本發(fā)明涉及以高純度且不經(jīng)過辛苦操作生產(chǎn)無包膜病毒顆粒的方法。

背景技術(shù)：

在基因重組領(lǐng)域或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，對于將基因引入包括人的哺乳動物的細胞中，目前已經(jīng)使用了使用電穿孔或金屬微粒的物理方法、使用核酸、聚陽離子或脂質(zhì)體的化學(xué)方法、以及使用病毒衍生的用于基因轉(zhuǎn)移的載體（在下文中，被稱作病毒載體）的生物學(xué)方法。病毒載體意指通過改變天然病毒使得所述病毒可以將期望的基因等轉(zhuǎn)移進靶標(biāo)中而得到的載體，并且這樣的載體的開發(fā)最近已經(jīng)進步。通過基因重組技術(shù)制備的病毒載體通常被稱作重組病毒載體。從其中衍生出重組病毒載體的病毒的眾所周知的例子包括帶有包膜的病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、仙臺病毒和皰疹病毒，和不帶有包膜的病毒（無包膜病毒）例如腺病毒和腺伴隨病毒（在下文中，被稱作aav）。

具體地，aav可以感染包括人細胞的多種細胞，并且aav甚至感染其中分化終止的非分裂細胞，包括血細胞、肌細胞和神經(jīng)細胞。另外，由于aav對人不是病原性的，它具有低副作用風(fēng)險。aav的病毒顆粒是物理化學(xué)上穩(wěn)定的。因為這些原因，對于作為在基因治療中應(yīng)用的用于基因轉(zhuǎn)移的載體的實用價值，aav最近已經(jīng)引起注意，所述基因治療用于治療先天性遺傳疾病以及治療癌癥或感染。

生產(chǎn)重組病毒載體的方法經(jīng)常包括，將病毒顆粒形成所必需的元件以一個或多個核酸構(gòu)建體的形式引入細胞中以產(chǎn)生具有生產(chǎn)病毒的能力的細胞(在下文中，被稱作病毒生產(chǎn)細胞)，和培養(yǎng)所述細胞以表達所述病毒顆粒形成所必需的元件。一般而言，在所述病毒顆粒形成所必需的元件中，將需要以順式提供的元件和可以以反式提供的元件分別地引入用于病毒生產(chǎn)的細胞，由此防止野生型病毒的生產(chǎn)和重組病毒在被該病毒感染的宿主中的自我復(fù)制(專利文獻1)。

在下文中，作為一個例子，具體地解釋從aav衍生的重組載體(在下文中，被稱作raav)。一種確立的方法包括：1)引入raav質(zhì)粒，其中保留放置在野生型aav基因組的每個末端處的itr，且除去rep和cap基因，和2)引入用于表達rep和cap基因的質(zhì)粒以反式提供rep和cap蛋白，和3)用腺病毒感染，因為aav需要提供來自被稱為輔助病毒的任意病毒諸如腺病毒、皰疹病毒或痘苗病毒的補充元件用于形成感染性病毒顆粒。通過上述方法得到的載體溶液在理論上被腺病毒污染。為了避免腺病毒污染，已經(jīng)開發(fā)了一種生產(chǎn)載體的方法，其替代上述3)包括3')引入輔助質(zhì)粒，在腺病毒衍生的元件中，其僅表達aav病毒顆粒的形成所必需的元件(無輔助系統(tǒng))。

將已經(jīng)完成病毒生產(chǎn)的病毒生產(chǎn)細胞收集和均質(zhì)化以得到含有raav顆粒的細胞勻漿。對細胞勻漿進行合適的步驟諸如用濾器過濾、超速離心、層析或超濾，以將raav顆粒純化為終產(chǎn)物。

目前，由于病毒載體的用途被延伸至用于基因治療的基礎(chǔ)研究或臨床應(yīng)用的領(lǐng)域，需要以較高滴度和較高純度得到病毒顆粒的方法。公開了多種改善的方法。例如，已知一種增加病毒顆粒生產(chǎn)和所述病毒顆粒向培養(yǎng)上清中的釋放速率的方法，其包括，在其中培養(yǎng)基具有升高的ph的脅迫條件下培養(yǎng)病毒生產(chǎn)細胞(專利文獻1)。其它方法包括對生產(chǎn)的病毒的純化及其以后的步驟的改善。對于raav顆粒的純化，建議了不應(yīng)用超速離心或?qū)游龅募兓鞣N血清型的raav顆粒的方法(非專利文獻1和非專利文獻2)。但是，所述純化方法包括4個步驟：聚乙二醇(peg)相和水相的雙相分離，用peg沉淀，用氯仿處理，和透析；并且因此是復(fù)雜的。此外，通過該純化方法純化的產(chǎn)物包含sds-page上的許多條帶，其可能來自雜質(zhì)。因此，該純化方法從純度和簡便性的角度而言不是足夠的。因此，在raav顆粒純化之前執(zhí)行的病毒生產(chǎn)細胞的處理中仍然存在改善的空間。

引文列表

專利文獻

專利文獻1:wo2000/14205

非專利文獻

非專利文獻1:j.virol.methods,vol.183,no.2,pp.139-146,2012

非專利文獻2:bioengineered,vol.4,no.2,pp.103-106,2013。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明的一個目的是，提供以高純度和不經(jīng)過辛苦操作生產(chǎn)無包膜病毒顆粒的方法。

問題的解決方案

針對提供以高純度和不經(jīng)過辛苦操作生產(chǎn)無包膜病毒顆粒的方法的目的，本發(fā)明人專心地進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過向包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品加入降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)，和除去在酸化加入該物質(zhì)后的樣品的步驟中形成的沉淀物，獲得包含無包膜病毒顆粒的級分。因而，完成了本發(fā)明。

本發(fā)明提供：

[1]生產(chǎn)無包膜病毒顆粒的方法，所述方法包括：

(a)向包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品加入降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)的步驟，

(b)酸化加入了該物質(zhì)的樣品的步驟，

(c)除去步驟(b)中形成的沉淀物以獲得包含無包膜病毒顆粒的級分的步驟；

[2]根據(jù)[1]的方法，其在步驟(c)之后進一步包括(d)純化無包膜病毒的步驟；

[3]根據(jù)[1]或[2]的方法，其中降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)是表面活性劑；

[4]根據(jù)[1]至[3]中任一項的方法，其中酸化步驟是加入酸性溶液的步驟；

[5]根據(jù)[1]至[4]中任一項的方法，其中包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品是無包膜病毒生產(chǎn)細胞的溶解物或勻漿、含有無包膜病毒顆粒的無包膜病毒生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)上清、或從無包膜病毒生產(chǎn)細胞獲得的提取物；

