專利名稱：滅活生物制品中病毒和去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滅活生物制品中病毒并可同時(shí)去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。屬生物制品病毒滅活領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
以生物體、生物臟器及血液的提取物為原料制成的藥品、食品、保健品等產(chǎn)品被稱為生物制品。生物體、生物臟器特別是血液中含有各種類傳染性病毒及細(xì)菌內(nèi)毒素，病毒主要有DNA和RNA兩大類，從病毒結(jié)構(gòu)有脂包膜病毒及非脂包膜病毒，具體病毒有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和細(xì)小病毒B19等等，種類繁多。為了確保生物制品使用的安全性，需要在生物制品生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)中間品或制成品進(jìn)行去除/滅活病毒和除細(xì)菌內(nèi)毒素的處理。
目前去除/滅活病毒主要有以下幾種方法1.巴斯德消毒法(巴氏消毒法)和干熱法(80℃加熱72小時(shí))，滅活效果較為肯定，但有時(shí)由于對(duì)一些細(xì)胞因子的生物活性影響較大而不能使用。
2.有機(jī)溶劑/去污劑(S/D)處理法，滅活病毒全過(guò)程要求嚴(yán)格，而且對(duì)非包膜病毒無(wú)效。
3.納米膜過(guò)濾法，只有膜孔徑比病毒有效直徑小才可使用，有很大的局限性，滅活病毒的效果易受多種因素影響，且必須與其它方法聯(lián)合使用。
4.低pH孵放法，此法可滅活幾種脂包膜病毒，但滅活效果難以控制。
以上的病毒滅活方法均不能同時(shí)適用于脂包膜病毒和非脂包膜病毒，效果不完全，因此難以一次滅活所有病毒，一般需幾種方法聯(lián)合使用。以上方法實(shí)施效果受許多因素的影響，穩(wěn)定性差，且不能同時(shí)去除熱原，無(wú)法兼顧內(nèi)毒素的去除。細(xì)菌內(nèi)毒素需另采用超濾法或?qū)游龇ǖ确椒ǔィ罢咧饕m用于小分子量的輸液藥品，如注射用水等；后者應(yīng)用范圍較廣，但設(shè)備昂貴，成本高，且每批處理量有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的滅活生物制品中病毒和去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，本方法對(duì)生物制品滅活病毒及去除內(nèi)毒素均有效，在滅活脂包膜病毒和非脂包膜病毒的同時(shí)，可一并去除細(xì)菌內(nèi)毒素，確保制品的安全性，保持制品的生物活性。
本發(fā)明方法按下步驟生物制品或中間品用NaOH溶液調(diào)pH達(dá)12.0±0.2，在25±1℃下至少靜置孵放1小時(shí)，然后以HCl溶液復(fù)調(diào)至制品所需pH值。
所說(shuō)的靜置孵放時(shí)間最好是1.5～2小時(shí)。
所說(shuō)的NaOH溶液濃度最好是3～5mol/L。
所說(shuō)的HCl溶液最好是2～4mol/L。
如上所述，本發(fā)明采用了堿處理加靜置孵放的滅活生物制品中病毒的方法，本法對(duì)所有的脂包膜病毒和非脂包膜病毒均有很好的滅活效果，而且本法在滅活病毒的同時(shí)，還可將細(xì)菌內(nèi)毒素一并去除，不但滅活了生物制品中的病毒，同時(shí)也去除細(xì)菌內(nèi)毒素，二者無(wú)需分步處理，是一個(gè)經(jīng)濟(jì)、有效的方法。操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，不會(huì)引入對(duì)人體有害的物質(zhì)，確保制品的安全性，保持制品的生物活性。本方法以分別甲肝病毒、鴨乙肝病毒、腎綜合癥出血熱病毒、及狂犬病毒、乙型腦炎病毒、腦心肌炎病毒及愛(ài)滋病毒等多種病毒為指示病毒進(jìn)行了大量試驗(yàn)，均取得了較好的滅活效果，并用鱉試法(TAL)和家兔檢測(cè)熱原均合格。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明方法滅活病毒的效果，各例試驗(yàn)用樣品人神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液中間品均由南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所提供。
用于試驗(yàn)的三批樣品質(zhì)量參數(shù)如下表

實(shí)施例1人神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液中間品偽狂犬病毒的滅活試驗(yàn)指示病毒偽狂犬病毒，加入滴度為8.00LgTCID50/ml培養(yǎng)用細(xì)胞PK-15細(xì)胞。
一.病毒滅活按下步驟三批樣品各取45ml，分別加入5ml偽狂犬病毒，同時(shí)加入內(nèi)毒素，濃度為4EU/ml，混勻，用4mol/L NaOH調(diào)至pH值12±0.1，等量分裝至5個(gè)離心管，8ml/管，密封，置孵箱25℃±1℃下孵育，分別于15、30、60、90、120分鐘取樣，立即加入3mol/L HCl將pH值調(diào)至中性。
經(jīng)以上處理后的樣品于4℃下離心(4000rpm)30分鐘，取上清過(guò)濾裝至小離心管，1.2ml/管，4管/取樣點(diǎn)，-70℃下凍存?zhèn)錂z測(cè)。
二.中性對(duì)照每批樣品用3mol/L HCl調(diào)pH至中性，每批取18ml，加入2ml偽狂犬病毒，混勻后加入40μl培養(yǎng)液，等量分裝至2個(gè)離心管，8ml/管；其中一管樣品密封，置孵箱25℃下孵育120分鐘后立即加入80μl培養(yǎng)液，4℃下離心(4000rpm)30分鐘，取上清分裝，-70℃下凍存?zhèn)錂z測(cè)。另一管樣品不經(jīng)孵育(即孵育時(shí)間為零)即加入80μl培養(yǎng)液，同樣在4℃下離心(4000rpm)30分鐘，取上清分裝，-70℃下凍存?zhèn)錂z測(cè)。
三.采用96孔細(xì)胞病變法進(jìn)行病毒滴定，按Karber法計(jì)算。驗(yàn)證結(jié)果如下；三批人神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液中間品經(jīng)本發(fā)明方法滅活后，殘余偽狂犬病毒滴度均低于本試驗(yàn)最低檢測(cè)限(0.50LgTCID50/0.1ml)，見表1。
表1本實(shí)施例經(jīng)堿性滅活病毒處理后的樣品與中性對(duì)照樣品的殘余偽狂犬病毒滴度值。

