專利名稱：診斷馬流感病毒和鑒定其亞型的多重rt-pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒和其亞型的診斷和鑒定方法，尤其涉及一種診斷馬流感病 毒和鑒定其亞型的多重RT-PCR方法，屬于病毒分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬流感病毒(equine influenza virus, EIV )屬于A型流感病毒，引起馬屬動物 流行性感冒，還可感染狗等動物(Crawford P C, Edward J D, William L C, et al. Transmission of equine influenza virus to dogs[J]. Science. 2005.310:482-85; Kuiken T， Edwed C H, John M, et al. Host species barriers to influenza virus infections. Science[J]. 2006. 312:394-97.)。流感病毒基因組包括M基因、HA基因和NA基因在內(nèi)的8個 負鏈單股RNA片段組成。其中M基因組序列高度保守，HA和NA基因組則可變 性很強，其某些位點的變異可導(dǎo)致不同病毒亞型的出現(xiàn)。雖然流感病毒可以分為15 個HA亞型，9個NA亞型，但是，目前為止，EIV只發(fā)現(xiàn)H3N8和H7N7兩種亞型， 從上世紀九十年代開始，世界各地發(fā)現(xiàn)的EIV分離抹均為H3N8亞型(Newton JR.， Daly J M., Spencer L., et al. Description of the outbreak of equine influenza (H3N8) in the United Kingdom in 2003, during which recently vaccinated horses in Newmarket developed respiratory disease[J]. Vet Rec, 2007，158(6):185-92; M artella V., Elia G., Decaro N., et al. An outbreak of equine influenza virus in vaccinated horses in Italy is due to an H3N8 stain closely related to recent North American representatives of the Florida sub-lineage[J]. Vet. Microbiol, 2007,121:56-63; Damiani A M, Scicluna M T, Ciabatti I, Genetic characterization of equine influenza viruses isolated in Italy between 1999 and 2005[J]. Virus Res， 2008. 131(1):跳5.)，雖然不同分離林之間存在抗原漂 移現(xiàn)象，但是，病毒各段基因的同源性均在90%以上。馬流感病毒在亞型分類上具有自己的特點，至今只發(fā)現(xiàn)存在H3N8和H7N7兩 種亞型，而且，近二十年來世界各地分離到的流行抹均為H3N8亞型，部分研究人 員認為H7N7亞型已經(jīng)絕跡。根據(jù)馬流感病毒的這一特點，可以利用PCR這一專門 針對基因診斷的技術(shù)，建立快速、特異的檢測方法。病毒分離、血清學(xué)試驗至今仍是針對馬流感診斷和對EIV進行定型普遍采用的方法,但這些方法操作比較復(fù)雜，不能對病毒進行快速診斷，不利于馬流感的及時有效防制(Quinlivan M， Cullinane A, Nelly M， et al. Comparison of sensitivities of virus isolation, antigen detectoion, and nucleic acid amplification for detection of equine influenza virus[J]. J. Cli. Micro. 2004. Vol.42,No.2:759-63.)。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR) 可以在數(shù)小時內(nèi)對某tt因進行擴大數(shù)百萬倍。該技術(shù)特異性強、敏感性高、檢測 快速，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域。多重PCR是一種特殊PCR形式，其最突 出特點是一次PCR可同時檢測多種基因，尤其適用于流感病毒的診斷(Poddar S K， Espina R, Schnurr D P, et al. Evaluation of a single step multiplex RT-PCR for influenza virus type and subtype detection in respiratory samples[J]. J. Clin. Lab. Anal. 2002， 16(3》163-66; Choi Y K, Goyal S M, Kang S W, et al. Detection and subtyping of swine influenza H1N1, H1N2 and H3N2 viruses in clinical samples using two multiplex RT-PCR assays[J]. J. Virol. Methods. 