[6]根據(jù)[5]的方法，其中包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品是通過用酸性溶液處理無包膜病毒生產(chǎn)細胞獲得的提取物的中和產(chǎn)物；

[7]根據(jù)[1]至[6]中任一項的方法，其中包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品是用核酸酶處理的樣品；

[8]根據(jù)[1]至[7]中任一項的方法，其中無包膜病毒顆粒是腺伴隨病毒顆粒；

[9]試劑盒，其用于實施根據(jù)[1]至[8]中任一項的方法，所述試劑盒包括：

(1)降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)，和

(2)酸性溶液；和

[10]根據(jù)[9]的試劑盒，其進一步包括中和溶液。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，提供以高純度和不經(jīng)過辛苦操作生產(chǎn)無包膜病毒顆粒的方法。

附圖說明

[圖1]圖1顯示實施例1中制備的樣品的sds-page的結(jié)果。

[圖2]圖2顯示實施例1中制備的樣品的回收率。

[圖3]圖3顯示實施例2中制備的樣品的sds-page的結(jié)果。

[圖4]圖4顯示實施例3中制備的樣品的sds-page的結(jié)果。

[圖5]圖5顯示實施例6中制備的樣品的sds-page的結(jié)果。

具體實施方式

本文中使用的無包膜病毒指的是除了有包膜病毒以外的病毒。有包膜病毒指的是在病毒表面上具有脂質(zhì)層或脂質(zhì)雙層的病毒。無包膜病毒的代表性例子包括dna基因組病毒，例如腺病毒、細小病毒、乳多空病毒和人乳頭瘤病毒，和rna基因組病毒，例如輪狀病毒、柯薩奇病毒、腸道病毒、扎幌病毒、諾如病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、埃可病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒和星狀病毒。

通過本發(fā)明的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的無包膜病毒包括但不限于，已知其生產(chǎn)方法的無包膜病毒，從自然界新得到的無包膜病毒，和從上述無包膜病毒衍生的基因重組病毒載體。通過本發(fā)明的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的無包膜病毒的優(yōu)選例子包括腺病毒以及屬于細小病毒科的aav。本發(fā)明的生產(chǎn)方法適于任何已知血清型的aav的生產(chǎn)。例如，本發(fā)明的生產(chǎn)方法可用于選自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12和aav13的至少一種aav的生產(chǎn)。如本文所用的，raav的血清型基于raav的衣殼由其衍生的aav的血清型。換言之，raav的血清型取決于用于制備raav的cap基因的來源而確定，并且不取決于raav顆粒中包封的aav基因組的血清型。例如，當(dāng)raav的衣殼衍生自aav6且raav顆粒中包封的aav基因組中的itrs衍生自aav2時，如本文所用的，raav的血清型是6。此外，本發(fā)明的生產(chǎn)方法適于包含上述血清型的aav衣殼的變體的aav的生產(chǎn)。

如本文所用的，"病毒顆粒"意味著由稱為衣殼的蛋白殼構(gòu)成的顆粒。如本文所用的，"病毒載體"意味著病毒顆粒中包含的病毒基因組(核酸形式)。例如，在aav的情況下，raav顆粒是由稱為衣殼的蛋白殼構(gòu)成的顆粒并且包括raav載體。raav載體包含raav顆粒中存在的病毒基因組dna。如本文所用的，"病毒顆粒"包括不包含病毒基因組的病毒樣顆粒(例如，aav中空顆粒：wo2012/144446)。病毒顆粒包括但不限于，衍生自raav載體的病毒樣顆粒和aav中空顆粒。

如本文所用的，"酸性"意味著處于低于ph6.5的ph，"中性"意味著處于ph6.5-7.5，并且"堿性"意味著處于超過ph7.5的ph。

下文對本發(fā)明進行解釋。

(1)本發(fā)明的無包膜病毒顆粒的生產(chǎn)方法

本發(fā)明的無包膜病毒顆粒的生產(chǎn)方法包括：

(a)向包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品加入降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)的步驟，

(b)酸化加入了該物質(zhì)的樣品的步驟，

(c)除去步驟(b)中形成的沉淀物以獲得包含無包膜病毒顆粒的級分的步驟。

具體地，首先，將降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)加入包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品。該物質(zhì)的加入可通過加入固體物質(zhì)實施，或優(yōu)選地通過以期望的最終濃度加入預(yù)先制備的溶液實施。樣品可在該物質(zhì)的加入之后立即接受下一步驟(b)，或優(yōu)選地，樣品在該物質(zhì)的加入之后靜置一會兒。樣品靜置的溫度和樣品靜置的時間可以適當(dāng)確定，并且沒有特別限定。例如，樣品靜置的溫度是0至40℃，優(yōu)選地4至37℃。例如，樣品靜置的時間是1分鐘至24小時，優(yōu)選地5分鐘至1小時。例如，樣品在37℃靜置30分鐘。

本發(fā)明方法中應(yīng)用的"降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)"意味著，與中性或堿性條件相比，具有降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的特性的物質(zhì)。該物質(zhì)沒有特別限定，并且優(yōu)選地是具有與樣品中的蛋白相互作用以降低在酸性條件下的蛋白的溶解度并使蛋白沉淀的特性的物質(zhì)。

本發(fā)明方法中應(yīng)用的"在酸性條件下沉淀的物質(zhì)"意味著，具有通過從中性或堿性條件變?yōu)樗嵝詶l件而自身沉淀的特性的物質(zhì)。該物質(zhì)沒有特別限定，并且優(yōu)選地是具有在酸性條件下自身與樣品中的蛋白一起沉淀的特性的物質(zhì)。

本發(fā)明方法中應(yīng)用的降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和在酸性條件下沉淀的物質(zhì)可以是不同的物質(zhì)或可以是相同的物質(zhì)。降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)的例子包括但不限于表面活性劑。該表面活性劑被大致分類為陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和兼性表面活性劑。

陰離子（anionic）表面活性劑也稱為陰離子（anion）表面活性劑，并且在水中電離成為有機陰離子。陰離子表面活性劑分類為羧酸型、磺酸型、硫酸酯型和磷酸酯型。羧酸型的例子包括脫氧膽酸鹽、膽酸鹽和月桂酰肌氨酸鹽?；撬嵝偷睦影ㄊ榛蛩猁}。鹽的優(yōu)選例子包括鈉鹽和鋰鹽。

