專利名稱：利用病毒包膜導(dǎo)入生物分子的方法及其組合物和體系的制作方法
領(lǐng)域技術(shù)本發(fā)明涉及一種新的與直接施用生物分子相關(guān)的治療方法。更具體地，本發(fā)明涉及利用病毒包膜施用生物分子。本發(fā)明也涉及一種以有效的方式將生物分子輸送到腦部的方法。
背景技術(shù)：
為了基因功能分析、基因治療以及相似應(yīng)用的目的，已經(jīng)發(fā)展出許多種將基因?qū)氲脚囵B(yǎng)細(xì)胞或生物學(xué)組織中的病毒和非病毒方法(Mulligan，Science，260，926 to 932，1993；and Ledley，Human Gene Therapy，Vol.6，1129 to 1144，1995)。病毒方法是將基因輸送到細(xì)胞內(nèi)的最為有效的方法。然而，由于共導(dǎo)入來(lái)源于親代病毒的親代基因所必需的基因元件、病毒基因的表達(dá)、免疫原性等等，病毒載體可能有著一些問(wèn)題。另一方面，非病毒方法的脂質(zhì)體方法雖然有著比病毒方法更低水平的細(xì)胞毒性和免疫原性，但也比病毒載體有著將更低水平的將基因輸送到生物學(xué)組織中的效率。
日本血凝病毒(HVJ)首先被報(bào)道用于融合Ehrlich腫瘤細(xì)胞(Okada，Biken Journal，I，103-110，1958)，然后闡明了病毒與細(xì)胞膜融合的能力的機(jī)制(在此后稱作為“融合活性”)并且已經(jīng)研究了它作為基因?qū)胼d體的可能用途。已知HVJ具有高水平的免疫原性，以及當(dāng)生成大量的NP蛋白時(shí)能特異地誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)(Cole G.A.et al.，Journal ofImmunology，158，4301 to 4309，1997)。HVJ抑制宿主的蛋白合成也是可能的。為了避免這些問(wèn)題，已經(jīng)設(shè)計(jì)了一種技術(shù)，其中將包括基因或蛋白的脂質(zhì)體與已經(jīng)被紫外線照射滅活的HVJ融合，制備出融合顆粒(HVJ-脂質(zhì)體)。該技術(shù)使得將基因非侵入性地導(dǎo)入到培養(yǎng)細(xì)胞或有機(jī)體中成為可能(美國(guó)專利No.5,631,237；Dzau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，11421 to 11425，1996；and Kaneda et al.，Molecular Medicine Today，5，298to 303，1999)。然而，該技術(shù)要求制備兩種不同的顆粒，即脂質(zhì)體和病毒包膜，這使得該技術(shù)變得復(fù)雜化。脂質(zhì)體和HVJ的融合顆粒的缺點(diǎn)是平均直徑為HVJ的1.3倍以及融合活性是HVJ的十分之一。另外，對(duì)于常用的基于HVJ的載體，它們不能將基因?qū)氲揭恍┙M織中，或者如果可以，也只可能有著非常低的效率。
本發(fā)明者已經(jīng)提供了各種新的將基因或寡核苷酸導(dǎo)入到培養(yǎng)細(xì)胞或有機(jī)體中的滅活病毒包膜載體(WO01/57204)。具體地，通過(guò)將基因包裝進(jìn)各種包膜病毒(例如HVJ等)的包膜中，病毒的基因組已經(jīng)被預(yù)先滅活，可以將所得到的病毒用作為能簡(jiǎn)便且高效地將基因?qū)氲脚囵B(yǎng)細(xì)胞或生物學(xué)組織中的載體。這些病毒載體對(duì)細(xì)胞也具有很小的毒性。
本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)展了一種采用烷化劑工業(yè)級(jí)生產(chǎn)滅活病毒包膜的方法，這是一種廉價(jià)的、有效的方法并能獲得高質(zhì)量的產(chǎn)品。
盡管目前許多疾病都有了一些治療，但是腦部疾病或病變?nèi)允侵荒苷业胶苌俜椒ǖ念I(lǐng)域。因此，對(duì)這些治療和預(yù)防的需求每年都在增加。
在腦病中，腦動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化或Moyamoya病所造成的腦閉塞性疾病常引起腦的慢性低灌注。盡管粥樣病變不僅導(dǎo)致大腦缺血性事件，還導(dǎo)致神經(jīng)病理性改變包括癡呆(Kalaria RN，Bhatti SU，Lust WD，PerryG.，Ann N Y Acad Sci.1993；695190-3.；Kudo T.Takeda M，Tanimukai S，Nishimura T.，Stroke.1993；24259-64；discussion 265.；Kurumatani T.KudoT，Ikura Y，Takeda M.，Stroke.1998；291058-62.；and Sekhon LH，MorganMK，Spence I，Weber NC.，Stroke.1994；251022-7)，但是還沒(méi)有建立對(duì)低灌注的有效治療。
最近，臨床前研究已經(jīng)證實(shí)血管生成生長(zhǎng)因子例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)能刺激動(dòng)物腦缺血模型中的側(cè)支動(dòng)脈的發(fā)生(Harrigan MR，Ennis SR，Masada T，Keep RF.，Neurosurgery.2002；50589-98；Lyons MK，AndersonRE，Meyer FB.，Brain Res.1991；558315-20.；and Yoshimura S，et al.，Hypertension.2002；391028-34.)，一種被稱為治療性血管發(fā)生的概念。在重癥肢體缺血或心肌梗死的人患者中已經(jīng)報(bào)道利用血管生成因子的基因輸送的治療性血管發(fā)生的療效(Baumgartner I，et al.，Circulation.1998；971114-23.；Losordo DW，et al.，Circulation.1998；982800-4.；Symes JF，et al.，Ann Thorac Surg.1999；68830-6；discussion 836-7.；and RosengartTK，et al.，Circulation.1999；100468-74.)。因此，如果發(fā)展出能用于人體治療的安全且有效的基因輸送方法，那么可能的治療性血管發(fā)生對(duì)于腦缺血患者的治療應(yīng)當(dāng)是有可能的。從這個(gè)角度看，目前的基因輸送技術(shù)是不理想的。通過(guò)應(yīng)用各種包括腺伴隨病毒(AAV)(Fan D，et al.，NeurosciLett.1998；24861-4)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(Franceschini IA，et al.，J Neurosci Res.2001；65208-19)、腺病毒(Miyaguchi K，Maeda Y，Collin C，Sihag RK.，Brain Res Bull.2000；51195-202.)和單純皰疹病毒1(Johnson PA，YoshidaK，Gage FH，F(xiàn)riedmann T.，Brain Res Mol Brain Res.1992；1295-102.)的病毒載體可以實(shí)現(xiàn)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的基因輸送。這些載體體系對(duì)于人的基因治療有著優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。盡管這些方法對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的體內(nèi)基因輸送是有效的，但是對(duì)于人的基因治療還有無(wú)數(shù)的問(wèn)題例如安全性和產(chǎn)率需要解決。
為了解決這些問(wèn)題，我們已經(jīng)發(fā)展并使用HVJ(日本血凝病毒＝仙臺(tái)病毒)包膜載體，如上所述，它是一種新的非病毒載體體系。該載體體系的發(fā)展是依據(jù)于第一代的利用病毒包膜和脂質(zhì)體的基于HVJ的基因輸送(Yamada K，et al.，Am J Physiol.1996；271R1212-20；Kaneda Y，et al.，ExpCell Res.1987；17356-69.)(HVJ脂質(zhì)體方法)。對(duì)鼠和靈長(zhǎng)類的CNS的轉(zhuǎn)染，第一代HVJ載體具有很大的潛能(Yamada K.et al.ibid；Hagihara Y，et al.，Gene Ther.2000；7759-63.)。然而，它有著一些缺陷，如制備載體需要復(fù)雜的操作并且難以儲(chǔ)存。HVJ-包膜(HVJ-E)，一種新的非病毒的載體體系只用HVJ的包膜來(lái)輸送外來(lái)基因。
(本發(fā)明所解決的問(wèn)題)因此，本領(lǐng)域需要一種體外和體內(nèi)利用病毒包膜將生物分子有效地輸送(例如基因?qū)?到腦部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的方法。
此外，可以提高利用病毒包膜輸送生物分子的效率。因此，本領(lǐng)域需要發(fā)展一種利用病毒包膜的高效輸送生物分子的體系和方法。
本發(fā)明的目的是提供一種利用病毒包膜將生物分子有效地輸送到腦部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改進(jìn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
(解決問(wèn)題的方法)作為多個(gè)研究的結(jié)果，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)往病毒包膜體系中添加糖胺聚糖可以解決上述的問(wèn)題。
本發(fā)明者也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在阻斷腦部或頸部動(dòng)脈后通過(guò)使用病毒包膜體系，通過(guò)使用病毒包膜可以將生物分子有效地輸送到腦部。
因此，下面以各種實(shí)施方案的方式提供本發(fā)明。
(1)一種用于將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的體系，包括1)一種生物分子；2)一種病毒包膜；以及3)一種糖胺聚糖。
(2)第1項(xiàng)的體系，其中病毒包膜是滅活的。
(3)第1項(xiàng)的體系，其中糖胺聚糖是肝素。
(4)第1項(xiàng)的體系，其中糖胺聚糖的分子量至少是10,000kDa。
(5)第1項(xiàng)的體系，其中所包括的糖胺聚糖的濃度至少為50U/ml。
(6)第3項(xiàng)的體系，其中所述肝素的分子量為從12,000到15,000kDa。
(7)第3項(xiàng)的體系，其中所述肝素的硫酸化程度是藥用可接受的。
(8)第1項(xiàng)的體系，其中病毒包膜是一種RNA病毒的包膜。
(9)第1項(xiàng)的體系，其中病毒包膜是一種屬于副粘病毒(Paramixovirus)屬的病毒的包膜。
(10)第1項(xiàng)的體系，其中病毒包膜是HVJ的包膜。
(11)第1項(xiàng)的體系，其中生物分子選自由核酸、多肽、脂類、糖及其復(fù)合分子所構(gòu)成的組。
(12)第1項(xiàng)的體系，其中生物分子包括核酸。
(13)第1項(xiàng)的體系，其中生物分子包括多肽。
(14)第1項(xiàng)的體系，其中生物分子是一種編碼一種選自由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)所構(gòu)成的組的基因的核酸。
(15)第1項(xiàng)的體系，其中生物分子是一種選自由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)所構(gòu)成的組的多肽。
(16)第1項(xiàng)的體系，其中肝素、生物分子和病毒包膜被包含于同一組合物中。
(17)第1項(xiàng)的體系，其中肝素被包含于不同于包括生物分子和病毒包膜的組合物的另一組合物中。
(18)第1項(xiàng)的體系，其中生物分子被包含于病毒包膜中。
(19)一種將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法，其包括以下步驟
A)將一種包括病毒包膜和生物分子的組合物施用于細(xì)胞；B)將糖胺聚糖施用于細(xì)胞。
(20)第19項(xiàng)的方法，其中施用糖胺聚糖的步驟與施用組合物的步驟同時(shí)實(shí)施。
(21)第19項(xiàng)的方法，其中在施用組合物的步驟之前實(shí)施施用糖胺聚糖的步驟。
(22)第19項(xiàng)的方法，其中在施用組合物的步驟之后實(shí)施施用糖胺聚糖的步驟。
(23)糖胺聚糖在生產(chǎn)用于將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的藥物中的用途，其中藥物包括A)一種生物分子；B)一種病毒包膜；以及C)一種糖胺聚糖。
(24)一種將生物分子輸送到腦部的方法，其包括以下步驟A)短暫阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈；以及B)在阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈期間將生物分子導(dǎo)入到腦部。
(25)第24項(xiàng)的方法，其中生物分子選自由核酸、多肽、脂類、糖及其復(fù)合分子所構(gòu)成的組。
(26)第24項(xiàng)的方法，其中生物分子包括核酸。
(27)第24項(xiàng)的方法，其中生物分子是一種編碼一種選自由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)所構(gòu)成的組的基因的核酸。
(28)第26項(xiàng)的方法，其中通過(guò)載體輸送核酸。
(29)第24項(xiàng)的方法，其中用病毒包膜導(dǎo)入生物分子。
(30)第29項(xiàng)的方法，其中病毒包膜是滅活的。
(31)第29項(xiàng)的方法，其中病毒包膜是一種RNA病毒的包膜。
(32)第29項(xiàng)的方法，其中病毒包膜是一種屬于副粘病毒屬的病毒的包膜。
(33)第29項(xiàng)的方法，其中病毒包膜是一種HVJ的包膜。
(34)第24項(xiàng)的方法，其中用糖胺聚糖導(dǎo)入生物分子。
(35)第34項(xiàng)的方法，其中糖胺聚糖是肝素。
(36)第34項(xiàng)的方法，其中糖胺聚糖的分子量至少為10,000kDa。
(37)第34項(xiàng)的方法，其中所含的糖胺聚糖的濃度至少為50U/ml。
(38)第35項(xiàng)的方法，其中所述肝素的分子量為從12,000到15,000kDa。
(39)第35項(xiàng)的方法，其中所述肝素的硫酸化程度是藥用可接受的。
(40)第34項(xiàng)的方法，其中同時(shí)施用糖胺聚糖與生物分子。
(41)第34項(xiàng)的方法，其中在施用生物分子之前施用糖胺聚糖。
(42)第34項(xiàng)的方法，其中在施用生物分子之后施用糖胺聚糖。
(43)第24項(xiàng)的方法，其中頭部或頸部的動(dòng)脈被阻斷1分鐘到120分鐘。
(44)第24項(xiàng)的方法，其中頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈或頸動(dòng)脈。
(45)第24項(xiàng)的方法，其中頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈。
(46)第24項(xiàng)的方法，其中生物分子施用到頸動(dòng)脈、丘腦、腦室內(nèi)或鞘內(nèi)。
(47)第24項(xiàng)的方法，其中生物分子被施用到頸動(dòng)脈。