注本試驗(yàn)樣品中病毒最低檢測(cè)限為≤0.50LgTCID50/0.1ml。
三批樣品可滅活所加入指示病毒PRV分別為20030126批≥5.25LgTCID50/0.1ml，
20030214批≥5.38LgTCID50/0.1ml，20030222批≥5.38LgTCID50/0.1ml。
用鱉試劑法測(cè)樣品內(nèi)毒素為陰性，說(shuō)明本方法滅活病毒的同時(shí)能一并除去內(nèi)毒素。樣品各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均符合要求，說(shuō)明本滅活病毒的方法不會(huì)對(duì)生物制品的質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。
實(shí)施2人神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液中間品Sindbis病毒的滅活試驗(yàn)指示病毒Sindbis，滴度為7.34LgTCID50/ml。
培養(yǎng)用細(xì)胞BHK-21，滴定方法6孔盤蝕斑法。
病毒滅活按下步驟三批樣品各取20ml，用3mol/L HCl調(diào)至中性。
三批樣品各取45ml，加入Sindbis病毒5ml，用4mol/L NaOH調(diào)至pH值12±0.1，每批以8ml/管分裝為5個(gè)離心管，25℃±1℃下孵育，分別于15、30、60、90、120分鐘后取樣，立即加入80μl 3mol/LHCl將pH值調(diào)至中性。
以上滅活病毒后的樣品離心(4000rpm)30分鐘，0.22μm膜過(guò)濾，上清分裝至小離心管中，每批4管，-70℃下凍存?zhèn)錂z測(cè)。
采用BHK-21細(xì)胞蝕斑法，結(jié)晶紫染色，記錄蝕斑數(shù)，計(jì)算病毒殘余滴度及下降滴度見表2。
表2人神經(jīng)生長(zhǎng)因子不同孵育時(shí)間的Sindbis病毒滅活效果

注滴度單位為L(zhǎng)g PFU/ml從表2可見，25℃孵育時(shí)間為90分鐘及120分鐘的樣品，病毒被完全滅活。
實(shí)施例3人神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液中間品EMCV病毒的滅活試驗(yàn)指示病毒EMCV，滴度7.50LgTCID50/0.1ml。
培養(yǎng)用細(xì)胞Vero，滴定方法96孔微量病變法。
病毒滅活同實(shí)施例2(除加入的病毒Sindbis改為EMCV外，其余均與實(shí)施例2相同)。
病毒檢測(cè)方法采用Vero細(xì)胞96孔微量病變法。
病毒滴定結(jié)果表明三批人神經(jīng)生長(zhǎng)因子加入指示病毒EMCV，經(jīng)本發(fā)明方法滅活后病毒檢測(cè)結(jié)果如表3。
表3

注滴度單位為L(zhǎng)gTCID50/0.1ml。
由表3可見，本方法可滅活該病毒滴度為20030126批＞4.250LgTCID50/0.1ml；20030214批＞4.380LgTCID50/0.1ml；20030222批＞4.750LgTCID50/0.1ml。
權(quán)利要求
1.滅活生物制品中病毒和去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，其特征是將生物制品或中間品用NaOH溶液調(diào)pH達(dá)12.0±0.2，在25±1℃下靜置孵放至少1小時(shí)，然后以HCl溶液復(fù)調(diào)至制品所需pH值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的滅活生物制品中病毒和去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，其特征是靜置孵放時(shí)間是1.5～2小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的滅活生物制品中病毒和去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，其特征是所說(shuō)的NaOH溶液濃度是3～5mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的滅活生物制品中病毒和去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，其特征是所說(shuō)的HCl溶液是2～4mol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種滅活生物制品中病毒和去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，將生物制品或中間品用NaOH溶液調(diào)pH達(dá)12.0±0.2，在25±1℃下靜置孵放至少1小時(shí)，然后以HCl溶液復(fù)調(diào)至制品所需pH值。本法對(duì)所有的脂包膜病毒和非脂包膜病毒均有很好的滅活效果，而且在滅活病毒的同時(shí)，還可一并去除細(xì)菌內(nèi)毒素，操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，不會(huì)引入對(duì)人體有害的物質(zhì)，確保制品的安全性，保持制品的生物活性。本方法以分別甲肝病毒(HAV)、鴨乙肝病毒(DHBV)、腎綜合癥出血熱病毒(HFRsV、及狂犬病毒(PRV)、乙型腦炎病毒、腦心肌炎病毒及愛(ài)滋病毒等多種病毒為指示病毒進(jìn)行了大量試驗(yàn)，均取得了較好的滅活效果，并用鱉試劑法(TAL)和家兔檢測(cè)熱原均合格。
文檔編號(hào)C12N7/04GK1786157SQ20051009501
公開日2006年6月14日 申請(qǐng)日期2005年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月26日
發(fā)明者李法卿, 李素芹, 李越希 申請(qǐng)人:李法卿