非離子表面活性劑在水中不電離。非離子表面活性劑分類為酯型、醚型、酯醚型、鏈烷醇酰胺型、糖型和甲葡糖胺型。酯型的例子包括聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯[tween(注冊商標(biāo))20]、聚氧乙烯失水山梨醇單棕櫚酸酯[tween(注冊商標(biāo))40]、聚氧乙烯失水山梨醇單硬脂酸酯[tween(注冊商標(biāo))60]和聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯[tween(注冊商標(biāo))80]。醚型的例子包括聚氧乙烯壬基酚醚[nonidet(注冊商標(biāo))p-40]和聚氧乙烯烷基醚[brij(注冊商標(biāo))l23,brij(注冊商標(biāo))l58]。酯醚型的例子包括聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯己糖醇酐脂肪酸酯和失水山梨醇脂肪酸酯聚乙二醇。鏈烷醇酰胺的例子包括n,n-二[3-(d-葡萄糖酰氨基)丙基]脫氧膽酰胺。糖型的例子包括烷基麥芽糖苷（alkylmaltoside）和烷基吡喃葡萄糖苷（alkylglucopyranoside）。甲葡糖胺型的例子包括烷基-n-甲葡糖胺。

陽離子（cationic）表面活性劑也稱為陽離子（cation）表面活性劑，并且在水中電離成為有機陽離子。陽離子表面活性劑分類為烷基胺鹽型和季銨鹽型。烷基胺鹽型的例子包括一甲胺鹽酸鹽、二甲胺鹽酸鹽和三甲胺鹽酸鹽。季銨鹽型的例子包括溴化十六烷基三甲銨和溴化肉豆蔻基三甲銨。

兼性表面活性劑意味著分子內(nèi)既具有陰離子基團又具有陽離子基團的表面活性劑。在水溶液中電離的兼性表面活性劑與氨基酸類似，并且兼性表面活性劑包括許多氨基酸衍生物。因此，兼性表面活性劑具有類似氨基酸的等電點。當(dāng)兼性表面活性劑在比等電點更堿性的條件下存在時，其充當(dāng)陰離子表面活性劑，而當(dāng)兼性表面活性劑在比等電點更酸性的條件下存在時，其充當(dāng)陽離子表面活性劑。兼性表面活性劑的例子包括但不限于，磺基甜菜堿如月桂基磺基甜菜堿、辛酰基磺基甜菜堿、辛基磺基甜菜堿、棕櫚基磺基甜菜堿和肉豆蔻基磺基甜菜堿。

在本發(fā)明方法中，優(yōu)選應(yīng)用在酸性ph不溶解的陰離子表面活性劑。更優(yōu)選地，應(yīng)用羧酸型陰離子表面活性劑如脫氧膽酸鈉、鵝脫氧膽酸鈉、膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉或?；敲撗跄懰徕c。尤其優(yōu)選地，應(yīng)用脫氧膽酸鈉、鵝脫氧膽酸鈉或膽酸鈉。

在本發(fā)明方法步驟(a)中，降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)可以作為固體物質(zhì)加入，或可以作為預(yù)先制備的物質(zhì)溶液加入。溶液中物質(zhì)的濃度沒有特別限定，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定。用于制備物質(zhì)溶液的溶劑沒有特別限定，并且可以適當(dāng)選自水、緩沖液、用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基等。將降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)加入包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品使得物質(zhì)的濃度成為期望的最終濃度。物質(zhì)的期望的最終濃度沒有特別限定，只要它是這樣的濃度而允許樣品中的污染蛋白在酸性條件下沉淀。雖然物質(zhì)的期望的最終濃度取決于樣品中包含的無包膜病毒的種類或物質(zhì)的種類，例如，當(dāng)應(yīng)用脫氧膽酸鈉、鵝脫氧膽酸鈉或膽酸鈉時，最終濃度是例如0.1至2%(v/v)，優(yōu)選地0.2至1%(v/v)。當(dāng)降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)的最適濃度取決于無包膜病毒的種類變化時，確定物質(zhì)的適當(dāng)濃度是自然的。

然后，在本發(fā)明方法中，其中加入物質(zhì)的樣品的ph被酸化。這一步驟可以通過任何方法實施，只要該方法能夠酸化中性或堿性樣品，并且該方法沒有特別限定。用于酸化樣品的手段可以是樣品中氣態(tài)酸的鼓泡或固體酸的加入。尤其優(yōu)選地，加入預(yù)先制備的酸性溶液，使得成為期望的最終濃度。本發(fā)明中應(yīng)用的酸的例子包括選自檸檬酸、乙酸、蘋果酸、磷酸、鹽酸、硫酸、硝酸、乳酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、酒石酸、苯甲酸、磺基水楊酸、甲酸及它們的鹽、以及具有低于ph6.5的緩沖區(qū)的good氏緩沖液如mes和bis-tris的化合物。作為酸性溶液，例如，應(yīng)用含有上述化合物的溶液。用于制備酸性溶液的溶劑沒有特別限定。溶劑可以適當(dāng)選自水、緩沖液、用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基等。尤其優(yōu)選地，應(yīng)用包含檸檬酸或其鹽的水溶液。將酸或酸性溶液加入樣品使得成為期望的最終濃度。期望的最終濃度沒有特別限定，只要它是這樣的濃度而允許樣品的ph成為酸性。酸化樣品之后，樣品的最終ph優(yōu)選地低于ph6.5，更優(yōu)選地在ph4至6的范圍。當(dāng)樣品的最適ph取決于無包膜病毒的種類變化時，確定樣品的適當(dāng)ph是自然的。

本發(fā)明方法中應(yīng)用的包含無包膜病毒顆粒的樣品可以是衍生自無包膜病毒生產(chǎn)細胞的樣品。該病毒生產(chǎn)細胞包括但不限于，得自環(huán)境或來自具有感染的患者的臨床樣品的病毒生產(chǎn)細胞，和人工制備的病毒生產(chǎn)細胞。

用于制備無包膜病毒生產(chǎn)細胞的細胞沒有特別限定。用于制備無包膜病毒生產(chǎn)細胞的細胞的例子包括哺乳動物諸如人、猴和嚙齒動物的細胞，且其優(yōu)選例子包括具有高轉(zhuǎn)化效率的細胞如293細胞(atcccrl-1573)、293t/17細胞(atcccrl-11268)、293f細胞、293ft細胞(都由lifetechnologiescorp.制造)、g3t-hi細胞(wo2006/035829)、sf9細胞(atcccrl-1711)和aav293細胞(由stratagenecorp.制造)，aav293細胞為商購可得的用于病毒生產(chǎn)的細胞系。例如，293細胞等恒定地表達腺病毒e1蛋白。也可以使用這樣的細胞：其被修飾成短暫地或恒定地表達raav生產(chǎn)所需的一種或一些蛋白。在這些各種細胞中，通過應(yīng)用已知方法或商購可得的試劑盒可以引入無包膜病毒載體以獲得無包膜病毒生產(chǎn)細胞。無包膜病毒生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)可以在已知培養(yǎng)條件下實施。例如，細胞在30至37℃的溫度、95%的濕度和5至10%(v/v)的co2濃度培養(yǎng)。但是，無包膜病毒生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)條件不限于上述培養(yǎng)條件。所述細胞培養(yǎng)可以在上述范圍以外的溫度、濕度和co2濃度進行，只要完成期望的細胞生長和無包膜病毒的生產(chǎn)。培養(yǎng)期沒有特別限制，并且例如，細胞培養(yǎng)持續(xù)12-150小時，優(yōu)選48-120小時。

