑；選擇允許活性遷移的直徑是必要的。對(duì)于在體內(nèi)條件下建模，幾種方案優(yōu)選用胞外基質(zhì)分子(膠原蛋白、彈性蛋白等)覆蓋過濾器。通過發(fā)展多孔室(例如neuroprobe)，增加測(cè)量的有效性，其中可平行評(píng)價(jià)24、96、384個(gè)樣本。該變體的優(yōu)勢(shì)是在相同的條件下測(cè)定數(shù)個(gè)平行樣本。

供選擇地，可以在細(xì)胞移植后從受試者(例如嚙齒動(dòng)物模型)獲得組織樣品，并且測(cè)定所述組織樣品的特定組織類型中感興趣的細(xì)胞的存在。這樣的測(cè)定可能具有分子性質(zhì)，即基于核酸序列識(shí)別細(xì)胞，或具有組織學(xué)性質(zhì)，即基于熒光標(biāo)記在抗體標(biāo)記后評(píng)估細(xì)胞。這種測(cè)定法對(duì)于評(píng)估移植細(xì)胞的移植也是尤其有用的。對(duì)移植物的測(cè)定還可以提供關(guān)于細(xì)胞遷移的信息，因?yàn)樵谀撤N程度上，移植取決于移植前的細(xì)胞定位。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，如本文描述的msc移植于受疾病狀況影響的生理位置(如炎癥區(qū)域)中，以便以例如局部方式賦予所述msc治療作用。

如本文使用的“移入”涉及將移植的(grafted)或移植的(transplanted)組織或細(xì)胞并入宿主體內(nèi)的過程。移入也涉及將移植的細(xì)胞整合至宿主組織以及它們的存活和在某些條件下分化為非干細(xì)胞狀態(tài)。

用于評(píng)價(jià)msc的移入和由此評(píng)價(jià)msc在一定程度上的遷移和生物分布的技術(shù)可以涵蓋體內(nèi)或體外方法。體內(nèi)方法的例子包括生物發(fā)光，由此轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以表達(dá)熒光素酶，然后可以通過它們的熒光素代謝對(duì)細(xì)胞成像，導(dǎo)致光發(fā)射；熒光，由此使細(xì)胞負(fù)載熒光染料或轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)然后可以成像的熒光報(bào)告分子；放射性核素標(biāo)記，其中使細(xì)胞負(fù)載放射性核素并用閃爍照相法(scintigraphy)、正電子放射斷層造影術(shù)(pet)或單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層造影術(shù)(spect)以及磁共振成像(mri)定位，其中用mri掃描儀追蹤負(fù)載有順磁性化合物(例如氧化鐵納米顆粒)的細(xì)胞。評(píng)價(jià)生物分布的體外方法包括定量pcr、流式細(xì)胞術(shù)和組織學(xué)方法。組織學(xué)方法包括追蹤熒光標(biāo)記的細(xì)胞；對(duì)例如y染色體和人特異性alu序列原位雜交；和對(duì)物種特異性的或基因引入的蛋白(如細(xì)菌β-半乳糖苷酶)的組織化學(xué)染色。這些免疫組織化學(xué)方法用于辨別移入位置，但是有必要切除組織。對(duì)于進(jìn)一步回顧這些方法和它們的應(yīng)用，見kean等人,msc：遞送的路徑和移入，細(xì)胞靶向策略以及免疫調(diào)節(jié)(mscs:deliveryroutesandengraftment,cell-targetingstrategies,andimmunemodulation),stemcellsinternational,volume2013(2013)。

因此，祖細(xì)胞或多能細(xì)胞，如本發(fā)明的間充質(zhì)細(xì)胞，可以被描述為蛋白質(zhì)遞送載體，基本上能夠使治療性基因產(chǎn)物在受試者體內(nèi)的特定組織或區(qū)域內(nèi)定位和表達(dá)。這樣的治療性細(xì)胞提供了為其他治療難治的疾病提供細(xì)胞治療的能力。對(duì)于每種類型的治療性細(xì)胞，最終目標(biāo)是相同的：細(xì)胞應(yīng)該表達(dá)特異性的全部基因，優(yōu)選編碼治療性基因產(chǎn)物的外源核酸，由此修改細(xì)胞一致性以表達(dá)所述基因產(chǎn)物，以及提供治療性作用，如抗炎作用。當(dāng)本發(fā)明的細(xì)胞在體外擴(kuò)增時(shí)，其表現(xiàn)出包括多代間充質(zhì)(基質(zhì))細(xì)胞后代的異源群體，該異源群體缺少多數(shù)分化標(biāo)記物如cd34的表達(dá)。這些群體可能保留了沿著間充質(zhì)譜系和非間充質(zhì)譜系的終末分化和成熟的有限的增殖潛力和應(yīng)答性。