2002. 102(l-2):53-59; Shan S， Ko L S， Richard A C, et al. Comparison of nucleic acid-based detection of avian influenza H5N1 with virus isolation[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2003. 302:377-83.)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種診斷馬流感病毒和鑒定其亞型的方法，該方法敏 感性強、特高，可以快速、準確的對EIV進行診斷和亞型鑒定。 本發(fā)明的主要目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種診斷馬流感病毒和鑒定其亞型的多重RT-PCR方法，包括以待檢樣品的 RNA為模板，以SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4兩 組核苷酸序列為多重引物進行RT-PCR反應(yīng)；如果從待檢測的樣品中只擴增出了 227bp的產(chǎn)物，則該樣品為EIV的H7N7亞型；如果從待檢測的樣品中同時擴增出 了 227bp和595bp的產(chǎn)物，則該樣品為EIV的H3N8亞型；如果從待檢測的樣品中 未擴增出227bp的產(chǎn)物，則該樣品不含有EIV。本發(fā)明通過對數(shù)十株H3N8亞型馬流感病毒HA基因的序列同源性比較，發(fā)現(xiàn) 各株H3H8亞型馬流感病毒HA基因的同源性在90 %至99 %之間，而且在HA2基 因中存在700bp左右的相對保守序列，通過研究比對，在本發(fā)明中所選取的HA基 因特異引物HF/HR ( SEQ ID NO:l/ SEQ ID NO:2 )與現(xiàn)有H3H8亞型馬流感病毒的同源性在95%以上，與H7N7亞型馬流感病毒的沒有同源性，因此，該引物可以用 于對EIV亞型的初步診斷。流感病毒的M基因比較保守，被普遍用于流感病毒的 初步診斷，本發(fā)明通過對數(shù)十抹馬流感病毒M基因的分析，設(shè)計了 MF/MR引物 (SEQ ID NO:3/ SEQ ID NO:4 ),其中MF引物與其它EIV的M基因同源性99%以 上，與禽流感等流感病毒M基因同源性為85 % - 95 % ， MR引物與其它EIV的M 基因同源性99%以上，與禽流感等流感病毒M基因同源性為85%以下。綜合上述， 本發(fā)明所設(shè)計的兩對引物可以用于馬流感病毒的PCR診斷以及亞型的初步鑒定。通過對不同溫度PCR條件的摸索，發(fā)現(xiàn)本試驗使用的引物特異性非常好，在 48。C到56。C之間均能擴增出目的片段，而且產(chǎn)量沒有很大差別。本發(fā)明對PCR反應(yīng)條件進行了優(yōu)化和篩選，設(shè)計常規(guī)PCR反應(yīng)條件，分別使 用48.8。C、 51.2°C、 53.6°C、 55.9。C試驗最佳退火溫度，分別使用25次、30次、35 次試驗最佳循環(huán)次數(shù)。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。對不同PCR退火溫 度和循環(huán)數(shù)進行試驗，試驗的4個退火溫度、3種循環(huán)數(shù)均能擴展得到目的片段， 其中，53.6。C為最佳退火溫度，30次循環(huán)與35次循環(huán)的擴展效果相差不大。雖然 使用35個循環(huán)會提高PCR量，但是為了節(jié)省時間，本發(fā)明選擇30個循環(huán)作為PCR 條件。簡單的PCR條件使本試驗對檢測條件的要求更加簡單，有利于在現(xiàn)地進行檢測 工作。本試驗的敏感性試驗結(jié)果顯示，本方法對EIVRNA的最低監(jiān)測量為0.15ng， 而通常樣品采集后鼻拭子提取液可以獲得至少10ug/ml濃度的RNA,因此，本方法 的敏感性足夠?qū)ΜF(xiàn)地采集的樣品進行檢測，使用此方法可以在第一時間對病原進行 判斷，避免了對病毒分離繁殖的麻煩。特異性試驗結(jié)果顯示，本發(fā)明多重RT-PCR方法對H3N8亞型EIVRNA可以同 時擴增出227bp和595bp兩條DNA片段，對H7N7亞型EIV只擴增出227bp的片 段，而對馬動脈炎病毒、馬傳貧病毒均無擴增產(chǎn)物。從而證明本發(fā)明方法具有良好 的特異性。對能夠分離到EIV的鼻拭子進行RT-PCR檢測，所有樣品均檢測為陽性，這與 病原分離結(jié)果一致，符合率為100%。說明本發(fā)明所建立的多重RT-PCR方法適合 于EIV的臨g測和亞型鑒定。由于該方法不需多次進行PCR就可以在幾個小時 內(nèi)一次性完成鑒定工作，因此非常有利于EIV的快速診斷和亞型鑒定，為馬流感的 有效控制爭取寶貴時間?？傊景l(fā)明根據(jù)RT-PCR技術(shù)原理，根據(jù)EIV只有兩種HA亞型的特點，建 立了多重RT-PCR檢測技術(shù)，其敏感性強、特異性高，可以用于EIV的快速診斷和 亞型鑒定。