下文，作為無包膜病毒生產(chǎn)細胞的例子，對raav生產(chǎn)細胞進行解釋。raav生產(chǎn)細胞可以如下生產(chǎn)：在任何細胞中引入：(a)衍生自aav的編碼rep蛋白的核酸和編碼cap蛋白的核酸，和(b)提供腺病毒衍生元件例如e1a蛋白、e1b蛋白、e2蛋白、e4蛋白和varna的核酸，作為對于raav顆粒的形成所必需的元件，和(c)要包封在raav顆粒中的核酸。其中替代上述(b)中描述的核酸應(yīng)用腺病毒等作為輔助病毒的方法也是已知的。

衍生自aav的編碼rep蛋白的核酸和編碼cap蛋白的核酸、以及提供腺病毒衍生元件的核酸可以是任何形式，其沒有限定。這些核酸可以作為一個或多個能夠提供所述元件的核酸構(gòu)建體插入質(zhì)?；虿《据d體，然后該質(zhì)?；虿《据d體可以引入細胞。這些核酸向細胞中的引入可以通過已知方法應(yīng)用商購可得的或已知的質(zhì)?；虿《据d體實施。

要包封在raav顆粒中的核酸由衍生自aav的itr序列和期望被raav載體負載的核酸組成。期望被raav載體負載的核酸的例子包括任何外來基因，例如用于提供多肽(酶、生長因子、細胞因子、受體、結(jié)構(gòu)蛋白等)的核酸、反義rna、核酶、誘餌（decoy）、誘導(dǎo)rna干擾的rna等。另外，為了控制外來基因的表達，可以將合適的啟動子、增強子、終止子和其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件插入核酸中。例如，要包封在raav顆粒中的核酸可以含有期望被raav載體在2個itr序列之間負載的任何外來基因，或可以含有期望被raav載體負載的任何外來基因和至少一個元件，所述元件用于控制2個itr序列之間的外來基因的表達。要包封在病毒顆粒中的核酸可以作為核酸構(gòu)建體以質(zhì)粒的形式引入細胞中。例如，通過使用商購可得的paav-cmv載體(由takarabioinc.制造)等，可以構(gòu)建質(zhì)粒。

本發(fā)明方法中應(yīng)用的包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品可以通過例如如上述培養(yǎng)的無包膜病毒生產(chǎn)細胞的破壞或裂解而制備。在無包膜病毒生產(chǎn)細胞培養(yǎng)期間無包膜病毒顆粒泄露到培養(yǎng)基中的情況下，包含無包膜病毒顆粒的培養(yǎng)上清可以用作樣品。無包膜病毒生產(chǎn)細胞的破壞或裂解可以通過已知方法如超聲處理、凍融處理、酶處理或滲透壓處理實施。當(dāng)由此獲得的無包膜病毒生產(chǎn)細胞的溶解物或勻漿或包含無包膜病毒顆粒的培養(yǎng)上清具有中性或堿性ph時，溶解物或勻漿或培養(yǎng)上清可以直接用作包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品。當(dāng)溶解物或勻漿或培養(yǎng)上清不是中性或堿性ph，溶解物或勻漿或培養(yǎng)上清可以被中和以獲得要在本發(fā)明方法中應(yīng)用的包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品。如本文所用的，中和意味著但不限于，將堿性溶液或ph緩沖液加入酸性溶液。中和后的溶液(中和產(chǎn)物)可為中性或堿性的。堿性溶液的例子包括但不限于氫氧化鈉溶液和氫氧化鉀溶液。ph緩沖液的例子包括但不限于tris-hcl溶液。

要在本發(fā)明方法中應(yīng)用的包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品也可以是通過用酸性溶液處理無包膜病毒生產(chǎn)細胞獲得的提取物的中和產(chǎn)物。具體地，可以優(yōu)選應(yīng)用通過使無包膜病毒生產(chǎn)細胞接觸酸性溶液而獲得、并且然后被中和的樣品。這一步驟通過將無包膜病毒生產(chǎn)細胞的團塊(pellet)懸浮在酸性溶液中而實施，其中團塊(pellet)通過細胞培養(yǎng)后離心或過濾而除去培養(yǎng)溶液而收集，或通過向無包膜病毒生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)溶液加入成分而實施，其中該成分是能夠使培養(yǎng)溶液為酸性的成分。酸性溶液沒有限定，只要酸性溶液顯示比培養(yǎng)中的無包膜病毒生產(chǎn)細胞的ph低的ph，并且酸性溶液使得能夠從完成病毒生產(chǎn)的無包膜病毒生產(chǎn)細胞制備包含無包膜病毒顆粒的提取物。酸性溶液的例子包括與本發(fā)明方法步驟(b)中應(yīng)用的酸性溶液的例子相同的溶液。能夠使培養(yǎng)溶液為酸性的成分沒有限定，只要該成分將無包膜病毒生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)溶液的ph改變?yōu)楸扰囵B(yǎng)中的無包膜病毒生產(chǎn)細胞的ph低的ph，并且該成分使得能夠從完成病毒生產(chǎn)的無包膜病毒生產(chǎn)細胞制備包含無包膜病毒顆粒的提取物。該成分的例子包括與本發(fā)明方法步驟(b)中應(yīng)用的酸的例子相同的化合物。與酸性溶液或能夠使培養(yǎng)溶液為酸性的成分接觸的溫度和時間的例子包括但不特別限于，0至40℃，優(yōu)選地4至37℃，和1分鐘至48小時，優(yōu)選地5分鐘至24小時。處于與酸性溶液或能夠使培養(yǎng)溶液為酸性的成分接觸的狀態(tài)的無包膜病毒生產(chǎn)細胞、或處于中和后的狀態(tài)的提取物也可以長期儲存在超低溫冰箱中，例如在-80℃。該接觸步驟導(dǎo)致無包膜病毒釋放到病毒生產(chǎn)細胞之外。

