專利名稱：：抗菌肽cad在枯草桿菌中的分泌表達(dá)及重組枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)抗菌肽CAD的方法，具體講涉及一種以重組枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽CAD的方法。
背景技術(shù)：
：昆蟲(chóng)抗菌肽是一類堿性小分子多肽，具有熱穩(wěn)定性、誘導(dǎo)源的非專一性和廣譜的殺菌作用，極有希望開(kāi)發(fā)成一類新型的多肽抗生素。己知當(dāng)某些致病菌侵染天蠶(0/0/7/20racecra;z'a)后，可在其血淋巴中誘導(dǎo)產(chǎn)生溶菌酶、Attacin及天蠶素(Cecropin)等三大類包括大約15—20種具有殺菌活性的蛋白質(zhì)(HultmarkD.etal,Eur.J.Biochem.106:7-16,1980)。基于一級(jí)結(jié)構(gòu)的小的差異，天蠶素被分為A、B和D三種類型(HultmarkD.etal，1980，文獻(xiàn)同上)。另外，也已從中國(guó)柞蠶中分離到一系列類似的抗菌肽。這些來(lái)自不同昆蟲(chóng)的對(duì)植物病原菌有殺傷作用的肽在本文中統(tǒng)稱為抗菌肽，它們之間的氨基酸序列有較高的相似性，分子富含親水性氨基酸殘基，特別是富含賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸；而C端則包含較多的疏水性殘基。另外，發(fā)現(xiàn)在這類肽的許多特定位置上帶有保守的氨基酸殘基，如2位上的色氨酸；5、8和9位上的賴氨酸，以及11和20位上的天冬氨酸等(SteinerH.etal，Nature292:246-248,1981)。由于抗菌肽在殺菌、抗腫瘤甚至抑制病毒復(fù)制方面具有較大的應(yīng)用潛力，因此國(guó)內(nèi)外在抗菌肽的基因工程方面開(kāi)展了不少研究工作，有關(guān)抗菌肽基因在大腸埃希氏菌、酵母、以及昆蟲(chóng)桿狀病毒載體中的表達(dá)研究均已有報(bào)道。在"天蠶抗菌肽AD基因在AcNPV載體系統(tǒng)中的表達(dá)研究"(黃亞?wèn)|，中國(guó)抗生素雜志，28:304-307,2003)—文中報(bào)道了一種利用昆蟲(chóng)桿狀病毒載體系統(tǒng)在昆蟲(chóng)培養(yǎng)細(xì)胞和蟲(chóng)體中表達(dá)多肽抗生素天蠶抗菌肽AD(cecropinAD,CAD)的方法。其實(shí)驗(yàn)采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)點(diǎn)突變技術(shù)改造CAD基因，改造后的CAD基因先克隆到質(zhì)粒pGEM-Teasyvector中進(jìn)行鑒定和序列分析，然后亞克隆到苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒AcNPV表達(dá)載體pAcGP67B中獲得重組病毒載體。用重組病毒載體和野生AcNPVDNA共感染草地夜蛾Sf9細(xì)胞，篩選得到重組病毒。以重組病毒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞和苜蓿丫紋夜蛾幼蟲(chóng)，抑菌活性試驗(yàn)CAD基因在昆蟲(chóng)桿狀病毒載體系統(tǒng)獲得了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有抑菌活性。在"抗菌肽AD基因的改造及在畢赤酵母中的表達(dá)"(黃亞?wèn)|，華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，30:13-16，2003)—文中報(bào)道了一種采用PCR技術(shù)改造抗菌肽AD基因，將其C末端改造為Asn編碼，改造后的抗菌肽CecropinAD基因克隆到pPICZ-A載體上，構(gòu)建成酵母重組分泌型表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化畢赤酵母Pichiapastoris受體菌GS115中。采用zerocin抗性標(biāo)記篩選重組轉(zhuǎn)化子，經(jīng)搖瓶發(fā)酵，濃縮發(fā)酵液進(jìn)行酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和抑菌活性檢測(cè)。結(jié)果表明，改造后的CecropinAD基因在畢赤酵母中獲得了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)信號(hào)肽引導(dǎo)分泌到胞外，具有較強(qiáng)的殺菌活性。專利ZL96100376.6公開(kāi)了四種具有抗菌活性的多肽或其功能的衍生物及其生產(chǎn)抗菌肽的方法，其中培養(yǎng)細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。以上文獻(xiàn)和專利公開(kāi)的生產(chǎn)抗菌肽的方法，采用了在病毒、大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)目的基因。而使用病毒載體系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，條件不易于控制，不適合大規(guī)模生產(chǎn)；由于抗菌肽會(huì)對(duì)大腸桿菌等細(xì)菌具有抑制作用，因此難以使用原核生物中的大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)；抗菌肽雖然對(duì)真核細(xì)胞沒(méi)有抑制作用，但研究表明抗菌肽在酵母中表達(dá)很難實(shí)現(xiàn)酵母的高密度培養(yǎng)，對(duì)提高表達(dá)量有較大影響，此外，抗菌肽在酵母中表達(dá)酰胺化不完全，對(duì)其殺菌活性有一定影響，同時(shí)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高的缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容7本發(fā)明的目的在于提供一種廣譜抗菌的抗菌肽CAD的基因工程生產(chǎn)方法，以克服當(dāng)前抗菌肽產(chǎn)業(yè)化的諸多問(wèn)題，為臨床上的疾病防治和治療提供一種價(jià)格便宜、抗菌力強(qiáng)的藥物，也可用作無(wú)危害的飼料添加劑。