如本文使用的“誘導(dǎo)型表達(dá)”或“條件型表達(dá)”涉及基因表達(dá)的狀態(tài)、多重狀態(tài)或系統(tǒng)，其中感興趣的基因如治療性轉(zhuǎn)基因優(yōu)選是不表達(dá)的，或在某些實(shí)施方式中，以可忽略的或相對(duì)低的水平表達(dá)，除非細(xì)胞中存在允許基因表達(dá)的一種或多種分子(誘導(dǎo)劑)或其他一組條件。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以涉及在特定的生物條件下以相對(duì)高水平表達(dá)的天然存在的啟動(dòng)子，或涉及包括任何給定的誘導(dǎo)型元件的其他合成啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以是指通過特定組織或微環(huán)境或存在于特定組織或微環(huán)境中的生物信號(hào)的組合所誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，或指由外部因素，例如通過施用小的藥物分子或其他外部施加的信號(hào)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

如本文使用的，“接近”組織包括例如在組織的5mm、1mm之內(nèi)，在組織的0.5mm之內(nèi)和在組織的0.25mm之內(nèi)。

考慮到干細(xì)胞可以顯示在正常以及病態(tài)環(huán)境下向不同組織微環(huán)境的選擇性遷移，本發(fā)明涵蓋了與在募集的干細(xì)胞中啟動(dòng)的分化途徑聯(lián)系的組織特異性啟動(dòng)子的使用，并且所述組織特異性啟動(dòng)子理論上可以用于在限定的生物環(huán)境下僅驅(qū)動(dòng)選擇性表達(dá)治療性基因。募集至其他組織部位但是沒有經(jīng)歷分化的相同程序的干細(xì)胞不應(yīng)表達(dá)治療性基因。該方法使得顯著程度地潛在控制治療性基因在限定的微環(huán)境內(nèi)的選擇性表達(dá)，以及該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于在新血管生成期間調(diào)節(jié)治療性基因表達(dá)。wo2008/150368和wo2010/119039中公開了這樣的基因修飾的可能方法，據(jù)此將其全文并入。

如本文所使用的，“核酸”應(yīng)該指任何核酸分子，包括但不限于dna、rna和其雜交體或修飾的變體?！巴庠春怂帷被颉巴庠椿蛟鄙婕耙爰?xì)胞的任何核酸，其不是細(xì)胞“原始”或“天然”基因組的組件。外源核酸可以是整合或不整合的，或涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸。

本發(fā)明涵蓋了任何給定的基因遞送方法，并且所述基因遞送方法優(yōu)選涉及病毒或非病毒載體，以及轉(zhuǎn)染的生物或化學(xué)方法。該方法可以在使用的系統(tǒng)中產(chǎn)生穩(wěn)定或瞬時(shí)基因表達(dá)。

基因修飾的病毒已經(jīng)廣泛應(yīng)用于將基因遞送至干細(xì)胞。用于本文描述的msc的遺傳修飾的優(yōu)選病毒載體涉及反轉(zhuǎn)錄病毒載體，尤其涉及γ反轉(zhuǎn)錄病毒載體。γ反轉(zhuǎn)錄病毒(有時(shí)稱為哺乳動(dòng)物c型反轉(zhuǎn)錄病毒)是慢病毒進(jìn)化枝的姊妹屬，是反轉(zhuǎn)錄病毒科的正反轉(zhuǎn)錄病毒亞科的成員。鼠白血病病毒(mlv或mulv)、貓白血病病毒(felv)、異嗜性鼠白血病病毒相關(guān)病毒(xmrv)和長(zhǎng)臂猿白血病病毒(galv)是γ反轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員。技術(shù)人員知道在msc的遺傳修飾中使用γ反轉(zhuǎn)錄病毒所需的技術(shù)。例如，可以采用maetzig等人(γ反轉(zhuǎn)錄病毒載體：生物學(xué)、技術(shù)和應(yīng)用(gammaretroviralvectors:biology,technologyandapplication),2001,virusesjun；3(6):677-713)描述的載體或相似的載體。例如，鼠白血病病毒(mlv)是一種簡(jiǎn)單的γ反轉(zhuǎn)錄病毒，其可以在創(chuàng)建γ反轉(zhuǎn)錄病毒修飾的msc和在遞送至受試者后由所述msc表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因的情況下轉(zhuǎn)化為有效的遺傳治療劑載體。