本發(fā)明方法中應(yīng)用的包含無包膜病毒顆粒的中性或堿性樣品可以預(yù)先用核酸酶處理。例如，在加入降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)之前，包含無包膜病毒顆粒的樣品可以用核酸酶處理。用于該步驟的核酸酶優(yōu)選地是作用于提取物中包含的dna的核酸酶。核酸酶的例子包括benzonase(注冊商標(biāo))(由merckmilliporecorporation制造)和cryonase冷活化核酸酶(由takarabioinc.制造)。用于核酸酶處理的溫度和時間沒有特別限定，并且可以取決于要應(yīng)用的核酸酶的種類適當(dāng)確定。

在本發(fā)明方法中，除去形成的沉淀物以獲得包含無包膜病毒顆粒的級分的步驟意味著，除去在酸化步驟中形成的沉淀物以獲得包含無包膜病毒顆粒的級分的步驟。沉淀物可以通過已知的固液分離方法如過濾，優(yōu)選地離心而除去。

通過除去沉淀物的步驟獲得的包含無包膜病毒顆粒的級分可以進一步接受純化步驟。通過純化步驟，無包膜病毒顆?？梢员粷饪s。用于純化的方法的例子包括超速離心、層析、超濾和其它已知方法。

超濾意味著應(yīng)用超濾膜過濾。超濾膜意味著具有物理上明確的許多細孔的分離膜?？紤]到無包膜病毒的純化和污染物質(zhì)的除去，超濾膜的分子量邊界（cutoff）優(yōu)選地是50至300kda，更優(yōu)選地70至150kda，進一步優(yōu)選地100kda。例如，可以應(yīng)用超濾膜amicon(注冊商標(biāo))ultra-15，其具有100kda的分子量邊界(由merckmilliporecorporation制造，下文稱為100kda超濾膜)。同時，聚乙二醇(peg)可以加入含有無包膜病毒顆粒的級分以改善無包膜病毒顆粒的回收率。加入的peg沒有特別限定，并且可以應(yīng)用具有各種平均分子量的peg。例如，在本發(fā)明中應(yīng)用具有200至10,000的平均分子量、優(yōu)選地4,000至8,000的平均分子量的peg。更優(yōu)選地，可以應(yīng)用具有6,000的平均分子量的peg。

無包膜病毒顆粒通過層析的純化可以通過離子交換柱(例如，mustangq，由pallcorp.制造)、親和柱(例如，avbsepharose(注冊商標(biāo))，由gehealthcareltd.制造，或肝素柱)、羥基磷灰石柱等實施。

在本發(fā)明方法中，無包膜病毒顆粒優(yōu)選地是腺伴隨病毒顆粒。

在本發(fā)明方法中，無包膜病毒顆粒的收率顯示為無包膜病毒的滴度等。無包膜病毒的滴度顯示為但不限于，在一定量的樣品中，(a)無包膜病毒的基因組的數(shù)目(基因組滴度)，(b)如試驗測定的無包膜病毒對細胞的感染能力（感染滴度)，或(c)所測定的構(gòu)成無包膜病毒的蛋白的純度。

用于測定上述(a)的方法的例子包括包含通過pcr測定樣品中病毒基因組的拷貝數(shù)的方法。對于基因組滴度的測定，應(yīng)用例如aavpro(注冊商標(biāo))滴定試劑盒(用于實時pcr)ver.2(由takarabioinc.制造)，并且基因組滴度可以通過所附使用說明書中描述的方法計算。

用于測定上述(b)的方法的例子包括包含用系列稀釋的無包膜病毒溶液感染合適的靶細胞和檢測細胞的形狀的變化(細胞變性)的方法、包含檢測轉(zhuǎn)基因的表達的方法、和包含測定引入細胞中的病毒基因組的拷貝數(shù)的方法。

用于測定上述(c)的方法的例子包括包含蛋白的sds-page分析的方法和包含通過免疫學(xué)技術(shù)定量測定蛋白的方法。

(2)用于本發(fā)明生產(chǎn)方法的試劑盒

本發(fā)明的試劑盒是用于實施上述部分(1)中描述的生產(chǎn)無包膜病毒顆粒的方法的試劑盒，并且包含：(1)降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)、和(2)酸性溶液。作為在酸性條件下沉淀的物質(zhì)，可以優(yōu)選地應(yīng)用降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)，如上述部分(1)"本發(fā)明無包膜病毒顆粒的生產(chǎn)方法"中解釋的。酸性溶液沒有特別限定，只要其能夠用于酸化樣品的ph的步驟，所述樣品中加入了降低在酸性條件下的蛋白的溶解度的物質(zhì)和/或在酸性條件下沉淀的物質(zhì)，如上述部分(1)"本發(fā)明無包膜病毒顆粒的生產(chǎn)方法"中解釋的。本發(fā)明的試劑盒可以進一步包括中和溶液。中和溶液優(yōu)選地是堿性溶液或ph緩沖液。堿性溶液的例子包括但不限于氫氧化鈉溶液和氫氧化鉀溶液。ph緩沖液的例子包括但不限于tris-hcl溶液。試劑盒可以進一步包含用于制備來自無包膜病毒生產(chǎn)細胞的提取物的試劑、包含提供對無包膜病毒的顆粒形成所必需的元件的核酸的質(zhì)粒、包含要包封在無包膜病毒的顆粒中的核酸的質(zhì)粒等。

根據(jù)本發(fā)明，除了生產(chǎn)無包膜病毒顆粒的方法，也提供用于該生產(chǎn)方法的試劑盒和通過該生產(chǎn)方法生產(chǎn)的無包膜病毒顆粒。通過應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)方法獲得的無包膜病毒顆粒可以用作用于藥物組合物的活性成分。該藥物組合物可以離體（exvivo）應(yīng)用于來自患者的細胞或直接施用給患者。

實施例

下文，通過實施例的方式對本發(fā)明進行更具體地解釋，本發(fā)明不限于這些實施例。

實施例1:通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸純化raav5

(1)用于raav的生產(chǎn)的細胞的接種

在包含10%fbs(由gibco制造)的dmem(由sigma-aldrichco.llc.制造)中，懸浮293t/17細胞。將懸浮液接種在組織培養(yǎng)處理的t225燒瓶(由corninginc.制造)中，然后，在5%(v/v)co2的co2培養(yǎng)箱中在37℃培養(yǎng)2天。