而目前還沒(méi)有用枯草桿菌表達(dá)抗菌肽CAD的報(bào)道?？莶輻U菌是一種原核細(xì)胞，具有培養(yǎng)條件易于控制，繁殖速度快，分泌量高的特點(diǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為1.sumo蛋白酶的表達(dá)操縱子、釀酒酵母小分子泛素樣蛋白和天蠶素AD的融合蛋白表達(dá)操縱子基因合成a)人工合成含編碼sumo蛋白酶的表達(dá)操眾子基因，其核苷酸序列為:1020304050atggtcagcatccgccgceigcttcgaagcgtatgtcgatgacatgaatat60708090100cattactgttctgattcctgctgaacaaasggaaatcatgcttgttccgg110120130140150aacttaatgaaaaagatgatgatcaagttctgcatctaga160170180190200gaaaatacacaacttatgaatagagataatattgaaattacagttagaga210220230240250ttttaaaacacttgc3ccgagaagatggcttaatgatacaattattgaat260270280290300tttttatgaaatatattgaa犯atctac3ccgaatacagttgcatttaat310320330340350tcttttttttatacaaatctttctgaaagaggctatcaaggcgttagaag360370380390400atggatgaaaagaaaaaaaacacEiaattgEitaaacttgataaaattttta410420430440450caccgattaatcttaatcaatctcattgggcacttggcattattgatctt460470480柳500aaaaaaaaaacaattggctatgttgattctctttctaatggcccgaatgc510520530540550aatgtcttttgcaattcttaC3gatcttcaaaaatatgttatggaagaat560570580590600ctaaacatacaattggcgaagattttgatcttattcatcttgattgcccg610620630640650caacaaccgaatggctatgattgcggcatttatgtttgcatgaatacact660670680690700ttatggctctgcagatgcaccgcttgattttgattataaagatgcaatta710720730740747gaatgagaagatttattgcacatcttattcttacagatgcacttaaab)人工合成含編碼釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與天蠶素AD的融合蛋白表達(dá)操縱子基因，其核苷酸序列為1020304050taaaaaaaacgctcacatga鵬ggcgttttttttatacaaaaaaacgc60708090100actgatttacaaaaccttaacattcggttca肌ccctttttacatagaac110120130140150ctttactctatacgtgtaggacaaattacaC3ttatacgcaggggatggt160170180190200cagcatccgccgcagcttcgaagcgtatgtcgatgacatgaatatcatt3210220230240250ctgttctgattcctgctgaacaasaggasatcatgatgtctgcaaatcaa260270280290300gaagaagataaaasaccgggcgatggcggcgcacatattaatcttaaagt310320330340350taaaggccaagatggcaatgaagttttttttagaattaaaagaagcacac3603703803卯400aacttaaaaaacttatgaatgcatattgcgatagacaatctgttgatatg4104204304404503atagcattgcatttctttttgatggcagaagacttagag460470480490500accggatgaacttgatatggaagatggcgatgaaattgatgcaatgcttc510520530540550atcaaacaggcggcagcggcggcggcgcaacagcaaaatggaaacttttt560570580590600aaaaaaattgaaaaagttggcca犯gagttagagatgcagttatttctgc610620630640650aggcccggcagttgcaacagttgcacaagcsac3gcacttgcaaaataaa6606706806卯700aggagctgaccgaacagggcagctccttteatagcactttgccactcatt710720730738ttttgcgttagcaaaaacataaagggtatgggatataac)將所述步驟a)中人工的基因片段用/和5ami//雙酶切，將所述步驟b)中人工的基因片段用萬(wàn)"wiZ/和&^/雙酶切，構(gòu)建入載體pBluescriptIISK(+)，構(gòu)建成命名為D1778-l的質(zhì)粒。2.天蠶素AD母體基因枯草桿菌表達(dá)載體pNFll的構(gòu)建；提取枯草桿菌168菌株的基因組DNA，擴(kuò)增出枯草桿菌的高效啟動(dòng)子p43，通過(guò)T載體克隆后測(cè)序得到完整的含啟動(dòng)子基因質(zhì)粒，構(gòu)建入質(zhì)粒pGJ103，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGJ284;質(zhì)粒pGJ284和D1778-l分別用/和/進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，將兩個(gè)回收酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶在16'C水浴鍋連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pNFll。3.