圖1 RT-PCR優(yōu)化試驗結(jié)果；1:DL2000 Marker; 2-5:退火溫度分別為48.8°C、 51.2°C、 53.6°C、 55.9°C， 25個循環(huán);6-9:退火溫度分別為4S.8。C、 51.2。C、 53.6°C、 55.9°C, 30個循環(huán)；10-13:退火溫度分別為48.8°C、 51.2°C、 53.6°C、 55.9°C， 35 個循環(huán)。圖2 RT-PCR特異性試驗結(jié)果；1: DL2000 Marker; 2:以H3N8亞型EIV RNA 為模板；3:以H7N7亞型EIVRNA為模板;.4:以EAVRNA為模板；5:以EIAV RNA為模板。圖3 RT-PCR敏感性試驗結(jié)果；1: DL2000 Marker; 2 - 13:濃度150ug/ml的 EIV尿嚢液RNA分別稀釋2^2^倍RT-PCR產(chǎn)物。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述 而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方 案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。1材料與方法1.1試驗用毒抹及病料采集H3N8亞型EIV分離抹A/equine/XinjiangFuyun/3/2007由本實驗室從發(fā)病馬鼻咽 拭子提取物經(jīng)雞胚分離得到。H7N7亞型EIV分離抹A/叫uine/Beijing/1/1974、馬動 脈炎病毒(EAV)馬傳染性貧血病毒(EIAV)由本實驗室保存。分離病原用病料為馬鼻咽部提取物，將棉拭子經(jīng)前側(cè)鼻道伸入馬鼻咽部，沾取 呼吸道粘液，制備鼻咽拭子若干個，保存于含雙抗的磷酸鹽緩沖液中，每管中約含 4 5ml緩沖液，4。C冰盒保存空運至實驗室。-80"保存。1.2引物設(shè)計與合成分析了 GENBANK中數(shù)十林EIV的HA基因和M基因序列，選取了 H3N8亞型EIVHA基因HA2部分的一段0.6kb序列，以及M基因中的一段0.3kb序列作為 擴增目標，設(shè)計合成了兩對引物。HF: 5' AATTCATCACCC GAG TTC AA3' ( SEQ IDN0:1), HR: 5'TTT CATTAATCT GGT CGATGG C 3' (SEQIDN0:2), MF: 5'ACTGTGACAACCGAAGTG3' (SEQIDNO:3),魔5'TGC CTG GCC TTA CTA GC 3' ( SEQ ID NO:4 )。目的擴增片段長度為595bp和227bp。 1.3病毒RNA的提取將鼻咽拭子保存液或EIV分離尿嚢液于4°C高速離心，取上清液250ul樣品加 入500ulTrizo1試劑(Invitrogen 7>司產(chǎn)品)，混勻后靜置5分鐘，加入400ul氯仿， 振蕩混勻lmin， 12000rpm于4。C離心15min,取上清加入等體積異丙醇，顛倒混勻， 4。C放置15min, 12000rpm于4°C離心15min,棄上清，用70%乙醇洗沉淀，12000rpm 于4°C離心5min,用20ul DEPC水重懸沉淀。1.4 RT-PCR擴增反轉(zhuǎn)錄引物使用HF和MF引物各2pmo1，病毒RNA lul，使用INVITROGEN 公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat.Nos.28025-013 )，共20ul體系，過程參考說明書進 行。PCR使用50ul反應(yīng)體系，包括20ul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，luIHF(10pM)， lulHR(10pM), lul MF(10pM)， lul MR(10pM)， 0.25ul rTaq DNA聚合酶(Takara產(chǎn)品)，5ul緩沖 液(Takara)， 4ul dNTP (Takara),用水補齊體積。設(shè)計常規(guī)PCR反應(yīng)條件，分別 使用48.8。C、 51.2°C、 53.6°C、 55.9。C試驗最佳退火溫度，分別使用25次、30次、 35次試驗最佳循環(huán)次數(shù)。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。選出最佳PCR 條件。1.5特異性試驗用本方法檢測H7N7亞型EIV、馬動脈炎病毒(EAV)和馬傳染性貧血病病毒 (EIAV),分析本方法對其它亞型EIV以及其它馬屬動物常見病毒的檢測情況。 1.6敏感性試驗使用血凝效價為25EIV病毒尿嚢液，按照1.3中方法提取病毒RNA,測定濃度， 2倍系列稀釋后使用1.4中鑒定得到的最佳RT-PCR條件進行擴增，探討該方法可檢 測RNA的最低量。