(2)用于raav5的生產(chǎn)的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

通過應(yīng)用磷酸鈣方法，用各25μg的含有編碼aav2rep蛋白和aav5cap蛋白的序列的prc5載體(由takarabioinc.制造)、含有編碼腺病毒衍生e2a、va和v4的序列的phelper載體(由takarabioinc.制造)、和含有用于在aav2基因組的兩個itrs之間的熒光蛋白zsgreen1的表達盒的paav-zsgreen1載體(由takarabioinc.制造)轉(zhuǎn)染由實施例1-(1)獲得的細胞。轉(zhuǎn)染后6小時，將培養(yǎng)基完全除去，并且將40ml/燒瓶的含有2%胎牛血清(fbs)的dmem加入燒瓶。將細胞在5%(v/v)co2的co2培養(yǎng)箱中在37℃培養(yǎng)2天。

(3)通過檸檬酸緩沖液處理的提取物的制備

向由實施例1-(2)獲得的燒瓶中，加入0.5ml的0.5medta(由wakopurechemicalindustries,ltd.制造)。將燒瓶在室溫靜置幾分鐘而剝離細胞。然后，收集含有細胞的培養(yǎng)溶液，在1,750×g在4℃離心10分鐘。然后，除去上清。將細胞團塊(pellet)懸浮在2ml檸檬酸緩沖液(38.1mm檸檬酸、74.8mm檸檬酸鈉、75mm氯化鈉、100mm氯化鎂、ph5)中，通過渦旋混合器混合15秒，在室溫靜置5分鐘，再次通過渦旋混合器混合15秒，然后在14,000×g在4℃離心10分鐘以收集上清。向上清中加入1/10量的2mtris-hcl(ph9.5)，并將由此獲得的溶液用作提取物。

(4)通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸的沉淀物的形成和除去

向由實施例1-(3)獲得的提取物中，加入1/100量的20u/μlcryonase(注冊商標(biāo))冷活化核酸酶(由takarabioinc.制造)(最終濃度:0.2u/μl)，然后在37℃反應(yīng)1小時。將反應(yīng)樣品分為5個等分試樣。向樣品1中僅加入1/10量的1m檸檬酸。向樣品2中僅加入1/10量的5%(v/v)脫氧膽酸鈉。向樣品3中加入1/10量的5%(v/v)脫氧膽酸鈉，并且在樣品于37℃靜置30分鐘后，進一步加入1/40量的1m檸檬酸。向樣品4中加入1/10量的5%(v/v)脫氧膽酸鈉，并且在樣品于37℃靜置30分鐘后，進一步加入1/20量的1m檸檬酸。向樣品5中加入1/10量的5%(v/v)脫氧膽酸鈉，并且在樣品于37℃靜置30分鐘后，進一步加入1/10量的1m檸檬酸。使每一樣品接受ph測量。結(jié)果示于表1中。

在所有樣品中，形成沉淀物。樣品在5,000×g于4℃離心5分鐘，并且收集上清以除去沉淀物。收集的上清用具有0.45μm孔徑的由pvdf制成的壓力驅(qū)動過濾裝置millex(注冊商標(biāo))(由merckmilliporecorp.制造，下文稱為0.45μm孔徑濾器)過濾以獲得濾液作為濃縮前raav5(樣品1-5)。

(5)濃縮前raav5的純度的確認(rèn)

將由實施例1-(3)獲得的提取物和由實施例1-(4)獲得的5種濃縮前raav5中的每一個與等量的5×樣品緩沖液(由takarabioinc.制造)混合并于95℃保持10分鐘。將每一混合物(4μl)應(yīng)用在4-12%聚丙烯酰胺凝膠上并電泳。在完成電泳后，將凝膠浸入合適量的oriole熒光凝膠染色溶液(由bio-radlaboratories,inc.制造)，并遮光振蕩90分鐘。振蕩后，將凝膠用luminoshot400(由takarabioinc.制造)攝影。結(jié)果示于圖1。在圖1中，泳道c顯示提取物，并且泳道1-5顯示濃縮前raav5(樣品1-5)。

圖1中見到的所有條帶是相應(yīng)于污染蛋白的條帶。由于濃縮前的階段raav5的濃度低，沒有檢測到相應(yīng)于raav5的條帶。如圖1中所見，與泳道c相比，泳道1和泳道2中所見的相應(yīng)于污染蛋白的條帶的數(shù)目低。這些結(jié)果顯示，通過向raav5和污染蛋白的混合物加入檸檬酸或加入脫氧膽酸鈉，污染蛋白可以沉淀和除去。如圖1中所見，與泳道1和2相比，泳道3-5中所見的相應(yīng)于污染蛋白的條帶的數(shù)目低。這些結(jié)果顯示，通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸的組合，污染蛋白可以更有效地沉淀和除去。此外發(fā)現(xiàn)，污染蛋白的除去效率取決于脫氧膽酸鈉和檸檬酸的加入量而變化。具體地，泳道4和泳道5中所見的相應(yīng)于污染蛋白的條帶的數(shù)目非常低。因此，當(dāng)以0.5%(v/v)的最終濃度加入脫氧膽酸鈉并且加入檸檬酸使得成為ph4至6時，污染蛋白被有效除去。

(6)濃縮前raav5的回收率的測定

測定由實施例1-(3)獲得的提取物和由實施例1-(4)獲得的5種濃縮前raav5的基因組滴度。對于基因組滴度的測定，應(yīng)用aavpro(注冊商標(biāo))滴定試劑盒(用于實時pcr)ver.2(由takarabioinc.制造)，并且按照試劑盒所附的說明書進行包括反應(yīng)溶液的制備等的操作?；谟纱双@得的基因組滴度的數(shù)據(jù)，通過下式計算總基因組滴度。

式：總基因組滴度(vg)=基因組滴度(vg/ml)×總流量(ml)

假設(shè)提取物的總基因組滴度是100，相對于提取物的總基因組滴度的值(回收率)示于圖2。在圖2中，縱軸顯示回收率(%)，并且在橫軸上，泳道c顯示提取物，并且泳道1-5顯示濃縮前raav5(樣品1-5)。

如圖2中所見，樣品1-5的回收率是99%至113%，其接近100%。這些結(jié)果顯示，當(dāng)通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸純化raav5時，raav5的回收率非常高。

圖1和圖2的結(jié)果顯示，通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸的raav5的純化是非常有效的純化方法。具體地，通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸，污染蛋白可以沉淀和除去。尤其發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以0.5%(v/v)的最終濃度加入脫氧膽酸鈉并且加入檸檬酸使得成為ph4至6時，raav5以高回收率純化。