(48)一種將生物分子輸送到腦部的試劑盒，包括A)一種生物分子；以及B)一個(gè)說(shuō)明用于施用生物分子的方法的說(shuō)明書(shū)，其中方法包括a)短暫阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈；b)在阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈期間將生物分子施用到腦部。
(49)第48項(xiàng)的試劑盒，其中生物分子選自由核酸、多肽、脂類及其復(fù)合分子所構(gòu)成的組。
(50)第48項(xiàng)的試劑盒，其中生物分子包括核酸。
(51)第48項(xiàng)的試劑盒，其中生物分子是一種編碼一種由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)所構(gòu)成的組的基因的核酸。
(52)第48項(xiàng)的試劑盒，其中用載體輸送核酸。
(53)第48項(xiàng)的試劑盒，還包括一種病毒包膜。
(54)第53項(xiàng)的試劑盒，其中病毒包膜是滅活的。
(55)第53項(xiàng)的試劑盒，其中病毒包膜是一種RNA病毒的包膜。
(56)第53項(xiàng)的試劑盒，其中病毒包膜是一種屬于副粘病毒屬的病毒的包膜。
(57)第53項(xiàng)的試劑盒，其中病毒包膜是一種HVJ的包膜。
(58)第48項(xiàng)的試劑盒，還包括一種糖胺聚糖。
(59)第58項(xiàng)的試劑盒，其中糖胺聚糖是肝素。
(60)第58項(xiàng)的試劑盒，其中糖胺聚糖的分子量至少是10,000kDa。
(61)第58項(xiàng)的試劑盒，其中所含的糖胺聚糖的濃度至少是50U/ml。
(62)第59項(xiàng)的試劑盒，其中肝素的分子量為從12,000到15,000kDa。
(63)第59項(xiàng)的試劑盒，其中所述肝素的硫酸化程度是藥用可接受的。
(64)第58項(xiàng)的試劑盒，其中同時(shí)施用糖胺聚糖與生物分子。
(65)第58項(xiàng)的試劑盒，其中在施用生物分子之前施用糖胺聚糖。
(66)第58項(xiàng)的試劑盒，其中在施用生物分子之后施用糖胺聚糖。
(67)第48項(xiàng)的試劑盒，其中頭部或頸部的動(dòng)脈被阻斷1分鐘到120分鐘。
(68)第48項(xiàng)的試劑盒，其中頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈或頸動(dòng)脈。
(69)第48項(xiàng)的試劑盒，其中頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈。
(70)第48項(xiàng)的試劑盒，其中生物分子被施用到頸動(dòng)脈、丘腦、腦室內(nèi)或鞘內(nèi)。
(71)第48項(xiàng)的試劑盒，其中生物分子被施用到頸動(dòng)脈。
(72)一種生物分子在生產(chǎn)一種用于將該生物分子輸送到腦部的試劑盒的用途，該試劑盒包括A)該生物分子；以及B)一說(shuō)明用于施用生物分子的方法的說(shuō)明書(shū)，其中方法包括a)短暫阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈；以及b)在頭部或頸部的動(dòng)脈被阻斷期間，將該生物分子導(dǎo)入到腦部。
要知道本領(lǐng)域人員在閱讀和理解本說(shuō)明書(shū)后將清楚地認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和作用。


圖1.利用HVJ-E載體用Venus基因所轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的典型實(shí)例。Venus的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像(a、d、g)，MAP2(b)、NeuN(d)、GFAP(h)的免疫熒光染色以及拼接圖像(c、f、i)。絕大多數(shù)表達(dá)Venus的細(xì)胞是MAP2和NeuN免疫陽(yáng)性的(a-f)。試驗(yàn)至少被重復(fù)5次。
圖2.利用立體定向?qū)GFP質(zhì)粒體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移到腦部。一個(gè)激光掃描共聚焦顯微鏡圖像的熒光立體顯微鏡圖像。對(duì)丘腦的立體定向注射(a、b)顯示了在注射部位的限制性表達(dá)。對(duì)側(cè)腦室的立體定向注射(c、d)發(fā)現(xiàn)在脈絡(luò)叢和室管膜細(xì)胞的表達(dá)(e、f)。CP，脈絡(luò)叢；LV，側(cè)腦室；Str，紋狀體；Ep，室管膜細(xì)胞層。試驗(yàn)至少被重復(fù)5次。
圖3.通過(guò)經(jīng)小腦延髓池的注射將Venus質(zhì)粒體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移到腦部。OB，嗅球；FC，額皮質(zhì)；M，腦膜。試驗(yàn)至少被重復(fù)5次。
圖4.在短暫阻斷大腦中動(dòng)脈后經(jīng)頸動(dòng)脈的Venus基因轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的熒光。在左側(cè)短暫阻斷大腦中動(dòng)脈60分鐘的3天后的冠狀切面以及熒光立體顯微鏡圖像。含有Venus基因的HVJ-E載體在再灌注期間被輸入到左側(cè)頸動(dòng)脈。只在受損病灶上發(fā)現(xiàn)有基因表達(dá)，同時(shí)在完好半球內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)熒光。試驗(yàn)至少被重復(fù)5次。
圖5.在短暫阻斷大腦中動(dòng)脈后的基因轉(zhuǎn)移到頸動(dòng)脈后，受損半球和對(duì)側(cè)半球內(nèi)的螢光素酶活性。在左側(cè)短暫阻斷大腦中動(dòng)脈60分鐘的1天后測(cè)定螢光素酶活性。含有Venus基因的HVJ-E載體在再灌注期間被輸入到左側(cè)頸動(dòng)脈。每組n＝5。
圖6.肝素對(duì)螢光素酶活性的作用。在經(jīng)小腦延髓池轉(zhuǎn)染pGL3螢光素酶基因1天后測(cè)定螢光素酶活性。將濃度為0、10、50或100(U/ml)的肝素、濃度為10、50或100(U/ml)的低分子量肝素添加到載體中。**P＜0.01對(duì)0、10和100。每組n＝3。
具體實(shí)施方案下面將描述本發(fā)明。在本說(shuō)明書(shū)的全文中都要明白單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)內(nèi)容，除非文章中有明確的其它提示。也要明白名詞在此具有在本領(lǐng)域所常用的定義，除非另有說(shuō)明。
下面將描述在此所用的具體的名詞。
名詞“病毒”在此指的是傳染性的微小結(jié)構(gòu)，它具有作為它的基因組的DNA或RNA并只在被感染細(xì)胞內(nèi)增殖。病毒包括屬于一種選自由逆轉(zhuǎn)錄病毒科、披膜病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、本揚(yáng)病毒科、彈狀病毒科、痘病毒科、皰疹病毒科、桿狀病毒科以及肝DNA病毒科所構(gòu)成的組的一個(gè)病毒科的病毒。病毒在此可以優(yōu)選地是正粘病毒科的流感病毒或仙臺(tái)病毒。更優(yōu)選地，病毒在此是仙臺(tái)病毒。
名詞“仙臺(tái)病毒”或“日本血凝病毒(HVJ)”可互換使用，它指的是一種能與細(xì)胞融合的副粘病毒科的副粘病毒屬的病毒。M.Kuroya等首先報(bào)道了仙臺(tái)病毒(1953)。它的基因組是具有約15,500個(gè)堿基長(zhǎng)度的RNA的負(fù)鏈。仙臺(tái)病毒顆粒包括包膜，它的直徑為150nm到300nm(多態(tài)性)。仙臺(tái)病毒含有RNA聚合酶。病毒不能被加熱并能引起溶血以及幾乎所有類型紅細(xì)胞的凝集。病毒生長(zhǎng)在正發(fā)育的雞蛋的細(xì)胞漿內(nèi)和/或來(lái)源于各種動(dòng)物的腎臟的培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)既定的細(xì)胞被仙臺(tái)病毒感染時(shí)，可以發(fā)生持續(xù)的感染。病毒具有融合各種細(xì)胞的能力，因此被廣泛地用于異核體的形成、雜交細(xì)胞的制備等等。
名詞“(病毒或病毒的)包膜”在此指的是主要包括包圍核殼體的脂質(zhì)雙層的膜結(jié)構(gòu)，它存在于例如仙臺(tái)病毒等的特殊病毒中。常在從細(xì)胞內(nèi)出芽生成的成熟病毒中觀察到有包膜。包膜通常包括宿主來(lái)源的脂質(zhì)以及包括病毒基因編碼的突出蛋白的小的突出結(jié)構(gòu)。因此，當(dāng)將包膜作用為載體時(shí)，將它稱為“(病毒的)包膜載體”，在此，在適當(dāng)情況下，它可以與“病毒包膜”互換使用。
名詞“糖胺聚糖”在此指的是一種多糖，其中主要成分是氨基己糖。這樣的糖胺聚糖包括但不限于透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、肝素及其混合物。“氨基己糖”在此指的是一種己糖，其中一個(gè)羥基被氨基酸基團(tuán)所取代。通常如上述的分類糖胺聚糖，但是已經(jīng)報(bào)道有一些分子難以被明確地分類，例如一個(gè)分子的一部分具有硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)，以及另一部分具有硫酸皮膚素結(jié)構(gòu)等。除了透明質(zhì)酸是由鏈球菌(A群)合成并分泌的外，幾乎所有的糖胺聚糖是動(dòng)物細(xì)胞(主要是結(jié)締組織的細(xì)胞)所生成的蛋白多糖的側(cè)鏈成分，通過(guò)酶處理它的核心蛋白部分可以得到糖胺聚糖，或者對(duì)于其中糖胺聚糖是連接于蛋白的絲氨酸或蘇氨酸的酯類時(shí)可以通過(guò)堿法消化蛋白和糖胺聚糖的側(cè)鏈之間的連接得到糖胺聚糖。具有大分子量糖胺聚糖的陰離子結(jié)構(gòu)可被用于包括大量的水分子。糖胺聚糖在此包括葡糖胺聚糖和半乳糖胺聚糖。半乳糖胺聚糖指的是包括氨基半乳糖的半乳糖胺聚糖，并包括例如硫酸軟骨素、硫酸皮膚素等。葡糖胺聚糖指的是包括氨基葡糖的糖胺聚糖，并包括例如肝素、硫酸乙酰肝素等。
名詞“肝素”在此指的是一種主要由D-氨基葡糖和D-葡糖醛酸(例如，交互聚合的方式)所構(gòu)成的糖胺聚糖。硫酸根被結(jié)合于幾乎所有的氨基葡糖的2，6-氨基，以及它的6號(hào)位羥基和2號(hào)位糖醛酸。動(dòng)物的脂肪細(xì)胞合成肝素，它具有許多硫酸根和羧基，因此它是具有高分子量的帶負(fù)電荷的電解質(zhì)。它對(duì)血液凝固具有抑制活性。
名詞“硫酸化”在此指的是用硫酸基對(duì)取代基(例如，氨基、羥基等)的取代。硫酸化的程度是決定分子的帶電程度的重要因素，并且相信細(xì)胞膜強(qiáng)度的變化可以影響本發(fā)明的病毒包膜的輸送效率。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的硫酸化的程度是藥用可接受的。
名詞“生物分子”在此指的是與一種有機(jī)體相關(guān)的分子。“有機(jī)體(或“生物的”)”在此指的是生物學(xué)的有機(jī)體，包括但不限于動(dòng)物、植物、真菌、病毒等。生物分子包括一種從有機(jī)體中提取的分子，但并不受此限定。生物分子可以是任何能影響有機(jī)體的分子。因此，生物分子也包括例如通過(guò)組合化學(xué)所合成的分子，以及能用作為藥物的低分子量分子(例如低分子量配體等)，只要它們能影響有機(jī)體。這樣的生物分子的實(shí)例包括，但不限于蛋白、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸(例如包括DNA(例如cDNA和基因組DNA)和RNA(例如mRNA))多糖、寡糖、脂類、低分子量分子(例如激素、配體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物、低分子量有機(jī)分子等)、以及它們的復(fù)合分子等。生物分子也包括細(xì)胞本身、以及組織的一部分或整個(gè)組織等，只要它們能與本發(fā)明的底物結(jié)合。優(yōu)選地，生物分子包括核酸或蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物分子是核酸(例如基因組DNA或cNDA，或用PCT等所合成的DNA)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物分子可以是蛋白。
名詞“生物學(xué)活性”在此指的是特定因子(例如病毒、多核苷酸或多肽)在有機(jī)體內(nèi)所具有的活性，包括表現(xiàn)出各種功能的活性。例如，當(dāng)特定因子是轉(zhuǎn)錄因子時(shí)，它的生物學(xué)活性包括調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的活性。當(dāng)特定因子是病毒時(shí)，它的生物學(xué)活性包括感染活性。作為另一個(gè)實(shí)例，當(dāng)特定因子是配體時(shí)，它的生物學(xué)活性包括與配體所相對(duì)應(yīng)的受體結(jié)合。這些生物學(xué)活性可以被“滅活”。
名詞“滅活”在此與病毒(例如仙臺(tái)病毒等)相關(guān)，說(shuō)明病毒的基因組被滅活。被滅活的病毒不能復(fù)制。用在此所描述的方法例如烷基化等能實(shí)現(xiàn)滅活。這樣的用于滅活的方法包括但不限于一種包括以下步驟的方法(a)用烷化劑滅活病毒(例如HVJ等)；(b)得到病毒或滅活病毒的濃縮溶液；以及(c)用柱層析法純化病毒或滅活病毒，然后超濾，以及一種包括相同的步驟但它們的次序可以被重排的方法。
名詞“烷基化”在此指的是一種用烷基取代有機(jī)化合物的氫原子的作用。名詞“烷化劑”指的是提供烷基的化合物。烷化劑的實(shí)例包括，但不限于有機(jī)金屬化合物，例如烷基鹵、二烴基、磺酸烴基、烷基鉛等。優(yōu)選的烷化劑的實(shí)例包括，但不限于β-丙酸內(nèi)酯、丁內(nèi)酯、碘甲烷、碘乙烷、碘丙烷、溴甲烷、溴乙烷、溴丙烷、二甲基硫酸、二乙基硫酸等。
“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在此可替換地用于指包括一系列核苷酸的大分子(聚合物)，除非另有說(shuō)明。核苷酸指的是其堿基為磷酸酯的核苷。核苷酸的堿基為嘧啶或嘌呤堿基(嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸)。多核苷酸包括DNA或RNA。
“核苷酸”在此指的是任何天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸?！把苌塑账帷敝傅氖遣煌谔烊淮嬖诘暮塑账岬哂信c它的最初的天然存在形式相似功能的核苷酸。這些衍生核苷酸在本領(lǐng)域是熟知的。
名詞“片段”在此與核酸相關(guān)，指的是其長(zhǎng)度比參照核苷酸分子的全長(zhǎng)短但足以作為本發(fā)明的試劑的多核苷酸。因此，名詞“片段”指的是對(duì)應(yīng)于參照多核苷酸(n長(zhǎng)度)的全長(zhǎng)所具有的序列長(zhǎng)度為從1到n-1的多核苷酸。根據(jù)目的可以適當(dāng)?shù)馗淖兤蔚拈L(zhǎng)度。例如，片段長(zhǎng)度的下限包括5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100或更多核苷酸。在此沒(méi)有被指定的整數(shù)所代表的長(zhǎng)度(例如11等)也可以作為下限。用Altschul等(J.Mol.Biol.，215，403-410(1990))所發(fā)展的算法通過(guò)搜索程序BLAST所測(cè)定出的積分可以表示同源性。