1.7臨床應(yīng)用試-驗對已經(jīng)從中分離到H3N8亞型EIV的馬鼻拭子提取物原始保存液使用本方法鑒 定，比豐支檢測結(jié)果的符合率。2試驗結(jié)果2.1 RT-PCR的建立對不同PCR退火溫度和循環(huán)數(shù)進行試驗，試驗的4個退火 溫度、3種循環(huán)數(shù)均能擴展得到目的片段，53.6。C為最佳退火溫度，30次循環(huán)與35 次循環(huán)的擴展效果相差不大(圖1 )。2. 2特異性試驗使用95。C5min預(yù)變性，94。C30s, 53.6。C40s， 72。C40s, 30個循環(huán)，72。C延伸 10min的PCR條件，以H3N8亞型EIV為模板可以擴展得到595bp和227bp兩條目 的片段，以H7N7亞型EIV為模板可以擴展得到 一條227bp片段，以EAV和EIAV 為模板不能擴增得到任何片段(圖2)。2. 3敏感性試驗取血凝效價為25馬流感病毒尿囊液250111,使用TRIZOL試 劑提取RNA，終濃度為150ug/ml， 2倍系列稀釋后，每個RT反應(yīng)使用lul模板， 可以檢測到2"稀釋度樣品。即本試驗可以檢測核酸最低量約為0.15ng (圖3 )。2. 4臨床應(yīng)用試驗對已經(jīng)從中分離到H3N8亞型EIV的IO份馬鼻拭子提取 物原始保存液使用本方法鑒定，均可同時得到兩條目的片段。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>診斷馬流感病毒和鑒定其亞型的多重RT-PCR方法<130〉 KIP翻6<160〉 4<170〉 Patentln version 3. 5<210> 1 <211〉 20 <212>腿<213> artifical sequence <400> 1aattcatcac ccgagttcaa 20<210> 2 <211> 22 <212> DNA<213> artifical sequence <400> 2tttcattaat.ctggtcgatg gc 22<210> 3 <211> 18 <212> DNA<213> artifical sequence <400> 3 ,actgtgacaa ccgaagtg L8<210> 4 <211> 17 <212> ■<213〉 artifical sequence <400〉 4tgcctggcct tactagc 1權(quán)利要求
1、一種診斷馬流感病毒和鑒定其亞型的多重RT-PCR方法，包括以待檢樣品的RNA為模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4兩組核苷酸序列為多重引物進行RT-PCR反應(yīng)；如果從待檢測的樣品中只擴增出了227bp的產(chǎn)物，則該樣品為馬流感病毒的H7N7亞型；如果從待檢測的樣品中同時擴增出了227bp和595bp的產(chǎn)物，則該樣品為馬流感病毒的H3N8亞型；如果從待檢測的樣品中未擴增出227bp的產(chǎn)物，則該樣品不含有馬流感病毒。
2 、按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的退火溫度選自 48.8°C、 51.2°C、 53.6。C或55.9°C。
3、 按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的退火溫度是 53.6。C。
4、 按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)為30 次循環(huán)或35次循環(huán)。
5、 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)為30 次循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種診斷馬流感病毒(EIV)和鑒定其亞型的多重RT-PCR方法，包括以待檢樣品RNA為模板，以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4兩組核苷酸序列為多重引物進行RT-PCR反應(yīng)；如果從樣品中只擴增出了227bp的產(chǎn)物，則該樣品為EIV的H7N7亞型；如果同時擴增出了227bp和595bp的產(chǎn)物，則該樣品為EIV的H3N8亞型；如果未擴增出227bp的產(chǎn)物，則該樣品不含有EIV。本發(fā)明根據(jù)RT-PCR技術(shù)原理，根據(jù)EIV只有兩種HA亞型的特點，建立了多重RT-PCR檢測方法，其敏感性強、特異性高，可以用于EIV的快速診斷和亞型鑒定。
文檔編號C12Q1/70GK101328508SQ200810132409
公開日2008年12月24日 申請日期2008年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月15日
發(fā)明者周建華, 戴伶俐, 李雪峰, 相文華, 趙利平, 巍 郭 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所