實施例2:raav5的純化和濃縮

(1)脫氧膽酸鈉和檸檬酸的加入量的研究

以與實施例1-(1)至(3)相同的方式，制備提取物。向提取物中加入1/100量的20u/μlcryonase(注冊商標(biāo))冷活化核酸酶(由takarabioinc.)(最終濃度:0.2u/μl)，然后在37℃反應(yīng)1小時。將反應(yīng)樣品分為4個等分試樣。向樣品中加入1/10量或1/20量的5%(v/v)脫氧膽酸鈉，并且在樣品于37℃靜置30分鐘后，進一步加入1/20量或1/30量的1m檸檬酸。每一樣品接受ph測量。結(jié)果示于表2。

在所有樣品中，形成沉淀物。樣品在5,000×g在4℃離心5分鐘，并收集上清以除去沉淀物。用0.45μm孔徑濾器過濾收集的上清以獲得濾液作為濃縮前raav5。

(2)通過超濾膜的raav5的純化和濃縮

將由實施例2-(2)獲得的濃縮前raav5放在100kdak超濾膜(由merckmilliporecorp.制造)上，并在2,000×g在4℃離心10分鐘。棄去濾液。進一步，將"一系列操作(洗滌操作)，其中將10ml的d-pbs加在超濾膜上，懸浮和在上述條件下離心，并棄去濾液"重復(fù)5次以獲得最終的濃縮物作為純化raav5(樣品a-d)。通過這一系列的操作，具有低分子量的污染物質(zhì)被除去并且raav5被濃縮10倍。

(3)raav5的純度的確認(rèn)

以與實施例1-(5)相同的方式，確認(rèn)由實施例2-(2)獲得的純化raav5的純度。結(jié)果示于圖3。在圖3中，泳道m(xù)顯示蛋白分子量標(biāo)記(broad)(由takarabioinc.制造；從上面起200、116、97、66、44、29、20kda)，并且泳道a-d顯示純化raav5(樣品a-d)。

在圖3中，3個粗條帶是相應(yīng)于raav5的結(jié)構(gòu)蛋白(vp1、vp2、vp3)的條帶，并且其它條帶是相應(yīng)于污染蛋白的條帶。如從圖3所見，泳道a具有低數(shù)目的相應(yīng)于污染蛋白的條帶。這一結(jié)果顯示，通過除去加入脫氧膽酸鈉(最終濃度0.5%(v/v))和加入檸檬酸(ph5)而形成的沉淀物，然后實施用100kdak超濾膜的處理，可以純化和濃縮raav5。

實施例3:各種血清型(raav1、raav2、raav3、raav6)的raav的純化

(1)用于raav的生產(chǎn)的細胞的接種

以與實施例1-(1)相同的方式，接種用于raav的生產(chǎn)的細胞。

(2)用于raav的生產(chǎn)的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

以與實施例1-(2)相同的方式，用用于raav的生產(chǎn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染由實施例3-(1)獲得的細胞，除了根據(jù)要制備的raav的血清型，應(yīng)用prep-cap1aav輔助質(zhì)粒(由appliedviromics制造)、prc2-mi342載體(由takarabioinc.制造)、prep-cap3aav輔助質(zhì)粒(由appliedviromics制造)或prc6載體(由takarabioinc.制造)替代prc5載體。

(3)通過檸檬酸緩沖液處理的提取物的制備

以與實施例1-(3)相同的方式，制備每一血清型的raav的提取物。

(4)通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸的沉淀物的形成和除去

向由實施例3-(3)獲得的提取物，加入1/100量的20u/μlcryonase(注冊商標(biāo))冷活化核酸酶(由takarabioinc.制造)(最終濃度:0.2u/μl)，然后在37℃反應(yīng)1小時。然后，向每一樣品加入1/10量的5%(v/v)脫氧膽酸鈉。在樣品于37℃靜置30分鐘后，向每一樣品進一步加入1/20量的1m檸檬酸。每一樣品接受ph測量。作為結(jié)果，每一樣品具有ph4至6。

在所有樣品中，形成沉淀物。樣品在5,000×g在4℃離心5分鐘，并收集上清以除去沉淀物。用0.45μm孔徑濾器過濾收集的上清以獲得濾液作為濃縮前raav。

(5)通過超濾膜的raav的純化和濃縮

將由實施例3-(4)獲得的濃縮前raav放在100kdak超濾膜上，并在2,000×g在4℃離心5分鐘或更長時間。棄去濾液。進一步，將"一系列操作(洗滌操作)，其中將14ml的d-pbs加在超濾膜上，懸浮和在上述條件下離心，并棄去濾液"重復(fù)5次以獲得最終的濃縮物作為純化raav。通過這一系列的操作，具有低分子量的污染物質(zhì)被除去并且raav被濃縮3至5倍。

(6)raav的純度的確認(rèn)

以與實施例1-(5)相同的方式，確認(rèn)每一血清型的raav的提取物(泳道c)、濃縮前raav(泳道pre)和純化raav(泳道f)的純度。結(jié)果示于圖4。

在圖4中，泳道c和泳道pre中所見的所有條帶是相應(yīng)于污染蛋白的條帶。由于此階段的raav濃度低，沒有檢測到相應(yīng)于raav的條帶。與之相比，泳道f中所見的3個粗條帶是相應(yīng)于raav的結(jié)構(gòu)蛋白(vp1、vp2、vp3)的條帶。如從圖4所見的，關(guān)于每一血清型的raav，與泳道c相比，泳道pre具有低數(shù)目的相應(yīng)于污染蛋白的條帶。這一結(jié)果顯示，通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸，可以沉淀和除去污染蛋白，不管raav的血清型如何。此外，關(guān)于每一血清型的raav，泳道f在相應(yīng)于raav的結(jié)構(gòu)蛋白(vp1、vp2、vp3)的條帶之外幾乎沒有相應(yīng)于污染蛋白的條帶。這一結(jié)果顯示，通過用100kdak超濾膜處理，raav可以被濃縮并且具有低分子量的污染蛋白可以被除去，不管raav的血清型如何。

(7)raav的回收率的測定

以與實施例1-(6)相同的方式，測定每一血清型的raav的基因組滴度。計算每一步驟的raav的總基因組滴度。假設(shè)提取物的總基因組滴度是100，相對于提取物的總基因組滴度的值(回收率)示于表3。

如圖3中所見，濃縮前raav(pre)的回收率是89%至120%，其接近100%。這些結(jié)果顯示，當(dāng)通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸純化raav時，raav的回收率非常高，不管raav的血清型如何。

圖4和表3的結(jié)果顯示，通過加入脫氧膽酸鈉和加入檸檬酸的raav的純化是非常有效的純化方法，不管raav的血清型如何。具體地，通過以0.5%(v/v)的最終濃度加入脫氧膽酸鈉并且加入檸檬酸使得成為ph4至6，污染蛋白可以沉淀和除去。進一步發(fā)現(xiàn)，通過額外實施用100kdak超濾膜的處理，以更高純度獲得raav。