名詞“蛋白”、“多肽”和“肽”在此可交替用于表示包括一系列氨基酸的大分子。名詞“氨基酸”指的是具有與碳原子結(jié)合的羧基和氨基的有機(jī)分子。優(yōu)選地，氨基酸在此包括，但不限定于20種天然存在的氨基酸。
名詞“基因”在此指的是定義遺傳特異性的元件?；蛲ǔＲ越o定的次序排列于染色體上。定義蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的基因被稱為結(jié)構(gòu)基因。調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因被稱為調(diào)節(jié)基因。名詞“基因”在此可以指“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”以及“蛋白”、“多肽”、“寡肽”和“肽”。
名詞“外來(lái)基因”在此指的是導(dǎo)入載體中所包含的來(lái)源于非病毒序列來(lái)源的核酸序列。在發(fā)明的一個(gè)方面，外來(lái)基因被可操縱地連接到適當(dāng)?shù)男蛄?例如，轉(zhuǎn)錄所必需的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子和聚A信號(hào)、以及轉(zhuǎn)譯所必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子和終止密碼子等)上以表達(dá)通過(guò)基因?qū)胼d體所導(dǎo)入的基因。在另一個(gè)方面，外來(lái)基因不包括用于表達(dá)外來(lái)基因的調(diào)節(jié)序列。在另一方面，外來(lái)基因是寡核苷酸或誘餌核酸。
名詞“基因庫(kù)”在此指的是核酸庫(kù)，包括天然分離的核酸序列、或合成的核酸序列。天然分離的核酸的來(lái)源包括，但不限于來(lái)自真核細(xì)胞、原核細(xì)胞或病毒的基因組序列或cDNA序列。在本發(fā)明的基因庫(kù)的定義中也包括其中任意序列(例如信號(hào)、標(biāo)記序列等)被添加到天然分離序列中的文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因庫(kù)包括有助于核酸的轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)譯的序列例如啟動(dòng)子等。
名詞“篩選”在此指的是從例如基因庫(kù)的文庫(kù)中選擇或檢測(cè)出具有所需活性或功能的成員。這樣的篩選方法在本領(lǐng)域是已知的。
名詞“基因?qū)搿痹诖酥傅氖求w內(nèi)或體外將所需的、天然的、合成的或重組的基因或基因片段以保持導(dǎo)入基因的功能的方式導(dǎo)入到靶細(xì)胞內(nèi)。在本發(fā)明中所導(dǎo)入的基因或基因片段包括具有特異序列的DNA、RNA、或它們的合成的同類物。另外，基因?qū)朐诖丝梢耘c名詞“轉(zhuǎn)染”和“轉(zhuǎn)染”替換使用。
“基因?qū)牖钚浴痹诖酥傅氖禽d體的“基因?qū)搿钡幕钚?，通過(guò)所導(dǎo)入基因的功能(例如當(dāng)使用表達(dá)載體時(shí)，其所編碼的蛋白的表達(dá)和/或活性)可以測(cè)定出該活性。
名詞多核苷酸、多肽等的“表達(dá)”在此表示通過(guò)預(yù)定的作用實(shí)現(xiàn)將基因等轉(zhuǎn)化為另一種形式。優(yōu)選地，名詞“表達(dá)”表示基因、多核苷酸等被轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯成多肽。另外，經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成mRNA可以是“表達(dá)”的另一個(gè)方面。更優(yōu)選地，這樣的多肽可以具有經(jīng)轉(zhuǎn)譯后處理所修飾的一種形式。與基因表達(dá)相關(guān)的名詞“調(diào)節(jié)”在此指的是，但不限定于基因表達(dá)的增強(qiáng)、減弱、誘導(dǎo)、消除、減速、加速等。
被處理的基因的實(shí)例包括，但不限定于編碼酶、激素、淋巴因子、受體、生長(zhǎng)因子、調(diào)節(jié)蛋白、影響免疫系統(tǒng)的多肽、免疫調(diào)節(jié)因子、抗體等的基因。具體地，這些基因包括但不限于編碼人生長(zhǎng)激素、胰島素、白介素-2、腫瘤壞死因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、上皮生長(zhǎng)因子、組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)、因子VIIIC、降鈣素、胸苷肌酶、干擾素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等的基因。在本發(fā)明的藥物中，這些基因可以以核酸或多肽的形式存在。
當(dāng)指向?yàn)榛驎r(shí)，名詞“載體”在此指的是能將相關(guān)的多核苷酸序列轉(zhuǎn)移到相關(guān)細(xì)胞內(nèi)的載體。這樣的載體的實(shí)例包括一種能在例如單個(gè)動(dòng)物的宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的載體、或在合適的位點(diǎn)具有用于轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的多核苷酸的啟動(dòng)子的載體，該載體能結(jié)合于宿主的染色體內(nèi)。載體在此可以是質(zhì)粒。
名詞“表達(dá)載體”在此指的是一種核酸序列，其中結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的啟動(dòng)子、以及各種調(diào)節(jié)元件被可操縱地連接于宿主細(xì)胞內(nèi)。這樣的調(diào)節(jié)元件優(yōu)選地可以包括終止子、選擇標(biāo)記物例如耐藥基因、以及增強(qiáng)子。本領(lǐng)域人員熟知，例如動(dòng)物的有機(jī)體的表達(dá)載體的類型以及調(diào)節(jié)元件的種屬根據(jù)其在此所用的宿主細(xì)胞或有機(jī)體可以不同。對(duì)人而言，本發(fā)明所用的表達(dá)載體可以包括pCAGGS(Niwa H.et al.，Gene；108193-9(1991))。
名詞“重組載體”在此指的是能將相關(guān)的多核苷酸序列轉(zhuǎn)移到相關(guān)細(xì)胞內(nèi)的載體。這樣的載體的實(shí)例包括一種能自主復(fù)制或能結(jié)合到例如個(gè)體動(dòng)物的宿主細(xì)胞內(nèi)的染色體內(nèi)并在適合的位點(diǎn)具有用于轉(zhuǎn)錄本發(fā)明的多核苷酸的啟動(dòng)子的載體。
動(dòng)物細(xì)胞的“重組載體”的實(shí)例包括但不限于pcDNAI/Amp、pcDNAI、pCDM8(所有的都可從Funakoshi中購(gòu)得)、pAGE107[Japanese Laid-OpenPublication No.3-229，79，Cytotechnology，3，133(1990)]、pREP4(Invitrogen)、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]、pAMo、pAMoA[J.Biol.Chem.，268，22782-22787(1993)]、pCAGGS(Niwa，H.，et al.，Gene；108，193-199(1991)，等等。
名詞“終止子”在此指的是定位于基因的蛋白編碼區(qū)的下游的序列，當(dāng)DNA被轉(zhuǎn)錄為mRNA時(shí)，該序列參與了聚A序列的添加以及轉(zhuǎn)錄的終止。已知終止子促進(jìn)了mRNA的穩(wěn)定性并影響基因表達(dá)的量。終止子包括，但不限于哺乳動(dòng)物的終止子、以及CaMV35S終止子、膽脂堿合酶基因終止子(Tnos)、煙草PR1a基因終止子等。
名詞“啟動(dòng)子”在此指的是決定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基序列，它是一種定位于直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄頻率的DNA內(nèi)的區(qū)域。通過(guò)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。因此，具有啟動(dòng)子功能的基因的一部分在此指的是“啟動(dòng)子基序”。啟動(dòng)子區(qū)域一般都定位于推定的蛋白編碼區(qū)的第一個(gè)外顯子的約2kbp上游。因此，通過(guò)利用DNA分析軟件推測(cè)基因組堿基序列內(nèi)的蛋白編碼區(qū)估測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域是有可能的。所推定的啟動(dòng)子區(qū)域常定位于結(jié)構(gòu)基因的上游，但這依賴于結(jié)構(gòu)基因，所推定的啟動(dòng)子區(qū)有可能定位于結(jié)構(gòu)基因的下游。優(yōu)選地，所推定的啟動(dòng)子區(qū)域是定位于第一個(gè)外顯子的轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)的2kbp上游。
當(dāng)指向?yàn)榛虻谋磉_(dá)時(shí)，名詞“位點(diǎn)特異性”在此常指的是基因表達(dá)在有機(jī)體(例如動(dòng)物)的部位(例如可以是動(dòng)物的心臟、心肌細(xì)胞等)內(nèi)的特異性。名詞“時(shí)間特異性”指的是基因表達(dá)的特異性依賴于有機(jī)體的特異階段(例如，在中風(fēng)的時(shí)候等等)。
在此用作為藥物的疫苗的實(shí)例包括，但不限于腫瘤、獲得性免疫缺陷綜合征、麻疹、單純皰疹等的疫苗。在本發(fā)明的藥物中，這些疫苗可以以核酸或肽的形式存在。
本發(fā)明提供了一種包括單個(gè)上述的包膜或聯(lián)合有一種穩(wěn)定化合物、稀釋劑、攜帶劑或其它的成分和藥用試劑的藥用組合物或藥物。優(yōu)選地，本發(fā)明可以是疫苗的形式或是適合用于基因治療的其它形式。
所用的本發(fā)明的藥用組合物和藥物可以是能容許其包膜進(jìn)入到感染位點(diǎn)的細(xì)胞或相關(guān)組織的細(xì)胞內(nèi)的形式。
可以用任何無(wú)菌的生物兼容的藥用載體施用本發(fā)明的藥用組合物和藥物，載體包括但不限于生理鹽水、緩沖生理鹽水、葡萄糖和水等。在藥用的組合物內(nèi)，與合適的賦形劑、佐劑和/或藥用可接受的載體混和的這些分子的任何一種分子都可以被單獨(dú)地或與其它的藥用試劑聯(lián)合地施用于患者。在本發(fā)明的特定的實(shí)施方案中，藥用可接受的載體是無(wú)藥用活性的。
口服或腸外施用本發(fā)明的藥用組合物和藥物。腸外給藥方法的實(shí)例包括，但不限定于局部給藥、動(dòng)脈內(nèi)(例如經(jīng)頸動(dòng)脈或等等)、肌肉內(nèi)、皮下、髓內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、腦室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)和鼻內(nèi)給藥等等。在本發(fā)明中，可以使用任何一種可以給藥到治療部位的途徑。
名詞“頭部”在此指的是身體的一部分，包括顱骨、它的內(nèi)容物和相關(guān)結(jié)構(gòu)。名詞“頭部”在此包括腦部。
名詞“頸部”在此指的是頭部和上肢之間的區(qū)域。頭頸(頭和頸)部或顱頸部在此可以指頸及其上的部位。
名詞“短暫地”在此指的是當(dāng)進(jìn)行治療時(shí)，這樣的治療持續(xù)一段特定的時(shí)間。因此，在治療停止后，治療的作用將消失或減弱。
名詞“動(dòng)脈”在此指的是將血液從心臟輸送到身體的每個(gè)部位的血管。因此，名詞“腦動(dòng)脈”指的是存在于腦部的動(dòng)脈。
名詞“阻斷”動(dòng)脈或血管在此指的是處理同一個(gè)血管使得血流比未進(jìn)行處理時(shí)明顯減少或終止。優(yōu)選地，當(dāng)進(jìn)行阻斷時(shí)不引起出血是優(yōu)選的。阻斷動(dòng)脈或血管的方法包括，但不限于球囊導(dǎo)管、夾子等等。
將生物分子“導(dǎo)入”一個(gè)位置(例如“細(xì)胞內(nèi)(細(xì)胞內(nèi)地)”)指的是將這樣的生物分子從不同的位置轉(zhuǎn)移到相關(guān)的位置?？梢杂萌魏畏椒ㄟM(jìn)行這樣的導(dǎo)入，它可以是主動(dòng)導(dǎo)入或被動(dòng)導(dǎo)入。
名詞“體系”在此指的是由多種成分構(gòu)成的產(chǎn)品，包括藥物、農(nóng)藥、組合物(例如藥用組合物)、疫苗或試劑盒等。
為了制備賦形劑或可藥用組合物，除了包膜以外這些藥用組合物和藥用試劑還可以包括含有促進(jìn)包膜加工的其它化合物的可藥用載體。例如在最新版的日本藥典和它的最新附錄、最新版的“REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES”(Maack Publishing Co.，Easton，PA)等中描述了處方和給藥的更多細(xì)節(jié)。
用本領(lǐng)域所熟知的可藥用載體可以制備出以適合于給藥的形式用于口服給藥的藥用組合物。這些載體可以被制備為片劑、丸劑、糖包被制劑、膠囊、液體、膠、糖漿、膏劑、混懸液等等，通過(guò)這些載體患者適合于服用藥物組合物。
可以用以下的方法獲得用于口服的藥用組合物活性化合物與固體賦形劑混和，如需要將所得到的化合物粉末化，如需要再添加適當(dāng)?shù)幕衔镆垣@得片劑或糖包被制劑的核，加工顆?；幕旌衔?。合適的賦形劑可以是糖或蛋白充填劑，包括但不限于下面的包括乳糖、蔗糖、甘露糖或山梨糖醇的糖；玉米、小麥、大米、馬鈴薯或其它植物來(lái)源的淀粉；纖維素例如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、或羧甲基纖維素鈉；和包括阿拉伯膠和西黃蓍膠的膠；和蛋白例如明膠和膠原。如需要可以使用崩解劑或增溶劑例如交互連接的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或它的鹽(例如海藻酸鈉)。
給糖包被制劑的核提供一種合適的涂層，例如濃縮糖溶液。糖包被制劑的核也可以包含阿拉伯膠、滑石粉、聚丙烯吡咯烷酮、Carbopolygel、聚乙二醇、和/或二氧化鈦、漆溶液、以及合適的有機(jī)溶劑或混和的溶劑溶液。為了鑒定產(chǎn)物，或表示活性成分的量(即劑量)，可以將染料或色素加入到片劑或糖包被制劑中。
可以口服服用的藥用組合物可以包括例如由膠囊、明膠和涂層(例如甘油或山梨糖醇)構(gòu)成的軟的密封膠囊。膠囊可以含有與填充劑或結(jié)合劑例如乳糖或淀粉、潤(rùn)滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂、以及任意一種穩(wěn)定劑混和的活性成分。在軟膠囊中，可以將誘餌化合物溶解或懸浮于一種合適的溶液中，例如脂肪酸、液體石蠟、或液體聚乙二醇，有或無(wú)穩(wěn)定劑。
腸外給藥的藥用組合物包括活性化合物的水溶液。對(duì)于注射的目的，制備水溶液的本發(fā)明的藥用組合物，優(yōu)選地是Hank溶液、林格溶液或生理適合的緩沖液例如緩沖生理鹽水。用于注射的水混懸液可以包括用于增加混懸液的粘度的物質(zhì)(例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇、或葡聚糖)。另外，可以將活性化合物的混懸液制備為適合的油性混懸液。適合的親脂溶劑或載體包括脂肪酸例如麻油、合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體?；鞈乙嚎梢园ㄈ菰S高濃度溶液產(chǎn)品的穩(wěn)定劑，或如需要可以包括用于增加化合物的溶解度的合適的藥用試劑或反應(yīng)物。