可以應(yīng)用腺病毒，或rna病毒如慢病毒，或其他反轉(zhuǎn)錄病毒。腺病毒已經(jīng)被用于產(chǎn)生一系列用于基因轉(zhuǎn)移細(xì)胞工程的載體。通過缺失e1基因(病毒復(fù)制所需)產(chǎn)生具有4kb克隆能力的載體，來生產(chǎn)初代腺病毒載體。另外缺失e3(負(fù)責(zé)宿主免疫應(yīng)答)允許8kb克隆能力。通過包括e2和/或e4缺失產(chǎn)生進(jìn)一步的代次。慢病毒是病毒的反轉(zhuǎn)錄病毒家族的成員(m.scherr等人,使用慢病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至造血干細(xì)胞(genetransferintohematopoieticstemcellsusinglentiviralvectors).currgenether.2002feb；2(1):45-55)。通過缺失除了ltr和順式作用包裝信號(hào)以外的整個(gè)病毒序列產(chǎn)生慢病毒載體。獲得的載體具有約8kb的克隆能力。這些載體與反轉(zhuǎn)錄病毒載體的一個(gè)區(qū)別特征是它們轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂中細(xì)胞和非分裂中細(xì)胞以及終末分化細(xì)胞的能力。

還可以采用非病毒方法，如以下供選擇的策略，其包括：常規(guī)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和通過使用整合酶或轉(zhuǎn)座酶技術(shù)的靶基因整合的應(yīng)用。這些表示用于載體轉(zhuǎn)化的方法，所述方法具有有效并且通常在它們的整合中是位點(diǎn)特異性的優(yōu)勢(shì)。將載體導(dǎo)入細(xì)胞的物理方法是技術(shù)人員已知的。一個(gè)例子涉及電穿孔，其依賴于使用通過克服它的電容在膜上產(chǎn)生瞬時(shí)孔的短時(shí)高電壓的電脈沖。該方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以將它用于在大多數(shù)細(xì)胞類型中穩(wěn)定和瞬時(shí)基因表達(dá)。可供選擇的方法涉及使用脂質(zhì)體或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域。適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)技術(shù)人員是已知的，并且不意欲作為本發(fā)明的限制性實(shí)施方式。

附圖說明

為了描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式，通過證明本發(fā)明的實(shí)踐實(shí)施提供了以下附圖，而不限制對(duì)本發(fā)明的范圍或本文描述的構(gòu)思。

附圖簡(jiǎn)述：

圖1：本發(fā)明的優(yōu)選的表達(dá)盒。

圖2：ht1080細(xì)胞上的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液的滴定。

圖3：用病毒表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代人msc的胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分析。

圖4：由elisa評(píng)估轉(zhuǎn)基因aat的表達(dá)。

圖5：通過由轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc所表達(dá)的aat抑制嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶。

圖6：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)blm誘導(dǎo)的肺纖維化模型。

附圖的詳述：

圖1：本發(fā)明的優(yōu)選的表達(dá)盒。

本發(fā)明的優(yōu)選的表達(dá)盒的示意圖。圖中所示的數(shù)字表示apceth的內(nèi)部質(zhì)粒名稱，并且為了簡(jiǎn)化起見將在本文使用。啟動(dòng)子以小寫p表示。ltr元件涉及使用的γ反轉(zhuǎn)錄病毒載體的長(zhǎng)末端重復(fù)序列。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)縮寫為ires。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件縮寫為opre。使用嘌呤霉素抗性基因(pac)進(jìn)行選擇。

圖2：ht1080細(xì)胞上的反轉(zhuǎn)錄病毒上清液的滴定。

與較小的構(gòu)建體如包含efs啟動(dòng)子的構(gòu)建體(例如159或194)相比，較大的構(gòu)建體(例如161和164，其中serpina1cdna由全長(zhǎng)ef1a啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))雖然具有充足的滴度但產(chǎn)生減少。在本實(shí)驗(yàn)中，用慢病毒構(gòu)建體215獲得了最高的滴度。