實施例4:通過加入聚乙二醇改善raav6的回收率

(1)濃縮前raav6的制備

以與實施例3-(1)至(4)相同的方式，制備濃縮前raav6。

(2)通過超濾膜的raav6的純化和濃縮(加入聚乙二醇)

將濃縮前raav6分為3個等分試樣。樣品1中不加入聚乙二醇。向樣品2加入聚乙二醇(peg)-6000(由sigma-aldrichco.llc.制造)溶液以成為0.4%(w/v)的最終濃度。向樣品3加入peg-600以成為0.8%(w/v)的最終濃度。將每一樣品放在100kdak超濾膜上，并在2,380×g在室溫離心10分鐘或更長時間。棄去濾液。進一步，將"一系列操作(洗滌操作)，其中將10至14ml的包含每一最終濃度的聚乙二醇的pbs加在超濾膜上，懸浮和在上述條件下離心，并棄去濾液"重復(fù)3次。僅樣品2和樣品3用pbs額外洗滌。獲得最終的濃縮物作為純化raav6。通過這一系列的操作，具有低分子量的污染物質(zhì)被除去并且raav6被濃縮6至12倍。

(3)raav6的回收率的測定

以與實施例1-(6)相同的方式，測定每一raav6的基因組滴度。計算每一步驟的每一raav6的總基因組滴度。假設(shè)提取物的總基因組滴度是100，相對于提取物的總基因組滴度的值(回收率)示于表4。

如表4所見，在應(yīng)用超濾膜純化和濃縮raav6時，通過加入聚乙二醇，raav6的回收率被改善。認(rèn)為在超濾時通過加入聚乙二醇，其它血清型的raav的回收率也可以被改善。

實施例5:各種酸性溶液的研究

(1)raav6的提取物的制備

以與實施例3-(1)至(3)相同的方式，制備raav6的提取物。

(2)通過加入脫氧膽酸鈉和加入各種酸性溶液的沉淀物的形成和除去

向由實施例5-(1)獲得的raav6提取物，加入1/100量的20u/μlcryonase(注冊商標(biāo))冷活化核酸酶(由takarabioinc.制造)(最終濃度:0.2u/μl)，然后在37℃反應(yīng)1小時。將一部分反應(yīng)樣品分為3個等分試樣。向每一樣品加入1/10量的5%(v/v)脫氧膽酸鈉，并在樣品于37℃靜置30分鐘后，加入1/20量的1m檸檬酸、1/20量的1m鹽酸或1/20量的1m乙酸。每一樣品通過ph測量證實為酸性。每一樣品的條件示于表5。

在所有樣品中，形成沉淀物。樣品在5,000×g在4℃離心5分鐘，并收集上清以除去沉淀物。用0.45μm孔徑濾器過濾收集的上清以獲得濾液作為濃縮前raav6。

(3)濃縮前raav6的純度和回收率的確定

以與實施例1-(5)相同的方式，確定濃縮前raav6的純度。作為結(jié)果，濃縮前raav6具有相等的純度，不管酸性溶液的種類如何。以與實施例1-(6)相同的方式，確定濃縮前raav6的基因組滴度并計算回收率。作為結(jié)果，濃縮前raav6具有相等的回收率，不管酸性溶液的種類如何。這些結(jié)果顯示，當(dāng)脫氧膽酸鈉和酸性溶液加入raav和污染蛋白的混合物時，通過加入任何種類的酸性溶液，污染蛋白可以被沉淀和除去。

實施例6:各種表面活性劑的研究

(1)raav2的提取物的制備

以與實施例3-(1)至(3)相同的方式，制備raav2的提取物。

(2)通過加入各種表面活性劑和加入檸檬酸的沉淀物的形成和除去

向由實施例6-(1)獲得的raav2提取物，加入1/100量的20u/μlcryonase(注冊商標(biāo))冷活化核酸酶(最終濃度:0.2u/μl)，然后在37℃反應(yīng)1小時。將一部分反應(yīng)樣品分為3個等分試樣。向每一樣品加入1/10量的5%(v/v)脫氧膽酸鈉、5%(v/v)鵝脫氧膽酸鈉或5%(v/v)膽酸鈉，并在樣品于37℃靜置30分鐘后，進一步加入1/20量的1m檸檬酸。每一樣品通過ph測量證實為酸性。每一樣品的條件示于表6。

在所有樣品中，形成沉淀物。樣品在5,000×g在4℃離心5分鐘，并收集上清以除去沉淀物。用0.45μm孔徑濾器過濾收集的上清以獲得濾液作為濃縮前raav2。

(3)通過超濾膜的raav2的純化和濃縮

將由實施例6-(2)獲得的濃縮前raav2放在100kdak超濾膜上，并在2,000×g在4℃離心5分鐘或更長時間。棄去濾液。進一步，將"一系列操作(洗滌操作)，其中將14ml的d-pbs加在超濾膜上，懸浮和在上述條件下離心，并棄去濾液"重復(fù)5次，以獲得最終的濃縮物作為純化raav2。通過這一系列的操作，具有低分子量的污染物質(zhì)被除去并且raav2被濃縮。

(4)raav2的純度的確定

以與實施例1-(5)相同的方式，確定raav2提取物(泳道c)、濃縮前raav2(泳道pre)和純化raav2(泳道f)的純度。結(jié)果示于圖5。

在圖5中，泳道c和泳道pre中所見的所有條帶是相應(yīng)于污染蛋白的條帶。由于此階段的raav2濃度低，沒有檢測到相應(yīng)于raav的條帶。與之相比，泳道f中所見的3個粗條帶是相應(yīng)于raav2的結(jié)構(gòu)蛋白(vp1、vp2、vp3)的條帶。如從圖5所見的，關(guān)于所有表面活性劑，與泳道c相比，泳道pre具有低數(shù)目的相應(yīng)于污染蛋白的條帶。這一結(jié)果顯示，通過加入表面活性劑和加入檸檬酸，可以沉淀和除去污染蛋白，不管表面活性劑的種類如何。

工業(yè)實用性

根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)無包膜病毒的方法，可以不經(jīng)辛苦操作得到具有高純度的無包膜病毒顆粒。通過本發(fā)明的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的無包膜病毒顆粒和包含該無包膜病毒顆粒作為活性成分的組合物在用于基因治療的基礎(chǔ)調(diào)查研究和臨床應(yīng)用領(lǐng)域中的基因轉(zhuǎn)移方法中是非常有用的。