用一種與本領(lǐng)域已知方法(例如常規(guī)的混和、分解、顆?；⑻前恢苿┑闹苽?、淘洗、乳化、包囊化、包裹或冷凍干燥)相似的方法生產(chǎn)本發(fā)明的藥用組合物。
本發(fā)明的藥用組合物包括含有有效量的能實(shí)現(xiàn)誘餌化合物的預(yù)定目的的本發(fā)明的包膜的組合物?！爸委熡行Я俊焙汀八幱糜行Я俊笔潜绢I(lǐng)域人員熟知的名詞，它們指的是能有效地生成預(yù)定的藥用療效的藥用試劑的量。因此，治療有效量是能有效地減少被治療疾病的表現(xiàn)的量。用于確定預(yù)定應(yīng)用的有效量的有用的檢測(cè)法是測(cè)定靶疾病的恢復(fù)程度。實(shí)際給藥的量依賴于被治療的個(gè)人。量被優(yōu)選地最佳化為能實(shí)現(xiàn)所需的療效且沒(méi)有明顯的副作用。本領(lǐng)域人員有能力確定出治療有效劑量。
首先或利用細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)或利用任何適合的動(dòng)物模型可以估測(cè)出任何化合物的治療有效劑量。用動(dòng)物模型得到所需的濃度范圍以及給藥途徑。此后，可用這些信息確定出施用于人體的劑量及可用途徑。
與包膜相關(guān)的名詞“治療有效量”指的是能消除疾病的癥狀或病變的量。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)的藥用方法(例如，ED50，對(duì)50％種群治療有效的劑量；以及LD50，對(duì)50％種群致死的劑量)可以測(cè)定出包膜的治療療效和毒性。治療療效和毒性作用之間的劑量比是治療指數(shù)，可以表示為ED50/LD50比。具有高治療指數(shù)的藥用組合物是優(yōu)選的?？梢杂脧募?xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)和動(dòng)物研究中所獲得的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)出用于人體的劑量范圍。這些化合物的劑量?jī)?yōu)選地在包括ED50但只有很少或無(wú)毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。在這個(gè)范圍內(nèi)，這樣的劑量可以不同，依賴于所采用的劑量、患者的敏感性以及給藥途徑。舉例，所適當(dāng)選擇的包膜劑量依賴于患者的年齡和其它條件、疾病的類型、所采用的包膜類型等等。
當(dāng)本發(fā)明的包膜載體被施用于人時(shí)，每人可以施用從400HAU到400,000HAU包膜載體，優(yōu)選的是從1,200HAU到120,000HAU，以及更優(yōu)選的是從4,000HAU到40,00HAU。所施用的包膜中所含的外來(lái)基因的量可以是每人從2μg到2,000μg，優(yōu)選的是每人從6μg到600μg，以及更優(yōu)選的從20μg到200μg。
名詞“HAU”在此指的是能凝集0.5％雞紅細(xì)胞的病毒活性的量。1HAU對(duì)應(yīng)為24,000,000病毒顆粒(Okada Y.et al.，Biken Journal，4，209-213，1961)。例如可以每天一次到每天數(shù)次施用上述的量。
每個(gè)醫(yī)師根據(jù)被治療的患者可以選擇確切的劑量。調(diào)整劑量和給藥以提供有效水平的活性或保持所需的作用。還要考慮的其它因素包括疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性(例如，腫瘤的大小和位置；患者的年齡、體重和性別；飲食調(diào)整；給藥的持續(xù)時(shí)間和頻率；藥物的組合；反應(yīng)敏感性；以及對(duì)治療的耐受/反應(yīng))。根據(jù)特殊劑型的半衰期和它的清除率，可以每3到4天、每周或每周兩次施用持續(xù)釋放的藥用組合物。在本領(lǐng)域已知的文獻(xiàn)中提供了特殊劑量和轉(zhuǎn)移方式的指南。
本發(fā)明也可以包括作為組合物和藥物的生物兼容材料。生物兼容材料可以包括至少一種從由硅氧烷、膠原、明膠、乙醇酸/乳酸共聚物、乙烯/乙烯乙酸酯共聚物、聚氨酯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯構(gòu)成的組的材料。硅氧烷是優(yōu)選的，因?yàn)樗菀壮尚?。生物可降解大分子的?shí)例包括，但不限定于聚合物、共聚物或它們的混合物，它們可以由至少一種選自由膠原、明膠、α-羥基羧酸(例如，羥基乙酸、乳酸、羥丁酸等)、羥基二羧酸(例如，蘋(píng)果酸等)、羥基三羧酸(例如，檸檬酸等)、多酸酐(例如，聚-α-氰基丙烯酸酯)、聚氨基酸(例如，聚-γ-芐基-L-谷氨酸等)、基于馬來(lái)酸酐的共聚物(例如，苯乙烯/馬來(lái)酸共聚物等)等等所構(gòu)成的組的物質(zhì)的非催化水合作用合成。聚合的方式可以是任何的隨機(jī)的、嵌段和接枝聚合。當(dāng)α-羥基羧酸、羥基二羧酸、或羥基三羧酸在分子內(nèi)具有任意的活性中心時(shí)，可以使用任何D-異構(gòu)體、L-異構(gòu)體、以及DL-異構(gòu)體。優(yōu)選地，可以使用羥基乙酸/乳酸共聚物。
可以提供持續(xù)釋放形式的本發(fā)明的組合物和藥物。本發(fā)明可以使用任何的持續(xù)釋放的劑量形式。持續(xù)釋放的劑量形式的實(shí)例包括，但不限定于桿狀劑型(例如，丸狀、圓柱狀、針頭狀劑型等)、片劑劑型、盤(pán)狀劑型、球狀劑型、板狀劑型等等。制備持續(xù)釋放劑量形式的方法在本領(lǐng)域是熟知的，例如在日本藥典、美國(guó)藥典、和其它國(guó)家的藥典等所描述的一樣。用于生產(chǎn)持續(xù)釋放藥物的方法的實(shí)例包括，但不限定于利用從復(fù)合物中崩解出藥物的方法、制備液體藥物的水性混懸液的方法、用于制備油狀注射溶液或油狀懸浮注射溶液的方法、用于制備乳化注射溶液(o/w或w/o型乳化注射溶液等)的方法等等。
如果經(jīng)在本發(fā)明所應(yīng)用的國(guó)家的法律和當(dāng)局認(rèn)可，本發(fā)明的組合物和藥物的使用通常要在醫(yī)師的監(jiān)督或無(wú)醫(yī)師的監(jiān)督下進(jìn)行。
也可以以疫苗的形式提供本發(fā)明。疫苗的意思是用于預(yù)防(或治療)特定類型的疾病(例如接觸性傳染病、感染疾病等)的任何一種不同形式的抗原(例如，蛋白、DNA等)。根據(jù)感染、傳播、流行等類型，使用減弱的活病原體(活疫苗)、無(wú)活性的病原體(或它的一部分)、病原體的代謝物(毒素、無(wú)活性的毒素(即類毒素)等)、DNA疫苗等。疫苗造成有機(jī)體體內(nèi)的免疫力的主動(dòng)發(fā)展(體液免疫、細(xì)胞免疫、或兩者)并預(yù)防病原體所引起的感染、傳播、流行等等。
本發(fā)明的疫苗并不特別地限定于任何一種劑量形式，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備疫苗。另外，本發(fā)明的疫苗可以是含有各種佐劑的乳劑形式。當(dāng)使用比單獨(dú)地使用上述的HSV基因重組體更小的劑量時(shí)，佐劑有助于維持高水平的免疫力。佐劑實(shí)例包括Freund佐劑(完全或不完全)、佐劑65(包括花生油、二縮甘露醇和單硬脂酸鉛)、和氫氧化鋁、磷酸鋁或礦物膠例如明礬。對(duì)于用作為食物來(lái)源的人體或動(dòng)物的疫苗，佐劑65是優(yōu)選的。對(duì)于用于商業(yè)化動(dòng)物的疫苗，礦物膠是優(yōu)選的。
除了上述的佐劑，本發(fā)明的疫苗可以包括一個(gè)或多個(gè)用于制備的添加劑，選自稀釋劑、芳香化學(xué)試劑、防腐劑、賦形劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、結(jié)合劑、表面活性劑、增塑劑等等。
本發(fā)明的疫苗的給藥途徑?jīng)]有被特別地限定，但腸外給藥是優(yōu)選的。例如，腸外施用疫苗(例如，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi))。優(yōu)選地，可以經(jīng)頸動(dòng)脈施用本發(fā)明的疫苗。
根據(jù)各種條件可以選擇本發(fā)明的疫苗的劑量預(yù)期施用的疫苗、感染是否是初次或反復(fù)感染、年齡和體重、患者的病變；疾病嚴(yán)重性等等。當(dāng)預(yù)期治療反復(fù)感染所引起的疾病時(shí)，本發(fā)明的疫苗的劑量?jī)?yōu)選的是每公斤體重約0.01ng到10mg，以及更優(yōu)選的是每公斤體重約0.1ng到1mg。
本發(fā)明的疫苗的給藥次數(shù)的不同依賴于上述的條件，并且不一定必須是由相同的方式所決定的。然而，優(yōu)選地，在數(shù)天或數(shù)周的間隔內(nèi)反復(fù)施用疫苗。具體地，進(jìn)行數(shù)次給藥，或優(yōu)選的在約2到4周的間隔內(nèi)給藥約1到2次。優(yōu)選地根據(jù)癥狀學(xué)或測(cè)定主要抗體滴度的同時(shí)監(jiān)測(cè)疾病的病變決定給藥的次數(shù)(給藥次數(shù))。
組合物在此用于治療或預(yù)防病原體感染(例如，病毒(例如，HIV、流感病毒、輪狀病毒等)、或細(xì)菌)。這些組合物包括病原體的至少一種基因或蛋白。外來(lái)基因優(yōu)選的是全長(zhǎng)的基因，但可以是部分序列，只要它至少含有能觸發(fā)免疫力的抗原決定簇。名詞“抗原決定簇”在此指的是一種其結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明的抗原決定部分。用于確定抗原決定簇的方法在本領(lǐng)域是已知的。一旦提供了蛋白的原始核酸或氨基酸序列，利用這樣一種已知的常規(guī)技術(shù)可以確定出這些抗原決定簇。有用的抗原決定簇可以至少有3個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，優(yōu)選的至少4個(gè)氨基酸、至少5個(gè)氨基酸、至少6個(gè)氨基酸、至少7個(gè)氨基酸、至少8個(gè)氨基酸、至少9個(gè)氨基酸、至少10個(gè)氨基酸、至少15個(gè)氨基酸、至少20個(gè)氨基酸、或至少25個(gè)氨基酸。
名詞“中和抗體”在此指的是一種參與中和抗原例如酶、毒素、細(xì)菌、病毒等的生物學(xué)活性的反應(yīng)的抗體。名詞“中和反應(yīng)”指的是其中抗原與中和抗體結(jié)合的反應(yīng)，使得抗原和抗體的活性被消除或減弱。如果施用疫苗，可以產(chǎn)生中和抗體并清除病原體。
名詞“基因治療”或“基因治療方法”在此指的是通過(guò)往患者中導(dǎo)入健康或修飾核酸(例如DNA)治療受損(或缺陷)基因所引起的疾病的方法。盡管經(jīng)常使用載體，但一些基因治療使用注射裸核酸的步驟。本發(fā)明的病毒包膜可用作為這樣的載體。
本發(fā)明可以提供包括組合物和藥物的試劑盒的形式。試劑盒包括本發(fā)明的組合物和藥物；以及提供指導(dǎo)施用組合物和藥物的說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)描述了說(shuō)明施用本發(fā)明的組合物或藥物的適當(dāng)方法的陳述。根據(jù)本發(fā)明所實(shí)踐國(guó)家的當(dāng)局(例如，日本的衛(wèi)生、勞動(dòng)和福利部、美國(guó)的食品與藥物管理局(FDA)等)所定義的格式制備說(shuō)明書(shū)，明確地說(shuō)明說(shuō)明書(shū)是經(jīng)當(dāng)局認(rèn)可的。說(shuō)明書(shū)是所謂的藥品說(shuō)明書(shū)，并常是紙件的形式。說(shuō)明書(shū)不受此限定并可以是電子媒介的形式(例如，因特網(wǎng)所提供的網(wǎng)站、電子郵件等)。
參照于使用目的、靶向疾病(類型、嚴(yán)重性等)、患者的年齡、體重、性別、病史、細(xì)胞生物活性物質(zhì)的形式或類型等，本領(lǐng)域人員可以容易地確定出在本發(fā)明的方法中所用的組合物和藥物的量。
根據(jù)使用目的、靶向疾病(類型、嚴(yán)重性等)、患者的年齡、體重、性別和病史、治療的進(jìn)展等，本領(lǐng)域人員也能確定出應(yīng)用于對(duì)象(或患者)的本發(fā)明的治療方法的頻率。頻率的實(shí)例包括每天一次到數(shù)月一次(例如每周一次到每月一次)。優(yōu)選地，根據(jù)進(jìn)展，進(jìn)行每周到每月一次的給藥。
本發(fā)明的組合物和藥物包括一種導(dǎo)入到宿主內(nèi)的材料或藥用成分。這樣的材料或藥用成分可以是生物學(xué)大分子。優(yōu)選地，這樣的生物學(xué)大分子是選自由核酸、多肽、糖、脂質(zhì)以及它們的復(fù)合分子所構(gòu)成的組。優(yōu)選地，這樣的藥用成分可以是編碼在導(dǎo)入成分的宿主中表達(dá)的多肽的核酸。
本發(fā)明的組合物和藥物可以包括一種或多種附加的藥用成分。這樣的一種藥用成分可以包含于藥用組合物中。這樣的藥用成分的實(shí)例包括，但不限定于下面所描述的成分中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物(例如，全身麻醉藥、鎮(zhèn)靜催眠藥、抗焦慮藥、抗癲癇藥、抗炎藥、中樞神經(jīng)興奮藥、抗眠藥、抗帕金森藥、抗精神病藥、復(fù)合感冒藥等)；周圍神經(jīng)藥物(例如，局部麻醉藥、骨骼肌松弛劑、自主神經(jīng)藥、解痙藥等)；感覺(jué)器官藥物(例如，眼科藥、耳鼻喉科藥、抗眩暈藥等)；循環(huán)器官藥物(例如，強(qiáng)心劑、抗心律失常藥、利尿劑、抗高血壓藥、血管收縮劑、血管擴(kuò)張劑、抗高血脂藥等)；呼吸器官藥物(例如，呼吸興奮劑、止咳藥、祛痰藥、止咳祛痰藥、支氣管擴(kuò)張劑、嗽口水等)；消化器官藥物(例如，收斂劑、消脹劑、消化性潰瘍藥、健胃藥、抗酸劑、瀉藥、灌腸劑、利膽劑等)；激素藥(例如，垂體激素藥、唾液腺激素藥、甲狀腺激素藥、副甲狀腺激素藥、促蛋白合成類固醇、腎上腺激素藥、雄激素藥、雌激素藥、孕酮藥、混和激素藥等)；泌尿生殖器官和肛門(mén)藥物(例如，泌尿器官藥、生殖器官藥、子宮收縮劑、痔瘡藥等)；皮膚藥物(例如，皮膚消毒劑、傷口保護(hù)劑、化膿性病藥、鎮(zhèn)痛藥、止癢劑、收斂劑、消炎藥、抗寄生蟲(chóng)皮膚病藥、潤(rùn)滑劑、毛發(fā)藥物等)；牙科和口腔藥物；其它器官的藥物；維生素藥物(例如，維生素A藥、維生素D藥、維生素B藥、維生素C藥、維生素E藥、維生素K藥、混和維生素藥等)；營(yíng)養(yǎng)藥(例如，鈣劑、無(wú)機(jī)藥劑、糖劑、蛋白氨基酸藥劑、有機(jī)藥劑、嬰兒藥劑等)；血液和體液藥(例如，血液代用品、止血藥、抗凝藥等)；透析藥物(例如，腎臟透析藥、腹膜透析藥等)；其它代謝藥物(例如，器官疾病藥、解毒劑、安塔布司、抗通風(fēng)藥、酶藥劑、糖尿病藥和其它藥物)；細(xì)胞活化劑(例如，葉綠素、色素藥等)；腫瘤藥(例如，烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素藥劑、抗腫瘤植物提取藥劑等)；放射性藥物；過(guò)敏藥物(例如，抗組胺藥、刺激治療藥物、非特異性免疫原藥劑、和其它過(guò)敏藥物、天然藥物以及基于中藥的藥物、天然藥物、中藥藥劑、藥劑其它基于天然藥物和中藥劑型的藥劑)；抗生素藥(例如，作用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性支原體、革蘭氏陰性支原體、革蘭氏陽(yáng)性立克氏體、革蘭氏陰性立克氏體、抗酸細(xì)菌、霉菌等)；化療藥(例如，磺胺藥物、抗結(jié)核藥、合成的抗微生物藥、抗病毒藥等)；生物制品(例如，疫苗、類毒素、抗毒素、鉤端螺旋體抗血清、血液制品、生物測(cè)定制品、以及其它生物制品、和抗原蟲(chóng)藥、驅(qū)蟲(chóng)藥等)。