圖3：用病毒表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分析。

圖3a：用病毒表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代人msc的胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分析-icaat陽(yáng)性細(xì)胞％。圖3a描繪了用不同的γ-反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體和慢病毒表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)后胞內(nèi)aat染色陽(yáng)性的msc的百分比。圖3b：用病毒表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代人msc的胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分析-平均熒光強(qiáng)度(mfi)。圖3b描繪了用不同的γ-反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體和慢病毒表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc的均熒光強(qiáng)度(mfi)值。所有測(cè)試的載體構(gòu)建體均能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人msc，并且在所有轉(zhuǎn)導(dǎo)的樣品中通過胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因aat。通過icaat陽(yáng)性細(xì)胞％測(cè)量的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的差異最可能是由于用于轉(zhuǎn)導(dǎo)所使用的病毒上清的不同的起始滴度。通過mfi分析的不同表達(dá)水平是使用不同的啟動(dòng)子以及變化的基因盒分布(genecassetteconstellations)的結(jié)果。

圖4：由elisa評(píng)估轉(zhuǎn)基因aat的表達(dá)。

通過elisa在所有樣品中證實(shí)原代人msc中的轉(zhuǎn)基因aat的表達(dá)。表達(dá)量的差異是由于載體中使用不同的啟動(dòng)子以及變化的基因盒分布。

圖5：通過由轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc所表達(dá)的aat抑制嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶。

由轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代人msc表達(dá)的aat是功能性的，并且以與含有10％血清或約1.5μmspck的培養(yǎng)基相當(dāng)?shù)乃揭种剖戎行粤＜?xì)胞彈性蛋白酶。

圖6：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)blm誘導(dǎo)的肺纖維化模型(改編自tashiro等人,2015)。

實(shí)施例

通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。這些實(shí)施例不意圖限制本發(fā)明的范圍。實(shí)驗(yàn)例涉及能夠使α-1抗胰蛋白酶(aat)由遺傳修飾的msc表達(dá)的技術(shù)的開發(fā)。實(shí)施例進(jìn)一步涉及涵蓋肺部病癥的治療的治療性試驗(yàn)。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，實(shí)施例涉及結(jié)合α-1抗胰蛋白酶(aat)的抗炎作用與原代人間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)的免疫調(diào)節(jié)特性的新的基因治療產(chǎn)品的臨床前開發(fā)，所述新的基因治療產(chǎn)品用于治療炎性肺部疾病。

1.反轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體的設(shè)計(jì)和克隆：

使用如julialodge,peterlund,steveminchin(2007)基因克隆(genecloning),newyork:tylorandfrancisgroup中描述的標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。這些構(gòu)建體表達(dá)的基因是人serpina1cdna{智人(homosapiens)絲氨酸蛋白酶肽酶抑制劑肽酶抑制劑，分支1(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶)，成員1(serpina1)，轉(zhuǎn)錄變體1，mrna；ncbi參考序列：nm_000295.4，編碼α-1抗胰蛋白酶(aat)}。還評(píng)估了根據(jù)seqidno2的上文描述的密碼子優(yōu)化cdna。

本文描述的serpina1基因通過激活不同的組成型啟動(dòng)子來表達(dá)，所述組成型啟動(dòng)子如人eef1a1真核翻譯延伸因子1α1啟動(dòng)子(pef1a)、短形式的人eef1a1真核翻譯延伸因子1α1啟動(dòng)子(pefs)、或人磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(ppgk)。啟動(dòng)子也可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如tie2、rantes或hsp70啟動(dòng)子。

該基因可以或不可以與標(biāo)簽序列(例如標(biāo)記蛋白/肽，例如血凝素標(biāo)簽或his標(biāo)簽)融合，以便隨后容易地檢測(cè)表達(dá)(hinrikgaroff，1985，細(xì)胞生物學(xué)年度綜述(annualreviewofcellbiology)，vol1：403-445)。