在此可以隨意應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的分子生物學(xué)技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)和微生物技術(shù)。在例如Ausubel F.A.等編(1988)，″Current Protocols inMolecular Biology″，Wiley，New York，NY；Sambrook J.等(1987)，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2nd Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Bessatsu Jikken Igaku，″Idenshi-Donyu&Hatsugen-Kaiseki-Jikkenho″[Experimantal Medicine，Special Issue，″Experimental Methods for Gene Introduction&Expression Analysis″，Yodo-sha，1997等中描述了這些方法。
通?？梢允褂猛ㄟ^(guò)將種子病毒接種于受精的雞蛋內(nèi)并在其中擴(kuò)增的病毒(例如HVJ)。同樣的，可以使用在猴的或人的培養(yǎng)細(xì)胞或組織的持續(xù)感染株中擴(kuò)增的病毒(培養(yǎng)基中添加有水解酶，例如胰蛋白酶等)。同樣的，本發(fā)明可以使用在被能誘發(fā)持續(xù)感染的克隆的病毒基因組所感染的培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)所擴(kuò)增的病毒。本發(fā)明也可以使用這些突變株。另外，也可以使用通過(guò)其它方法所獲得的病毒(例如，HVJ等)?？梢允褂弥亟MHVJ(Hasan M.K.et al.，Journal of General Virology，78，2813 to 2830，1997；或Yonemitsu Y.et al.，Nature Biotechnology，18，970to 973，2000)。可以使用任何一種HVJ。Z株(例如編號(hào)No.ATCC VA 2388或從查爾斯河SPAFAS購(gòu)得的病毒株)或Cantell株(例如，Johnston M.D.，J.Gen.Virol.，56，175-184，1981或從查爾斯河SPAFAS購(gòu)得的病毒株)是更合乎要求的。
發(fā)明的最佳實(shí)施方案在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的體系。該體系包括1)一種生物分子；2)一種病毒包膜；以及3)一種糖胺聚糖。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了糖胺聚糖(例如肝素)通過(guò)用病毒包膜提高生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的作用。盡管不希望受到任何理論的約束，現(xiàn)在相信添加糖胺聚糖實(shí)現(xiàn)了改變或減弱細(xì)胞強(qiáng)度的作用，因此增強(qiáng)將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。因此，所用的糖胺聚糖分子可以是任何一種糖胺聚糖，以及優(yōu)選地使用具有葡糖胺殘基的糖胺聚糖，以及更優(yōu)選地可以使用肝素。盡管不希望受到任何理論的約束，現(xiàn)在相信糖胺聚糖是優(yōu)選的，因?yàn)樗哂凶鳛闅埢钠暇厶牵哂写龠M(jìn)通過(guò)血腦屏障的作用。在所用的肝素中，具有高分子量(例如，10,000kDa或更高，更優(yōu)選地，11,000kDa或更高，仍更優(yōu)選地，12,000kDa或更高)的肝素是優(yōu)選的，以及更優(yōu)選地，使用具有12,000到15,000kDa平均分子量的肝素。然而，可以使用具有比這些分子量更低分子量的肝素。硫酸化程度對(duì)輸送的效率具有一些影響。因此，所用的優(yōu)選的肝素是具有藥用可接受的硫酸化程度的肝素。如上所述，可以使用非肝素的分子。這些分子包括但不限于例如，透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、硫酸乙酰肝素、以及它們的混合物和聚合物。盡管不希望受到任何理論的約束，相信這些分子具有硫酸殘基，因此促進(jìn)輸送到體內(nèi)。在本發(fā)明的體系中所包括的這些糖胺聚糖的單位常為1U/ml。在本應(yīng)用的體系中優(yōu)選地包括至少5U/ml糖胺聚糖，更優(yōu)選地包括至少10U/ml，仍更優(yōu)選地包括至少50U/ml，最優(yōu)選地包括至少100U/ml。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的病毒包膜是滅活的。這樣的滅活包括但不限于通過(guò)紫外線照射、烷基化等的滅活。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的病毒包膜可以是RNA病毒的包膜。優(yōu)選地，這樣的病毒包膜可以是屬于副粘病毒(Paramixovirus)屬的病毒(例如HVJ、流感病毒)的包膜，優(yōu)選的是HVJ包膜。
通過(guò)本發(fā)明的體系所導(dǎo)入的生物分子可以是在上文中所描述的任何分子，以及常包括選自由核酸、多肽、脂類、糖、及其復(fù)合分子所構(gòu)成的組的分子。優(yōu)選地，這樣的生物分子包括核酸和多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的生物分子包括核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的生物分子包括多肽。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明所導(dǎo)入的生物分子是編碼選自由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)構(gòu)成的組的基因的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所導(dǎo)入的分子是選自由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)構(gòu)成的組的多肽。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖胺聚糖(例如肝素)、生物分子和病毒包膜可以包括于同一組合物中。在這種情況中，組合物中的同質(zhì)性是沒(méi)有問(wèn)題的。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖胺聚糖(例如肝素)、生物分子和病毒包膜可以包括于不同的組合物中。在這種情況中，可以同時(shí)或分別施用兩種組合物。優(yōu)選地，生物分子被包括于病毒包膜中，使得生物分子被有效地輸送。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法，包括步驟1)將包括病毒包膜和生物分子的組合物施用于細(xì)胞；以及2)將糖胺聚糖施用于細(xì)胞。在上文中描述了本發(fā)明所用的生物分子(例如核酸或多肽)和糖胺聚糖(例如肝素)的優(yōu)選的實(shí)施方案。
在本發(fā)明中，施用糖胺聚糖(例如肝素)步驟可以與施用包括病毒包膜和生物分子的組合物步驟一起、之前或之后進(jìn)行。優(yōu)選地，在施用組合物的同時(shí)或僅僅之前，施用糖胺聚糖。更優(yōu)選地，同時(shí)施用組合物和糖胺聚糖。當(dāng)進(jìn)行同時(shí)給藥時(shí)，糖胺聚糖可以包含或不包含于組合物中。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了糖胺聚糖在生產(chǎn)用于將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的藥物的用途。在該用法中，所權(quán)利要求的藥物包括1)一種生物分子；2)一種病毒包膜；和3)一種糖胺聚糖。在上文中描述了生物分子(例如核酸和多肽)、病毒包膜(例如HVJ包膜)和糖胺聚糖(例如肝素)的優(yōu)選的實(shí)施方案。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將生物分子輸送到腦部的方法。該方法包括步驟1)短暫地阻斷頭部或頸部動(dòng)脈；以及2)在阻斷頭部或頸部動(dòng)脈期間，將生物分子導(dǎo)入到腦內(nèi)。在此短暫地阻斷動(dòng)脈有著意想不到的效果，它可以高效地(例如兩倍或更高)將生物分子導(dǎo)入到腦部，因?yàn)檎J(rèn)為血腦屏障(BBB)所造成的血管和腦部之間的明確界限使得生物分子不能被導(dǎo)入到腦部。短暫阻斷動(dòng)脈的方法包括球囊導(dǎo)管、夾子、生理阻斷的腦梗死等。優(yōu)選地使用球囊導(dǎo)管和夾子。“短暫”在此指的是有效地施用生物分子的一段時(shí)間(例如，至少1分鐘、5分鐘等)，以及優(yōu)選的是1-120分鐘。
在一個(gè)實(shí)施方案中，生物分子可以是上述的任何一種分子，以及優(yōu)選地選自由核酸、多肽、脂類、糖、和它的復(fù)合分子構(gòu)成的組。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物分子包括核酸。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物分子是編碼選自由血管化因子例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、HIF-1、DEL-1等；抗凋亡劑例如Bcl-2等；腦保護(hù)劑例如BDNF等；或抗氧化劑例如Mn-SOD等所構(gòu)成的組的基因的核酸分子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)載體輸送所導(dǎo)入的核酸。這樣的載體可以隨意地包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等。優(yōu)選地，載體可以是一種表達(dá)載體。構(gòu)建載體在本領(lǐng)域是熟知的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用病毒包膜導(dǎo)入生物分子。優(yōu)選地，本發(fā)明所用的病毒包膜是滅活的。滅活減少了不必要的毒性等?？梢酝ㄟ^(guò)包括但不限于UV照射、應(yīng)用烷化劑等的任何方法實(shí)現(xiàn)滅活。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒包膜可以是RNA病毒的包膜。優(yōu)選地，所用的病毒包膜是屬于副粘病毒屬的病毒(例如HVJ、流感病毒)的包膜。最優(yōu)選地，所用的病毒包膜是HVJ的包膜。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將生物分子和糖胺聚糖一起導(dǎo)入到腦部。糖胺聚糖可以是任何一種分子，以及優(yōu)選的是肝素?？梢允褂萌魏我环N糖胺聚糖，以及優(yōu)選的糖胺聚糖的分子量是至少10,000kDa，更優(yōu)選的是至少11,000kDa，更優(yōu)選的是至少12,000kDa。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案紅，肝素的分子量是12,000到15,000kDa。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少包括50U/ml糖胺聚糖。
在此優(yōu)選的是糖胺聚糖(例如肝素)的硫酸化的程度是藥用可接受的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以與施用生物分子同時(shí)、之前或之后施用糖胺聚糖。優(yōu)選地，同時(shí)施用糖胺聚糖和生物分子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，阻斷頭部或頸部動(dòng)脈1分鐘到120分鐘。
在一個(gè)實(shí)施方案中，頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈或頸動(dòng)脈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈。
在一個(gè)實(shí)施方案中，生物分子被施用到頸動(dòng)脈、丘腦內(nèi)、腦室內(nèi)或鞘內(nèi)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將生物分子施用到頸動(dòng)脈。頸動(dòng)脈是優(yōu)選的，因?yàn)樗o大范圍的腦實(shí)質(zhì)供應(yīng)血。
在另一方面，本發(fā)明提供了將生物分子輸送到腦部的試劑盒。試劑盒包括1)一種生物分子；以及2)說(shuō)明施用生物分子的方法的說(shuō)明書(shū)，方法包括A)短暫阻斷頭部或頸部動(dòng)脈；以及B)在阻斷頭部或頸部動(dòng)脈期間，將生物分子導(dǎo)入到腦內(nèi)。在上文中描述了短暫阻斷的方法。
試劑盒中所含的生物分子可以是任何一種分子，但優(yōu)選地是選自由核酸、多肽、脂類、糖及其復(fù)合分子的組。優(yōu)選地，生物分子包括核酸。
優(yōu)選的生物分子在此是編碼選自由血管化因子例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、HIF-1、DEL-1等；抗凋亡劑例如Bcl-2等；腦保護(hù)劑例如BDNF等；或抗氧化劑例如Mn-SOD等所構(gòu)成的組的基因的核酸分子。
通過(guò)載體輸送試劑盒中所含的核酸。載體在此可以是任何一種載體，只要載體可以表達(dá)這樣的核酸。優(yōu)選地，使用能在哺乳動(dòng)物(優(yōu)選是人)內(nèi)有效地表達(dá)核酸的載體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒還包括病毒包膜。
優(yōu)選地滅活病毒包膜，使得可以避免它們的副作用。
優(yōu)選地，病毒包膜可以是RNA病毒的包膜。
更優(yōu)選地，病毒包膜是屬于副粘病毒屬的病毒(例如HVJ、流感病毒等)的包膜。
最優(yōu)選地，病毒包膜是HVJ包膜。
本發(fā)明的試劑盒還可以包括糖胺聚糖。
所用的糖胺聚糖在此優(yōu)選地但不限定于肝素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所用的糖胺聚糖的分子量是至少10,000kDa，更優(yōu)選地是至少11,000kDa，更優(yōu)選地是至少12,000kDa。更優(yōu)選地，肝素的分子量是12,000-15,000kDa。
在一個(gè)實(shí)施方案中，至少包括50U/ml在本發(fā)明的試劑盒中所含的糖胺聚糖。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖胺聚糖(例如肝素)的硫酸化的程度是藥用可接受的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以與施用生物分子同時(shí)、之前或之后施用糖胺聚糖。更優(yōu)選地，同時(shí)施用糖胺聚糖和生物分子。
在本發(fā)明的試劑盒的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，阻斷頭部或頸部動(dòng)脈1分鐘到120分鐘。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈或頸動(dòng)脈。另外，頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈。
在本發(fā)明的試劑盒的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物分子被施用到頸動(dòng)脈、丘腦、腦室內(nèi)或鞘內(nèi)，但本發(fā)明并不限于此。
在本發(fā)明的試劑盒的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物分子被施用到頸動(dòng)脈。
在另一方面，本發(fā)明提供了生物分子用于生產(chǎn)將生物分子輸送到腦內(nèi)的試劑盒的用法。試劑盒包括A)一種生物分子；以及B)說(shuō)明施用生物分子的方法的說(shuō)明書(shū)，方法包括a)短暫阻斷頭部或頸部動(dòng)脈；以及b)在阻斷頭部或頸部動(dòng)脈期間，將生物分子導(dǎo)入到腦內(nèi)。
照此，本發(fā)明者已經(jīng)研究了用本發(fā)明的病毒包膜(例如，HVJ-E載體)體外或體內(nèi)將基因輸送到CNS內(nèi)的可能性。如下面的實(shí)施例所證實(shí)的一樣，當(dāng)使用Venus報(bào)道基因時(shí)，能在鼠的大腦皮層神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中測(cè)定到熒光。通過(guò)將基因直接注射到丘腦、腦室內(nèi)或鞘內(nèi)，報(bào)道基因(Venus或EGFP)被成功地轉(zhuǎn)染到鼠腦部，且不誘發(fā)免疫反應(yīng)。在經(jīng)頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈內(nèi)注射后，沒(méi)有觀察到基因表達(dá)，但是，當(dāng)在短暫阻斷后將載體注射到大腦中動(dòng)脈內(nèi)后，只在受損半球內(nèi)檢測(cè)到EGFP或螢光素酶活性。最后，為了增加轉(zhuǎn)染效率，測(cè)定了肝素的作用。加入50U/ml肝素顯著地增加了螢光素酶活性(p＜0.05)。
總而言之，HVJ-E載體能高度有效地將基因轉(zhuǎn)染到CNS內(nèi)，且無(wú)任何明顯的毒性。HVJ-E可用于測(cè)定大量基因的作用以及用于治療腦血管疾病。
在下文中，根據(jù)實(shí)施例描述本發(fā)明。以下的實(shí)施例只用作為舉例說(shuō)明的目的。因此，本發(fā)明的范圍不局限于上面的描述以及下面的實(shí)施例，而只受所附錄的權(quán)利要求書(shū)的限定。
實(shí)施例實(shí)施例1使用HVJ的方法材料和方法HVJ-包膜載體將導(dǎo)入HVJ(Z株)(10,000血凝單位)與質(zhì)粒DNA(200μg)和0.3％Triton-X混和。用平衡鹽溶液(BSS；137mM NaCl；5.4mM KCl和10mMTris-HCl，pH7.6)洗滌混合物。然后重懸于10μl(用于經(jīng)腦給藥)、100μl(用于經(jīng)鞘內(nèi)或經(jīng)動(dòng)脈給藥)、或400μl(用于培養(yǎng)細(xì)胞)的磷酸緩沖液(PBS，pH7.5)中。對(duì)于體外研究，在用載體處理之前，加入魚(yú)精蛋白(Nakalai tesque，日本)以增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率。對(duì)于共注射肝素(Aventis，日本)，低分子量肝素(Fragmin，Kissei，日本)，或阿加曲班(Argatroban)(Slonnon，Daiichi，日本)的情況，將它們與PBS混和并加入到載體中。
質(zhì)粒DNApEGFP-C1購(gòu)自Clontech(CA，USA)。通過(guò)將pGL3-啟動(dòng)子載體(Promega，Madison，WI，USA)的螢光素酶基因克隆到pcDNA3(5.4kb)(Invitrogen，San Diego，CA，USA)的HindIII和BamHI位點(diǎn)構(gòu)建出pCMV-螢光素酶-GL3(pcLuc-GL37.4kb)。用Qiagen質(zhì)粒分離試劑盒(Hilden，德國(guó))純化質(zhì)粒。通過(guò)將pSV-β-半乳糖苷酶的HindIII-BamHI片段插入到pcDNA3可以構(gòu)建出pCMV-LacZ(9.2kb)。
Venus/pCS2由Nagai博士(Laboratory for Cell Function and Dynamics，Advanced Technology Development Center，Brain Science Institute，RIKEN，Japan)惠贈(zèng)。
(測(cè)定Venus的熒光)在注射后96個(gè)小時(shí)，在熒光立體顯微鏡下觀察Venus的表達(dá)。用共聚焦激光顯微鏡(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)得到更精確的圖像。
(檢測(cè)螢光素酶活性)在轉(zhuǎn)染后24個(gè)小時(shí)，麻醉下處死被螢光素酶基因轉(zhuǎn)染的大鼠。收集器官(腦、肺、脾和肝)并分別放置在FALCON 50ml管中。如前所述進(jìn)行螢光素酶活性檢測(cè)[Brewer GJ，Torricelli JR，Evege EK，Price PJ.，JNeurosci Res.1993；35567-76.]。通過(guò)測(cè)定組織提取物的蛋白濃度將螢光素酶水平標(biāo)準(zhǔn)化[Brewer GJ，Torricelli JR，Evege EK，Price PJ.，J NeurosciRes.1993；35567-76.]。用每克組織蛋白的相對(duì)光單位(RLU)表示螢光素酶單位。
(體外基因轉(zhuǎn)移)從懷孕19天的妊娠Wistar大鼠(Charles River Japan，Atsugi，Japan)中取得鼠胚胎的大腦皮層神經(jīng)元并培養(yǎng)[Belayev L，et al.，Stroke.1996；271616-22；discussion 1623FF09]。簡(jiǎn)單地，切下大腦皮層并通過(guò)木瓜蛋白酶的處理分離出單個(gè)細(xì)胞，并將細(xì)胞碾碎于Leibovitz s L-15培養(yǎng)基(Invitrogen，CA，USA)中。在37℃、95％空氣-5％CO2的潮濕大氣下，將細(xì)胞培養(yǎng)于加有DMEM(Invitrogen)/B-27(Invitrogen)的聚合-D-賴氨酸包被的24孔塑料培養(yǎng)皿中。在第1天和第4天更換培養(yǎng)基。第7天的MAP2(微管相關(guān)蛋白)免疫陽(yáng)性細(xì)胞比例為92.9％。在轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基更換為每孔500μl新鮮DMEM。將含有Venus基因的HVJ-E載體(250HAU)加入到每個(gè)孔中并在37℃下保持10分鐘。在轉(zhuǎn)染后，將培養(yǎng)基更換為新鮮DMEM/B-27，并將培養(yǎng)皿孵育在37℃。在轉(zhuǎn)染2天后，用激光掃描共聚焦顯微鏡成像觀察Venus的表達(dá)。轉(zhuǎn)染效率(％)計(jì)算為(表達(dá)Venus的細(xì)胞數(shù)目/NeuN免疫反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目)×100。為了平均效率，隨機(jī)選擇5個(gè)視野并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。
(免疫組化)用4％多聚甲醛在37℃固定體外培養(yǎng)細(xì)胞15分鐘，并用0.5％TritonX-100處理細(xì)胞10分鐘。用含有2％山羊血清、牛血清白蛋白(5mg/ml)和甘油(50mM)的PBS封閉細(xì)胞。然后，將細(xì)胞與抗MAP2的鼠單克隆抗體(1:1000，Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA)或者抗GFAP的鼠單克隆抗體(Glial Fibrillary Acidic Protein，1:1000，Sigma-Aldrich)在4℃孵育過(guò)夜。在用PBS洗滌后，加入作為第二抗體的Alexa Fluor 546-偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)，并將培養(yǎng)皿在室溫下孵育1個(gè)小時(shí)。用共聚焦激光顯微鏡分析圖像。
(正常鼠的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移)本發(fā)明使用Wistar雄性大鼠(270-300g；Charles River Japan，Atsugi，Japan)。根據(jù)大阪大學(xué)指南進(jìn)行所有操作。用氯胺酮(三共，日本)將鼠麻醉并將鼠放置于立體支架(Narishige Scientific Instrument Laboratory，Tokyo，Japan)上，暴露出頭顱。將帶有特殊設(shè)計(jì)的Teflon連接器的不銹鋼套管(30號(hào)，Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)導(dǎo)入到丘腦(前囟后3.8mm，中線外側(cè)2.4mm，以及頭顱表面下5.0mm)或側(cè)腦室(前囟前0.48mm，中線外側(cè)0.8mm以及頭顱表面下3.8mm)。以1.0μl/min的速度注射含有Venus基因或EGFP基因的HVJ-E載體。在輸注后，取出輸注套管。在所有的動(dòng)物中沒(méi)有觀察到任何的行為改變例如驚厥或肢體的異?；顒?dòng)。
對(duì)于蛛網(wǎng)膜下腔的輸注，將每個(gè)動(dòng)物的頭固定在俯臥位，并通過(guò)枕頸中線切口暴露出環(huán)枕膜。將不銹鋼套管(27號(hào)；Becton-Dickinson)導(dǎo)入到小腦延髓池(蛛網(wǎng)膜下腔)內(nèi)。在取出100μl CSF后，以50μl/min的速度輸注含有螢光素酶或Venus基因的HVJ-E載體(100μl)，然后將動(dòng)物頭低位放置30分鐘。對(duì)于頸總動(dòng)脈的輸注，在手術(shù)顯微鏡(Konan，日本)下，經(jīng)中線切口分離出左頸總動(dòng)脈、左頸外動(dòng)脈和左頸內(nèi)動(dòng)脈。暫時(shí)結(jié)扎左頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，并將PE-50導(dǎo)管(Clay Adams，Parsippany，NY，USA)經(jīng)左頸外動(dòng)脈的切口導(dǎo)入到左頸總動(dòng)脈內(nèi)。以25μl/min的速度注射含有EGFP或螢光素酶基因的HVJ-E載體(100μl)。注射后，取出套管并解開(kāi)結(jié)扎處以恢復(fù)頸總動(dòng)脈內(nèi)的血流。在每個(gè)方法中，在轉(zhuǎn)染4天后觀察EGFP或Venus以及在轉(zhuǎn)染1天后測(cè)定螢光素酶活性。也在經(jīng)鞘內(nèi)注射1天后測(cè)定脾、肺和肝臟的螢光素酶活性。所有的鼠在給藥后沒(méi)有出現(xiàn)體重減輕或活性缺失。為了明確注射載體后的組織學(xué)改變，在經(jīng)腦室和經(jīng)鞘內(nèi)注射14天后進(jìn)行冠狀切面的HE染色。從前囟的+1.0mm、-13.30mm、-5.30mm、-11.30mm和-14.60mm生成冠狀切面。
(短暫阻斷大腦中動(dòng)脈后的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移)為了制成大腦中動(dòng)脈阻斷模型，如前所述的[Belayev L et al.，Stroke27，1616-1622(1996)]，通過(guò)在MCA的起始部放置聚L-賴氨酸涂層的4-0尼龍以阻斷左側(cè)大腦中動(dòng)脈。簡(jiǎn)單的，利用面罩用氟烷(1-3.5％的70％N2O和30％O2混合物)麻醉動(dòng)物。在整個(gè)手術(shù)操作中用反饋調(diào)節(jié)的加熱板將直腸溫度保持在37±1℃。在手術(shù)顯微鏡下，經(jīng)中線切口分離出左頸總動(dòng)脈、左頸外動(dòng)脈和左頸內(nèi)動(dòng)脈。短暫地結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈60分鐘后，取出4-0尼龍并再灌注10分鐘。然后再短暫地結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。如上所述，從頸外靜脈將PE-50導(dǎo)管放置在頸總動(dòng)脈，在解開(kāi)結(jié)扎后以10μl/min的速度注射載體。注射后，取出PE-50導(dǎo)管并用6-0尼龍結(jié)扎頸外動(dòng)脈。在輸注后1天或3天觀察螢光素酶或EGFP的表達(dá)。
(結(jié)果)(對(duì)培養(yǎng)的大鼠大腦皮層細(xì)胞的轉(zhuǎn)染)為了發(fā)展一種將基因轉(zhuǎn)移到CNS內(nèi)的有效方法，我們將報(bào)道基因(Venus基因)轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的大鼠大腦皮層細(xì)胞(E19)內(nèi)，因?yàn)閂enus報(bào)道基因已經(jīng)被報(bào)道為一種容易檢測(cè)的轉(zhuǎn)染方法。報(bào)道了Venus可用作容許可靠并容易檢測(cè)到腦切片中的熒光信號(hào)的受體的[Nagai T，et al.，NatBiotechnol.2002；2087-90.]。在轉(zhuǎn)染2天后，培養(yǎng)的鼠大腦皮層細(xì)胞證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞具有容易檢測(cè)的熒光(圖1a、1d和1g)。利用免疫組化染色，細(xì)胞是MAP2(微管相關(guān)蛋白2；神經(jīng)元標(biāo)記物)、NeuN(神經(jīng)元核抗原；神經(jīng)元標(biāo)記物)或GFAP(神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白；神經(jīng)膠質(zhì)和星狀細(xì)胞標(biāo)記物)免疫陽(yáng)性的(圖1c、1f和1i)。從Venus陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所計(jì)算得到的神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率是26.7～6.4％，同時(shí)在用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒(méi)有測(cè)定到陽(yáng)性細(xì)胞。在用HVJ-E載體轉(zhuǎn)染后，沒(méi)有觀察到細(xì)胞死亡。
(腦部的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移)之后，我們測(cè)定了Venus基因的腦部轉(zhuǎn)染。首先，我們將含有強(qiáng)化綠色熒光蛋白(EGFP)基因的HVJ-E載體注射到丘腦和側(cè)腦室內(nèi)。對(duì)丘腦的EGFP基因的立體定位注射顯示在注射部位的有限的表達(dá)(圖2a)。在對(duì)側(cè)腦室的立體定位注射后，可以在脈絡(luò)叢和室管膜細(xì)胞上檢測(cè)到熒光(圖2b和2c)。意想不到的是，在神經(jīng)元上沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)。另一方面，在用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染的腦部或在未轉(zhuǎn)染的腦部沒(méi)有檢測(cè)到熒光的陽(yáng)性染色。之后，我們將基因注射到蛛網(wǎng)膜下腔。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們用Venus報(bào)道基因代替EGFP，因?yàn)閼?yīng)用Venus報(bào)道基因是一種容易檢測(cè)的轉(zhuǎn)染方法。經(jīng)小腦延髓池對(duì)腦脊液的注射造成了Venus在腦膜上的廣泛表達(dá)，但是在脈絡(luò)叢或神經(jīng)元上只有很少量的表達(dá)(圖3a和3b)。重要的是，經(jīng)鞘內(nèi)注射3天后的冠狀切面的HE染色顯示沒(méi)有炎性改變。