表達(dá)盒可以包括或可以不包括由選擇性標(biāo)記基因(如細(xì)胞表面標(biāo)記物或抗性基因(例如用于賦予嘌呤霉素抗性的pac基因))組成的第二轉(zhuǎn)基因盒以在隨后的過程中允許富集基因修飾的細(xì)胞(davidp.clark,nanettej.pazdernik,2009,生物科技：應(yīng)用基因革命(biotechnology:applyingthegeneticrevolution),london:elsevier)?；蛴蓡为?dú)的啟動(dòng)子或位于serpina1表達(dá)盒內(nèi)的ires序列的3’端的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

為了評(píng)估潛在的位置效應(yīng)，將serpina1和pac盒以不同的分布(constellations)克隆(pac盒克隆在serpina1盒5’，以及serpina1盒克隆在pac盒5’)，參見圖1。

然后將圖1中公開的表達(dá)盒通過標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)插入合適的載體系統(tǒng)，例如γ-反轉(zhuǎn)錄病毒骨架(例如psers11、ep2019134a1)或慢病毒骨架(例如美國(guó)專利8,846,385，通過引用將其全文并入本文)。

在γ-反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體中，在表達(dá)盒3’存在opre序列。反轉(zhuǎn)錄病毒骨架含有長(zhǎng)末端重復(fù)序列(ltr)，其位于盒的5’端和3’端。5’-ltr含有sv40增強(qiáng)子、rsv啟動(dòng)子、sffvpr和u5區(qū)。3’-ltr含有sffvpu3區(qū)、sffvr和u5區(qū)以及polya信號(hào)，所述sffvpu3區(qū)具有缺失，并且因此為載體提供了自我失活(sin)。

在慢病毒構(gòu)建體中，在表達(dá)盒3’存在opre序列。慢病毒骨架含有長(zhǎng)末端重復(fù)序列(ltr)，其位于盒的5’端和3’端。5’-ltr含有cmv啟動(dòng)子和hiv-1r和u5區(qū)。3’-ltr含有hiv-1u3區(qū)、hiv-1r和u5區(qū)以及polya信號(hào)，所述hiv-1u3區(qū)具有缺失，并且因此為載體提供了自我失活(sin)。

2.反轉(zhuǎn)錄病毒上清的滴定：

通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞產(chǎn)生編碼指定的載體的病毒顆粒(soneoka等人,nucleicacidsresearch,1995)。為了確定病毒滴度，在第1天將ht1080纖維肉瘤細(xì)胞接種于12孔板，在第2天將病毒上清按不同稀釋度添加至細(xì)胞，使用三個(gè)對(duì)照孔來確定每孔中的細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，通過檢測(cè)aat蛋白的胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。為了增強(qiáng)蛋白的檢測(cè)，在染色之前，用golgiplug蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(bd,555029)處理細(xì)胞16至24小時(shí)以防止細(xì)胞溶質(zhì)蛋白分泌。根據(jù)制造商的指示，使用bdcytofix/cytoperm固定和透化溶液(bd，554722)使細(xì)胞透化，用fitc綴合的抗α1抗胰蛋白酶抗體(abcam，ab19170；每100μl染色反應(yīng)1μl抗體，并高達(dá)1×10⁶個(gè)細(xì)胞，在黑暗中在4℃下溫育20至30分鐘)將表達(dá)aat的細(xì)胞染色。在beckmancoulterfc500流式細(xì)胞儀上分析細(xì)胞。在滴度計(jì)算中僅包括<25％的icaat陽(yáng)性細(xì)胞的值。

結(jié)果參見圖2。

3.人間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)的制備：

如d.j.prockop,d.g.phinney,b.a.bunnell,分子生物學(xué)中的方法(methodsinmolecularbiology)449,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells),托托瓦:胡瑪娜出版社(totowa:humanapress)中的pittinger,m.f.(2008)中來自成人骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcellsfromadultbonemarrow)所描述，通過塑料貼附法從骨髓分離人msc，并且在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如含有fbs的dmem)中培養(yǎng)所述msc。

4.msc的遺傳修飾：

用如murray等人,1999人類基因治療(humangenetherapy).10(11):1743-1752和davis等人,2004生物物理學(xué)期刊(biophysicaljournal)第86卷1234–1242描述的并進(jìn)行修改來進(jìn)行原代msc的轉(zhuǎn)導(dǎo)。詳細(xì)地：用聚l-賴氨酸(pll)(例如sigma-aldrich,p4707-50ml)來包被6孔培養(yǎng)板或12孔培養(yǎng)板(例如corning)；用pbs將pll溶液(0.01％)稀釋至0.001％的終濃度。每孔使用1至2ml的稀釋的pll。在室溫下將板溫育至少2小時(shí)。溫育后，用pbs洗滌板一次。將(稀釋的)病毒上清以0.8至2ml的終體積添加至每個(gè)pll包被的孔中。在4℃下以2000×g離心負(fù)載的板30分鐘。然后棄去上清，將1×10⁵個(gè)msc以2ml的體積接種于6孔板中的一個(gè)孔中，或?qū)?×10⁴個(gè)細(xì)胞以1ml的體積接種于12孔板的孔中。在37℃下在5％co2下溫育板用于進(jìn)一步的使用。

5.通過胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估轉(zhuǎn)基因aat表達(dá)：

為了評(píng)估原代人msc中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和aat表達(dá)，制備細(xì)胞并如上描述用0.25至10的感染復(fù)數(shù)(moi)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。用嘌呤霉素(sigmaaldrich,p9620-10ml,[10mg/ml],終濃度：1至5μg/ml)選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞5至8天。通過如上描述的胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)分析選擇的細(xì)胞。

所有測(cè)試的載體構(gòu)建體均能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人msc，在所有轉(zhuǎn)導(dǎo)的樣品中通過胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因aat。通過icaat陽(yáng)性細(xì)胞％測(cè)量的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的差異最可能是由于用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒上清的不同起始滴度導(dǎo)致的，使得進(jìn)一步分離和培養(yǎng)時(shí)的任何的提供的細(xì)胞群可能提供適合的aat表達(dá)。通過mfi分析的不同表達(dá)水平是由于使用的不同的啟動(dòng)子以及變化的基因盒分布(constellations)的結(jié)果。

結(jié)果參見圖3。

6.通過elisa評(píng)估轉(zhuǎn)基因aat的表達(dá)：

用表達(dá)aat和pac基因的指定的反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)人msc。如上所述用嘌呤霉素選擇細(xì)胞，并將1×10⁵個(gè)細(xì)胞接種到6孔或12孔板上。在48小時(shí)后收集上清(1至2ml)，并根據(jù)制造商的指示通過elisa(α-1抗胰蛋白酶(serpina1)人elisa試劑盒,abcam,ab108799)分析所述上清。將產(chǎn)生的數(shù)據(jù)歸一化為1×10⁵個(gè)細(xì)胞和載體拷貝數(shù)(vcn)。

通過elisa在所有樣品中證實(shí)原代人msc中的轉(zhuǎn)基因aat表達(dá)。表達(dá)的量的差異是由于載體中使用的不同的啟動(dòng)子以及變化的基因盒分布，使得提供的每個(gè)樣品在蛋白水平上的充分的aat表達(dá)成為可能以獲得希望的效果。

結(jié)果參見圖4。

7.由轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc表達(dá)的aat抑制嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶：

用表達(dá)aat和pac基因的指定的反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)人msc。用嘌呤霉素選擇細(xì)胞，將選擇的細(xì)胞接種于6孔板或12孔板的不含血清的dmem中。在48小時(shí)后收集上清(1至2ml)，根據(jù)制造商的指示通過嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑篩選試劑盒(abcam,ab118971)分析上清。在不含血清的dmem中以未稀釋(1:1)至1:16的不同稀釋度分析轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc的上清。不同濃度的spck和含有血清(bio-m和bio-1)的培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照包括，dmem用作陰性對(duì)照。

嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的抑制是用于檢測(cè)體外aat活性的功能性測(cè)定。本文提供的構(gòu)建體顯示了對(duì)嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的有效抑制，從而表明了由實(shí)施例的修飾的msc表達(dá)功能性aat。

結(jié)果參見圖5。

8.msc表達(dá)的aat對(duì)單核細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的評(píng)估：

使用ivanj.fuss,marjoriee.kanof,phillipd.smith,heddyzola,2009curr.protoc.immunol.85:7.1.1-7.1.8描述的聚蔗糖密度梯度離心從人血液中分離外周血單核細(xì)胞(pbmc)。為了評(píng)估aat-msc的體外免疫調(diào)節(jié)作用，如janciauskiene等人,生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(biochemicalandbiophysicalresearchcommunications),2004描述的進(jìn)行l(wèi)ps誘導(dǎo)的人類單核細(xì)胞激活。簡(jiǎn)單來說，用脂多糖(lps)刺激單核細(xì)胞，通過elisa在上清中評(píng)估m(xù)sc表達(dá)的aat對(duì)促炎細(xì)胞因子(如tnfα和il-1β)的分泌的作用以及對(duì)由人單核細(xì)胞表達(dá)抗炎細(xì)胞因子(如il-10)的作用。