(短暫阻斷大腦中動(dòng)脈后的CNS的基因轉(zhuǎn)染)考慮到臨床單位內(nèi)的腦缺血性疾病的治療，似乎最好采用蛛網(wǎng)膜下腔輸注而不采用利用立體定位支架對(duì)側(cè)腦室的注射。為了進(jìn)一步探討利用HVJ-E載體的基因治療在腦缺血上的可行性，我們測(cè)定了經(jīng)頸動(dòng)脈的CNS的基因轉(zhuǎn)移。然而，在注射后3和7天，對(duì)頸動(dòng)脈的動(dòng)脈內(nèi)輸注造成了轉(zhuǎn)基因在腦部和微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的少量表達(dá)。為了克服這個(gè)問(wèn)題，我們假設(shè)腦缺血后的基因轉(zhuǎn)移可以表現(xiàn)出CNS的不同的轉(zhuǎn)染效率，因?yàn)槟X缺血造成了血腦屏障的改變[Belayev L，Busto R，Zhao W，GinsbergMD.，Brain Res.1996；73988-96.；Kuroiwa T，Ting P，Martinez H，Klatzo I.，Acta Neuropathol.1985；68122-9.；and Neuann-Haefelin T，et al.，Stroke.2000；311965-72；discussion 1972-3.]。因此，我們?cè)诙虝鹤钄啻竽X中動(dòng)脈60分鐘后，將含有Venus基因的HVJ-E載體輸注到頸動(dòng)脈內(nèi)。有趣的是，在短暫阻斷3天后，在梗死的大腦皮層可以檢測(cè)出Venus的熒光(圖4)。使用螢光素酶基因的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CNS轉(zhuǎn)染的可行性。在注射后24小時(shí)，在梗死半球內(nèi)的螢光素酶活性要比對(duì)側(cè)半球的活性高(圖5，P＜0.05)。另一方面，在脾、肺和肝臟沒(méi)有檢測(cè)到螢光素酶活性。
最后，我們研究了共施用肝素是否能增加轉(zhuǎn)染效率。在制成含有螢光素酶基因的HVJ-E載體后，將10、50或100U/ml濃度的肝素加入到載體中。將HVJ-E載體經(jīng)小腦延髓池注射到CSF中。如圖6所示，加入50U/ml肝素戲劇性地增加了螢光素酶活性(P＜0.05)。為了闡明用肝素增加轉(zhuǎn)染效率的機(jī)制，我們測(cè)定了1、5、10、50、100或200U/ml低分子量肝素(LMWH)，或0.1或0.2mg/ml阿加曲班的作用。然而，低分子量肝素和阿加曲班都不影響螢光素酶活性。
(討論)過(guò)去，我們報(bào)道了HVJ-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法對(duì)鼠和靈長(zhǎng)類的CNS的轉(zhuǎn)染效率[Yamada K，et al.，Am J Physiol.1996；271R1212-20.；Hagihara Y，et al.，Gene Ther，2000；7759-63.；and Hayashi K，et al.，Gene Ther.2001；81167-73.]。HVJ-脂質(zhì)體方法利用脂質(zhì)體和來(lái)源于HVJ包膜的蛋白[Kaneda Y，Saeki Y，Morishita R.，Mol Med Today.1999；5298-303.]對(duì)各種細(xì)胞及組織的融合活性的組合。但是，制作HVJ-脂質(zhì)體囊泡的方法是費(fèi)時(shí)及復(fù)雜的。另外，長(zhǎng)期的儲(chǔ)存是不可能的。這些問(wèn)題可以影響HVJ-脂質(zhì)體復(fù)合物在人基因治療上的應(yīng)用。為了克服這些問(wèn)題，我們最近發(fā)展出了第二代HVJ載體，也稱為HVJ-包膜(HVJ-E)載體。為了生成這個(gè)HVJ-E載體，在HVJ的病毒基因組已經(jīng)被完全斷裂后，將轉(zhuǎn)基因插入到HVJ的包膜中。與HVJ-脂質(zhì)體載體比較，HVJ-E載體的優(yōu)點(diǎn)是(1)容易制作；(2)生成不需要太多時(shí)間(少于90分鐘)；以及(3)HVJ-E可以長(zhǎng)期儲(chǔ)存(至少6個(gè)月)。在本發(fā)明中，我們證實(shí)了利用HVJ-E載體體內(nèi)和體外對(duì)CNS的基因轉(zhuǎn)移的可能性。在這個(gè)體外研究中，報(bào)道基因被成功地表達(dá)于神經(jīng)元(MAP2陽(yáng)性細(xì)胞或NeuN陽(yáng)性細(xì)胞)和星狀膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性細(xì)胞)中，且沒(méi)有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。而如果用非病毒載體，有絲分裂細(xì)胞可以被很好地轉(zhuǎn)染，但對(duì)例如靜止(G0)神經(jīng)元的非有絲分裂細(xì)胞的轉(zhuǎn)染很差[Berry M，et al.，Curr Opin Mol Ther.2001；3338-49.]。但是，在本發(fā)明中，用HVJ-E載體將報(bào)道基因成功地轉(zhuǎn)染到非有絲分裂細(xì)胞內(nèi)。因?yàn)榭垢缓谏窠?jīng)元細(xì)胞表面的唾液酸的病毒報(bào)道子的存在，所以可以獲得有效的轉(zhuǎn)染。
重要的是，對(duì)于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，使用HVJ-E載體的基因表達(dá)的分布不同于用HVJ-脂質(zhì)體的分布。經(jīng)鞘內(nèi)注射的HVJ-脂質(zhì)體方法可以在腦實(shí)質(zhì)中觀察到β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)[Hagihara Y，et al.，Gene Ther.2000；7759-63.；and Hayashi K，et al.，Gene Ther.2001；81167-73.]，而用HVJ-E只在腦膜和動(dòng)脈的外膜細(xì)胞中檢測(cè)到基因的表達(dá)。另外，經(jīng)腦室內(nèi)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的(HVJ陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的)基因轉(zhuǎn)移表明基因在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的表達(dá)[Zou LL，et al.，Gene Ther.1999；6994-1005.]，而HVJ-E載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)只在脈絡(luò)叢和室管膜細(xì)胞上有基因表達(dá)?？紤]到將HVJ-E載體直接注射到丘腦內(nèi)造成基因成功地轉(zhuǎn)染到腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的事實(shí)，脂質(zhì)體的存在對(duì)于跨越腦膜或室管膜細(xì)胞是重要的。本發(fā)明者以及其他的發(fā)明者已經(jīng)報(bào)道一些用于利用立體定位框架的側(cè)腦室內(nèi)給藥的高轉(zhuǎn)染效率的基因轉(zhuǎn)移方法(Yoshimura S，et al.，Hypertension.2002；391028-34.；and Yukawa H，et al.，Gene Ther.2000；7942-9.)，但是這些技術(shù)具有相當(dāng)大的創(chuàng)傷性。幸運(yùn)的是，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在輸注到小腦延髓池后，觀察到了腦膜表面上的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。另外，本發(fā)明清楚地證實(shí)在短暫阻斷大腦中動(dòng)脈后，重新開(kāi)放動(dòng)脈并經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)注射HVJ-E載體將基因轉(zhuǎn)移到CNS內(nèi)是有可能的。血腦屏障阻斷的破壞是有爭(zhēng)議的[Belayev L，Busto R，Zhao W，Ginsberg MD.，Brain Res.1996；73988-96.；Kuroiwa T，Tinc P，Martinez H，Klatzo I.，Acta Neuropathol.1985；68122-9.；and Neumann-Haefelin T，et al.，Stroke.2000；311965-72；discussion1972-3.]。Kuroiwa等證實(shí)血腦屏障在短暫阻斷大腦中動(dòng)脈1小時(shí)后的雙相開(kāi)放，首先出現(xiàn)在解除阻斷后15分鐘，然后出現(xiàn)在再灌注后5和72小時(shí)(Kuroiwa T，Ting P，Martinez H，Klatzo I.，Acta Neuropathol.1985；68122-9.)。在這段有限時(shí)間內(nèi)輸注HVJ-E載體將容許我們將治療基因經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)方式轉(zhuǎn)染到腦實(shí)質(zhì)中。應(yīng)當(dāng)注意到共施用肝素將增加HVJ-E載體轉(zhuǎn)染的效率。這些結(jié)果與共輸注肝素和AVV載體誘導(dǎo)了更高和更多的同源基因的表達(dá)的報(bào)道是相似的[Mastakov MY，Baer K，Kotin RM，DuringMJ.，Mol Ther.2002；5371-80.29.；and Nguyen JB，Sanchez-Pernaute R，Cunningham J，Bankiewicz KS.，Neuroreport.2001；121961-4.]。預(yù)計(jì)肝素影響了2，3交聯(lián)的唾液酸t(yī)eoglyacid(一種病毒結(jié)合受體)并增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率，或肝素與病毒受體結(jié)合以限制與細(xì)胞表面的HSPG的相互作用。為了闡明這個(gè)機(jī)制，我們測(cè)定了低分子量肝素(LMWH)和相似物質(zhì)例如阿加曲班的作用。然而，用這些物質(zhì)沒(méi)有觀察到轉(zhuǎn)染效率的增加。傳統(tǒng)肝素(12,000-15,000kDa)和LMWH(5000kDa)之間的區(qū)別僅僅在于分子大小和硫酸化程度的不同[Ishai-Michaeli R，et al.，Biochemistry.1992；312080-8.]。這些因素似乎是影響著HVJ-E載體和靶細(xì)胞表面之間的相互作用。
在此本發(fā)明證實(shí)了體內(nèi)和體外利用HVJ-E載體轉(zhuǎn)染CNS的顯著的轉(zhuǎn)染效率并且沒(méi)有明顯的毒性，同時(shí)在不同的給藥途徑之間有著不同的基因表達(dá)的部位。短暫的動(dòng)脈阻斷后的經(jīng)動(dòng)脈內(nèi)注射的成功的基因轉(zhuǎn)染提供了一種治療腦缺血的有希望的方法。另外，根據(jù)我們的認(rèn)識(shí)，沒(méi)有證據(jù)顯示HVJ具有可使人體致病的副作用[Okada Y.，Methods Enzymol1993；2211，18-41.；and Okada Y，Tadokoro J.，Exp Cell Res 1962；26，108-118.]，并且HVJ可被合適的化學(xué)修飾完全滅活且不丟失融合活性。在本發(fā)明中，經(jīng)鞘內(nèi)或腦室內(nèi)給藥表明無(wú)體重丟失、無(wú)神經(jīng)缺陷以及無(wú)炎性改變。另外，經(jīng)鞘內(nèi)注射后在任何其他的器官都沒(méi)有觀察到螢光素酶活性。因此，HVJ-E用于轉(zhuǎn)染腦部似乎是安全的。對(duì)于免疫原性，用HVJ-脂質(zhì)體方法反復(fù)施用質(zhì)粒DNA和反義誘餌DNA寡核苷酸(ODN)5次沒(méi)有造成任何生物學(xué)作用的丟失或抗HVJ抗體的生成(Morishita R，Gibbons GH，Kaneda Y，Ogihara T，Dzau VJ.，Biochem Biophys ResCommun 2000；273666-674；and Hirano T，et al.，Gene Ther 1998；5459-464.)。據(jù)此，HVJ-E載體可以是一種用于治療腦血管疾病的合適的基因轉(zhuǎn)移方法。
實(shí)施例2利用其他病毒載體的輸送(流感病毒的制備)從受精的雞蛋中獲得屬于正粘病毒科的流感病毒，并主要根據(jù)WO96/05294將其繁殖。簡(jiǎn)言之，按如下進(jìn)行需要仔細(xì)地選擇并從特別安全的健康農(nóng)場(chǎng)中得到受精蛋。將蛋放置于37.8℃的孵育箱中9天到12天。在將流感病毒接種到尿囊中之前，將蛋放到燭光中觀察胚胎的生長(zhǎng)或存活。
此后，為了在最優(yōu)化的條件下用病毒感染蛋，將蛋在具有可控溫度和濕度的培養(yǎng)孵育箱中培養(yǎng)2天到3天。根據(jù)所用的流感病毒的株和類型，條件有所不同。培養(yǎng)物被快速地冷卻到5±3℃以阻斷病毒的擴(kuò)增。此后，從受感染的蛋中收集到含有大量病毒顆粒的尿囊液。需要快速地純化所得到的含有流感病毒的尿囊液以去除雜質(zhì)例如蛋白(例如卵清蛋白等)、卵磷脂、細(xì)菌等等。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，離心所收集的物質(zhì)并去除上清，隨后在純化病毒前將物質(zhì)超濾濃縮20倍。
(烷基化過(guò)程)在使用前即刻，將0.01％β-丙酸內(nèi)酯制備于10mM KH2PO4中。在低溫下快速進(jìn)行此操作。
將β-丙酸內(nèi)酯加入到上述獲得的流感病毒濃縮溶液中，隨后在冰中孵育60分鐘。此后，在37℃進(jìn)行孵育2小時(shí)。將所得到的溶液分散到埃彭道夫管中，隨后在15,000rpm離心15分鐘。將沉淀物儲(chǔ)存在-20℃。任選的，該流感病毒可被超濾。
用利用500KMWCO(A/G Technology，Needham，Massachusetts)的超濾將絨毛尿囊液濃縮約10倍。將50mM NaCl、1mM MgCl2、2％甘露醇、20mM Tris(pH7.5)用作為緩沖液。用HA檢測(cè)得到流感病毒包膜的回收率接近100％。這是一個(gè)極好的結(jié)果。
利用Q-SepharoseFF(Amersham Pharmacia Biotech K.K.，Tokyo)(緩沖液20mM Tris-HCl(pH7.5)緩沖液，NaCl從0.2M到1M)進(jìn)行柱層析以純化流感病毒包膜。結(jié)果是，回收率為從40％到50％，以及純度是99％或更高。
照此，從含有絨毛尿囊液的流感病毒中制備得到滅活的流感病毒包膜。