當(dāng)在由遺傳修飾的msc分泌的aat的存在(來自轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)aat的msc的上清)下培養(yǎng)人原代單核細(xì)胞時(shí)，從單核細(xì)胞培養(yǎng)物收獲的上清中的促炎細(xì)胞因子(tnfα、il-1α)的表達(dá)顯著降低，而抗炎細(xì)胞因子如il-10的水平提高。

9.在動(dòng)物模型中施用aat-msc的免疫調(diào)節(jié)作用的評(píng)估：

制備用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞并如上所述遺傳修飾所述細(xì)胞。在深低溫保存或收獲用于施用之前，進(jìn)一步選擇并擴(kuò)增轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。在注射前將細(xì)胞解凍，用pbs或任何其它合適的緩沖液洗滌和重懸，或從培養(yǎng)瓶分離，用pbs或任何其它合適的緩沖液洗滌和重懸，然后注射。

10.博來霉素(blm)誘導(dǎo)的肺纖維化：

為了測(cè)試體內(nèi)aat-msc的免疫調(diào)節(jié)作用和抗纖維化作用，如tashiro等人,轉(zhuǎn)化科學(xué)(translationalscience)2015描述的進(jìn)行了博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的小鼠模型。

簡(jiǎn)單來說，在c57bl/6小鼠中誘導(dǎo)blm肺纖維化。施用麻醉后，通過經(jīng)插管的直接氣管內(nèi)滴注以2.5u每kg體重施用溶解于50μl無菌鹽水中的blm硫酸鹽(sigma-aldrich)。blm施用后24至72小時(shí)，每只動(dòng)物通過尾靜脈注射或氣管內(nèi)施用接受200μlpbs(對(duì)照)、200μlpbs中的1×10⁶個(gè)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc或200μlpbs中的1×10⁶個(gè)aat轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc。每隔一天通過眶后采血監(jiān)測(cè)血清aat水平，通過elisa進(jìn)行aat蛋白的后續(xù)檢測(cè)。

施用blm后14至21天處死小鼠。

從小鼠收獲左側(cè)肺葉用于蛋白和信使rna(mrna)分析。對(duì)于形態(tài)測(cè)量學(xué)和病理學(xué)研究，通過在10％中性緩沖福爾馬林中浸泡24小時(shí)來固定右側(cè)肺葉，然后將其轉(zhuǎn)移至4℃的pbs。將樣品石蠟包埋，獲得切片用于蘇木精-伊紅和馬松三色染色。使用對(duì)馬松三色染色載玻片的半定量阿?？朔蚍?ashcroftmethod)評(píng)估肺纖維化(ashcroft等人,臨床病理學(xué)期刊(journalofclinicalpathology)1988)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的綜述參見圖6。

在第21天處死的時(shí)間點(diǎn)，通過阿?？朔蚍?jǐn)?shù)未經(jīng)msc處理的blm小鼠顯示了肺纖維化，而用msc或aat-msc處理的小鼠顯示降低的纖維化。這種降低在接受了表達(dá)aat的msc的組中更顯著。

11.環(huán)磷酰胺促進(jìn)的1型糖尿?。?/p>

為了評(píng)估aat-msc對(duì)體內(nèi)糖尿病發(fā)展的影響，進(jìn)行了環(huán)磷酰胺促進(jìn)的1型糖尿病的小鼠模型(改編自brode等人,免疫學(xué)期刊(thejournalofimmunology)2006)。

獲得nod小鼠，其中到40周齡時(shí)，雌性小鼠中糖尿病的發(fā)病率為75％。為了促進(jìn)和使糖尿病同步，向8周齡雌性nod小鼠單次腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺(cy)(200mg/kg體重于0.9％生理鹽水中)對(duì)其進(jìn)行處理。然后將小鼠隨機(jī)分為處理組和對(duì)照組。環(huán)磷酰胺處理后1至5天，每只動(dòng)物通過尾靜脈注射或腹腔內(nèi)注射接受200μlpbs(對(duì)照)、200μlpbs中的1×10⁶個(gè)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc或200μlpbs中的1×10⁶個(gè)aat轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc。每周監(jiān)測(cè)小鼠的高血糖癥，直到其按照兩次連續(xù)的(間隔>24小時(shí))非空腹血糖水平>240mg/dl的定義的，成為糖尿病小鼠。

接受cy和pbs的所有對(duì)照小鼠在30天內(nèi)均發(fā)展出糖尿病，而用msc或aat-msc處理的小鼠中糖尿病的發(fā)作延遲。有趣的是，在用aat-msc處理的小鼠中，與未修飾的msc相比，糖尿病發(fā)展的延遲增加了2周。

12.msu/c16.0誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎：

為了評(píng)估aat-msc對(duì)體內(nèi)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎作用，進(jìn)行了msu/c16.0誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型(改編自joosten等人,風(fēng)濕病年鑒(annalsoftherheumaticdiseases)2015)。

雄性c57bl/6小鼠獲得自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(jacksonlaboratories)(巴爾港，緬因，usa)，并且在10至12周時(shí)使用。在誘導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎之前的1至3天，每只動(dòng)物通過腹腔內(nèi)施用接受200μlpbs(對(duì)照)、200μlpbs中的1×10⁶個(gè)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc或200μlpbs中的1×10⁶個(gè)aat轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc。通過將在10μlpbs中混合了200μmc16.0/牛血清白蛋白(bsa)的300μgmsu晶體關(guān)節(jié)內(nèi)注射至未實(shí)驗(yàn)的小鼠(naivemice)的右膝關(guān)節(jié)，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥。關(guān)節(jié)內(nèi)注射4小時(shí)后，確定肉眼可見的關(guān)節(jié)腫脹。分離滑膜組織并在37℃下在組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)，或直接轉(zhuǎn)移至200μltriton×100(在pbs中為0.5％)。此外，移出膝關(guān)節(jié)用于病理學(xué)。

用未修飾的msc或aat-msc處理抑制了mscu/c16.0誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥；然而，當(dāng)用aat-msc處理小鼠時(shí)，炎癥更顯著地降低。

13.aat-msc對(duì)mhc匹配的少數(shù)抗原不同的鼠移植模型的gvhd預(yù)防的作用：

為了評(píng)估aat-msc的可能的抗gvhd作用，進(jìn)行鼠移植模型(mhc匹配的，少數(shù)抗原不同的)(改編自marcondes等人,血液(blood)2011)。

10至14周齡的平均體重為28g的c57/bl6j小鼠(h-2^b；杰克遜實(shí)驗(yàn)室)接受單次劑量的1000cgy全身照射，然后通過尾靜脈內(nèi)注射t細(xì)胞消除(t-celldepleted)的骨髓(5×10⁶個(gè)細(xì)胞)，以及來自c3h.sw-h2b/snj供體(h-2bc；杰克遜實(shí)驗(yàn)室)的cd8+脾淋巴細(xì)胞(0.2×10⁶個(gè)細(xì)胞)。將小鼠隨機(jī)分為處理組和對(duì)照組。在照射和供體細(xì)胞融合之前，通過腹腔內(nèi)注射或尾動(dòng)脈內(nèi)注射給予實(shí)驗(yàn)組中的小鼠200μlpbs中的1×10⁶個(gè)未轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc或200μlpbs中的1×10⁶個(gè)aat轉(zhuǎn)導(dǎo)的msc。還向?qū)φ战M中的小鼠腹腔內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射200μlpbs。通過標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分系統(tǒng)(cooke等人,血液(blood)1996)評(píng)估了gvhd：在第0天獲得并記錄體重，之后每周進(jìn)行一次。通過將5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的分?jǐn)?shù)：(體重改變、姿態(tài)(弓背)、活動(dòng)性、皮毛紋理和皮膚完整性的百分比)(最大分?jǐn)?shù)＝10)求和生成每周臨床指數(shù)。繼續(xù)收集血液樣品用于細(xì)胞因子測(cè)定。

與對(duì)照小鼠相比，用未修飾的msc或aat-msc處理導(dǎo)致減弱或預(yù)防gvhd以及優(yōu)秀的存活率。有趣的是，與天然msc相比，aat-msc的有益效果更突出。