研究了利用流感病毒包膜對(duì)腦部的輸送。和實(shí)施例1一樣，我們已經(jīng)研究了體外和體內(nèi)用流感病毒包膜對(duì)CNS的基因轉(zhuǎn)移的可能性。當(dāng)使用Venus報(bào)道基因時(shí)，可以在大鼠的大腦皮層神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到熒光。在體內(nèi)試驗(yàn)中，通過(guò)直接注射到丘腦內(nèi)、經(jīng)腦室內(nèi)注射或經(jīng)鞘內(nèi)注射，報(bào)道基因(Venus或EGFP)被成功地轉(zhuǎn)染到鼠腦中且沒(méi)有誘發(fā)免疫改變。在經(jīng)頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈內(nèi)注射后，沒(méi)有觀察到基因表達(dá)，但是當(dāng)載體被注射到被短暫阻斷的大腦中動(dòng)脈時(shí)，只在受損半球中檢測(cè)到EGFP或螢光素酶活性。最后，測(cè)定了肝素對(duì)增加轉(zhuǎn)染效率的作用。加入50U/ml肝素顯著地增加了螢光素酶活性。
照此，證實(shí)了不僅HVJ-E載體而且來(lái)源于HVJ-E載體的載體在短暫阻斷腦動(dòng)脈后都顯著地增加了對(duì)腦部的基因轉(zhuǎn)移的效率，以及加入肝素增加了流感病毒包膜輸送生物分子的效率。
實(shí)施例3使用腺伴隨病毒的方法下面，用腺伴隨病毒進(jìn)行與實(shí)施例1和2相似的試驗(yàn)。將AVVHelper-Free體系(Stratagene)用作為腺伴隨病毒。
如實(shí)施例2所描述的一樣進(jìn)行烷基化過(guò)程。
研究了利用腺伴隨病毒包膜對(duì)腦部的輸送。和實(shí)施例1一樣，我們已經(jīng)研究了體外和體內(nèi)用腺伴隨病毒包膜對(duì)CNS的基因轉(zhuǎn)移的可能性。當(dāng)使用Venus報(bào)道基因時(shí)，可以在鼠的大腦皮層神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到熒光。在體內(nèi)試驗(yàn)中，通過(guò)直接注射到丘腦內(nèi)、經(jīng)腦室內(nèi)注射或經(jīng)鞘內(nèi)注射，報(bào)道基因(Venus或EGFP)被成功地轉(zhuǎn)染到鼠腦中且沒(méi)有誘發(fā)免疫改變。在經(jīng)頸總動(dòng)脈的動(dòng)脈內(nèi)注射后，沒(méi)有觀察到基因表達(dá)，但是當(dāng)載體被注射到被短暫阻斷的大腦中動(dòng)脈時(shí)，只在受損半球中檢測(cè)到EGFP或螢光素酶活性。最后，測(cè)定了肝素對(duì)增加轉(zhuǎn)染效率的作用。加入50U/ml肝素顯著地增加了螢光素酶活性。
實(shí)施例4硫酸肝素用硫酸肝素(購(gòu)自SEIKAGAKU INDUSTRY INC.，和Sigma-AldrichJapan)取代實(shí)施例1-3的肝素以其證實(shí)對(duì)使用HVJ、流感病毒載體和腺伴隨病毒載體的相似作用。
結(jié)果是，當(dāng)使用硫酸肝素時(shí)，證實(shí)增強(qiáng)了對(duì)腦部的基因輸送效率。因此，一般的糖胺聚糖在本發(fā)明中都是有效的。
實(shí)施例5硫酸軟骨素用硫酸軟骨素(購(gòu)自SEIKAGAKU INDUSTRY INC.，和Sigma-Aldrich Japan)取代實(shí)施例1-3的肝素以其證實(shí)對(duì)使用HVJ、流感病毒載體和腺伴隨病毒載體的相似作用。
結(jié)果是，當(dāng)使用硫酸軟骨素時(shí)，證實(shí)增強(qiáng)了對(duì)腦部的基因輸送效率。因此，證明一般的糖胺聚糖包括葡糖胺聚糖和半乳糖胺聚糖在本發(fā)明中都是有效的。
盡管在此描述了特定優(yōu)選的實(shí)施方案，但是并不是說(shuō)這些實(shí)施方案可以被解釋為對(duì)發(fā)明范圍的限定，除在附錄的權(quán)利要求書(shū)中所設(shè)定的發(fā)明范圍外。應(yīng)當(dāng)明白在此所引用的全部專利、出版的文獻(xiàn)和出版物在此一同將其全部?jī)?nèi)容并入?yún)⒖肌?br> 工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種體外和體內(nèi)用病毒包膜將生物分子有效地輸送到腦部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)的方法。另外，提供了利用病毒包膜高效地輸送生物分子的體系和方法。因此，本發(fā)明提供了一種用于有效地將生物分子施用到神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的技術(shù)，它提供了工業(yè)可應(yīng)用性，其中這個(gè)技術(shù)可被用于施用各種藥物。
不僅醫(yī)生還有例如藥師等等都可以制備本發(fā)明的組合物。相信本發(fā)明是完全工業(yè)可應(yīng)用的或具有充分的用處。本發(fā)明也是工業(yè)可應(yīng)用的，因?yàn)樗擞米鳛榧冡t(yī)療目的的治療方法外，可用作為商業(yè)目的的臨床試驗(yàn)。另外，以間接或直接方式進(jìn)行的本發(fā)明的治療方法被認(rèn)為可能用于醫(yī)療服務(wù)相關(guān)的商業(yè)，因此本發(fā)明是工業(yè)可應(yīng)用的或有用的。
權(quán)利要求
1.一種將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的體系，包括1)一種生物分子；2)一種病毒包膜；以及3)一種糖胺聚糖。
2.權(quán)利要求1的體系，其中病毒包膜是滅活的。
3.權(quán)利要求1的體系，其中糖胺聚糖是肝素。
4.權(quán)利要求1的體系，其中糖胺聚糖的分子量至少是10,000kDa。
5.權(quán)利要求1的體系，其中所包括的糖胺聚糖的濃度至少為50U/ml。
6.權(quán)利要求3的體系，其中所述肝素的分子量為從12,000到15,000kDa。
7.權(quán)利要求3的體系，其中所述肝素的硫酸化程度是藥用可接受的。
8.權(quán)利要求1的體系，其中病毒包膜是一種RNA病毒的包膜。
9.權(quán)利要求1的體系，其中病毒包膜是一種屬于副粘病毒屬(Paramixovirus genus)的病毒的包膜。
10.權(quán)利要求1的體系，其中病毒包膜是HVJ的包膜。
11.權(quán)利要求1的體系，其中生物分子選自由核酸、多肽、脂類、糖及其復(fù)合分子所構(gòu)成的組。
12.權(quán)利要求1的體系，其中生物分子包括核酸。
13.權(quán)利要求1的體系，其中生物分子包括多肽。
14.權(quán)利要求1的體系，其中生物分子是一種編碼一種選自由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)所構(gòu)成的組的基因的核酸。
15.權(quán)利要求1的體系，其中生物分子是一種選自由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)所構(gòu)成的組的多肽。
16.權(quán)利要求1的體系，其中肝素、生物分子和病毒包膜被包含于同一組合物中。
17.權(quán)利要求1的體系，其中肝素被包含于不同于包括生物分子和病毒包膜的組合物的另一組合物中。
18.權(quán)利要求1的體系，其中生物分子被包含于病毒包膜中。
19.一種將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法，其包括以下步驟A)將一種包括病毒包膜和生物分子的組合物施用于細(xì)胞；和B)將糖胺聚糖施用于細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中施用糖胺聚糖的步驟與施用組合物的步驟同時(shí)實(shí)施。
21.權(quán)利要求19的方法，其中在施用組合物的步驟之前實(shí)施施用糖胺聚糖的步驟。
22.權(quán)利要求19的方法，其中在施用組合物的步驟之后實(shí)施施用糖胺聚糖的步驟。
23.糖胺聚糖在生產(chǎn)用于將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的藥物中的用途，其中藥物包括A)一種生物分子；B)一種病毒包膜；以及C)一種糖胺聚糖。
24.一種將生物分子輸送到腦部的方法，其包括以下步驟A)短暫阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈；以及B)在阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈期間將生物分子導(dǎo)入腦部。
25.權(quán)利要求24的方法，其中生物分子選自由核酸、多肽、脂類、糖及其復(fù)合分子所構(gòu)成的組。
26.權(quán)利要求24的方法，其中生物分子是核酸。
27.權(quán)利要求24的方法，其中生物分子是一種編碼一種選自由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)以及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)所構(gòu)成的組的基因的核酸。
28.權(quán)利要求26的方法，其中用載體輸送核酸。
29.權(quán)利要求26的方法，其中用病毒包膜導(dǎo)入生物分子。
30.權(quán)利要求29的方法，其中病毒包膜是滅活的。
31.權(quán)利要求29的方法，其中病毒包膜是一種RNA病毒的包膜。
32.權(quán)利要求29的方法，其中病毒包膜是一種屬于副粘病毒屬的病毒的包膜。
33.權(quán)利要求29的方法，其中病毒包膜是一種HVJ的包膜。
34.權(quán)利要求24的方法，其中用糖胺聚糖導(dǎo)入生物分子。
35.權(quán)利要求34的方法，其中糖胺聚糖是肝素。
36.權(quán)利要求34的方法，其中糖胺聚糖的分子量至少為10,000kDa。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所含的糖胺聚糖的濃度至少為50U/ml。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述肝素的分子量為從12,000到15,000kDa。
39.權(quán)利要求35的方法，其中所述肝素的硫酸化程度是藥用可接受的。
40.權(quán)利要求34的方法，其中同時(shí)施用糖胺聚糖與生物分子。
41.權(quán)利要求34的方法，其中在施用生物分子之前施用糖胺聚糖。
42.權(quán)利要求34的方法，其中在施用生物分子之后施用糖胺聚糖。
43.權(quán)利要求24的方法，其中頭部或頸部的動(dòng)脈被阻斷1分鐘到120分鐘。
44.權(quán)利要求24的方法，其中頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈或頸動(dòng)脈。
45.權(quán)利要求24的方法，其中頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈。
46.權(quán)利要求24的方法，其中生物分子被施用到頸動(dòng)脈、丘腦內(nèi)、腦室或鞘內(nèi)。
47.權(quán)利要求24的方法，其中生物分子被施用到頸動(dòng)脈。
48.一種將生物分子輸送到腦部的試劑盒，包括A)一種生物分子；以及B)一個(gè)說(shuō)明用于施用生物分子的方法的說(shuō)明書(shū)，其中方法包括1)短暫阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈；2)在阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈期間將生物分子施用到腦部。
49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中生物分子選自由核酸、多肽、脂類及其復(fù)合分子所構(gòu)成的組。
50.權(quán)利要求48的試劑盒，其中生物分子包括核酸。
51.權(quán)利要求48的試劑盒，其中生物分子是一種編碼一種由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)所構(gòu)成的組的基因的核酸。
52.權(quán)利要求48的試劑盒，其中核酸經(jīng)一種載體輸送。
53.權(quán)利要求48的試劑盒，還包括一種病毒包膜。
54.權(quán)利要求53的試劑盒，其中病毒包膜是滅活的。
55.權(quán)利要求53的試劑盒，其中病毒包膜是一種RNA病毒的包膜。
56.權(quán)利要求53的試劑盒，其中病毒包膜是一種屬于副粘病毒屬的病毒的包膜。
57.權(quán)利要求53的試劑盒，其中病毒包膜是一種HVJ的包膜。
58.權(quán)利要求48的試劑盒，還包括一種糖胺聚糖。
59.權(quán)利要求58的試劑盒，其中糖胺聚糖是肝素。
60.權(quán)利要求58的試劑盒，其中糖胺聚糖的分子量至少是10,000kDa。
61.權(quán)利要求58的試劑盒，其中所含的糖胺聚糖的濃度至少是50U/ml。
62.權(quán)利要求59的試劑盒，其中肝素的分子量為12,000到15,000kDa。
63.權(quán)利要求59的試劑盒，其中所述肝素的硫酸化程度是藥用可接受的。
64.權(quán)利要求58的試劑盒，其中同時(shí)施用糖胺聚糖與生物分子。
65.權(quán)利要求58的試劑盒，其中在施用生物分子之前施用糖胺聚糖。
66.權(quán)利要求58的試劑盒，其中在施用生物分子之后施用糖胺聚糖。
67.權(quán)利要求48的試劑盒，其中頭部或頸部的動(dòng)脈被阻斷1分鐘到120分鐘。
68.權(quán)利要求48的試劑盒，其中頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈或頸動(dòng)脈。
69.權(quán)利要求48的試劑盒，其中頭部或頸部的動(dòng)脈是大腦中動(dòng)脈。
70.權(quán)利要求48的試劑盒，其中生物分子被施用到頸動(dòng)脈、丘腦、腦室內(nèi)或鞘內(nèi)。
71.權(quán)利要求48的試劑盒，其中生物分子被施用到頸動(dòng)脈。
72.一種生物分子在生產(chǎn)一種用于將該生物分子輸送到腦部的試劑盒中的用途，該試劑盒包括A)該生物分子；以及B)一說(shuō)明用于施用該生物分子的方法的說(shuō)明書(shū)，其中方法包括a)短暫阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈；以及b)在頭部或頸部的動(dòng)脈被阻斷期間，將該生物分子導(dǎo)入到腦部。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)腦部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效輸送方法，并提供使用病毒包膜的有效輸送方法。本發(fā)明提供了一種用于將生物分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的體系，包括A)一種生物分子；B)一種病毒包膜；以及C)糖胺聚糖。另外，本發(fā)明提供了一種將生物分子輸送到腦部的方法，其包括以下步驟A)短暫地阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈；以及B)在阻斷頭部或頸部的動(dòng)脈期間將生物分子導(dǎo)入到腦部。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1697879SQ03824690
公開(kāi)日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2003年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月27日
發(fā)明者金田安史, 森下龍一, 島村宗尚 申請(qǐng)人:安琪士多摩奇株式會(huì)社