重組表達(dá)載體pNFll在枯草桿菌1A747的轉(zhuǎn)化將感受態(tài)枯草桿菌1A747與質(zhì)粒pNFll混合，轉(zhuǎn)移至0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2500V、5ms電擊，立即加入800ul預(yù)冷的枯草桿菌電轉(zhuǎn)恢復(fù)培養(yǎng)基LBSPG，于37°C、200rpm的條件恢復(fù)培養(yǎng)1小時(shí)，4500rpm離心集菌涂布于Cm5LB平板上，于37"C培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行五aW、S"c/雙酶切及PCR鑒定；鑒定擴(kuò)增出1300bp的克隆定義為pNFll-CADl、pNFll-CAD2、pNFll-CAD3、pNFll-CAD4的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。4.重組枯草桿菌在搖瓶中的誘導(dǎo)表達(dá)將篩選得到的pNFll-CADl、pNFll-CAD2、pNFll-CAD3、pNFll-CAD4的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種到25ml的LB培養(yǎng)基中，于32'C、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)812小時(shí)至600nm波長(zhǎng)處的吸光值(OD600)達(dá)到24，加質(zhì)量百分比濃度為30%麥芽糖5ml，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；于32°C、250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)2436小時(shí)后，調(diào)整pH至8.5、溫度25t培養(yǎng)812小時(shí)，10000rpm離心10分鐘收集培養(yǎng)液上清，即為獲得的抗菌肽CAD蛋白。本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)抗菌肽CAD的重組枯草桿菌表達(dá)載體，分類命名為枯草芽孢桿菌，拉丁文學(xué)名Sac///^w6rifo，保藏登記編號(hào)為CGMCCNo.2373，保藏日期為2008年2月21日，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。根據(jù)表達(dá)要求，針對(duì)性的對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程pH值設(shè)計(jì)了6個(gè)梯度(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，通過(guò)生長(zhǎng)曲線研究得出最佳調(diào)整發(fā)酵條件時(shí)間，在這6個(gè)pH條件下，36小時(shí)是菌體生長(zhǎng)最旺盛時(shí)期，因此該時(shí)期蛋白質(zhì)表達(dá)量最高。本發(fā)明人工設(shè)計(jì)合成包含有小分子泛素樣修飾物(smallubiquitin-relatedmodifier,SUMO)蛋白酶以及抗菌肽CAD與SUMO融合的雙順?lè)醋颖磉_(dá)元件基因，以質(zhì)粒pNFll-CAD為大腸桿菌一枯草桿菌穿梭載體，構(gòu)建了一個(gè)抗菌肽CAD的重組枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有優(yōu)良的質(zhì)粒穩(wěn)定性，以及SUMO-CAD蛋白偶合物能有效被分泌表達(dá)的SUMO蛋白酶水解成抗菌肽CAD。為了枯草桿菌能夠分泌具有活性構(gòu)象的抗菌肽CAD，采用與SUMO融合表達(dá)體系。由于融合表達(dá)后得到的CAD-SUMO融合體底物不具有抗菌肽活性，因此不會(huì)對(duì)枯草桿菌宿主菌產(chǎn)生毒害作用，能夠保證菌體較長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)表達(dá)融合體底物。伹是該底物需要由SUMO蛋白酶水解后，才能得到活性的抗菌肽CAD底物，而SUMO蛋白酶非常昂貴，所以我們采用讓宿主菌經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生SUMO蛋白酶的雙順?lè)醋颖磉_(dá)體系。重組CAD基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后，再經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后培養(yǎng)一定時(shí)間，調(diào)整SUMO蛋白酶水解需要的適宜條件，抗菌肽CAD能夠在枯草桿菌中獲得高效分泌表達(dá)。該系統(tǒng)解決了當(dāng)前抗菌肽產(chǎn)業(yè)化的諸多問(wèn)題化學(xué)合成肽類成本太高，產(chǎn)業(yè)化困難；抗菌肽的抗菌、抗病毒能力使其難以用常用的細(xì)菌、病毒作表達(dá)體系，抗菌肽分子量較小且容易被蛋白酶水解，以及融合表達(dá)誘導(dǎo)物成本昂貴；分離純化工藝復(fù)雜；基因表達(dá)產(chǎn)量不高。本發(fā)明的有益效果為1.表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單:本發(fā)明采用了抗菌肽CAD的重組枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)與SUMO融合表達(dá)體系，由于融合表達(dá)后得到的CAD-SUMO融合體底物不具有抗菌肽活性，因此不會(huì)對(duì)枯草桿菌宿主菌1A747產(chǎn)生毒害作用，因此可以使枯草桿菌持續(xù)表達(dá)，又不會(huì)抑制宿主細(xì)胞。2.本發(fā)明可用于大規(guī)模生產(chǎn)本發(fā)明采用枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)，相對(duì)于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和病毒表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)條件和步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件易于控制的優(yōu)點(diǎn)，因此適用于大規(guī)模的生產(chǎn)。3.生產(chǎn)成本低本生產(chǎn)方法中的培養(yǎng)基價(jià)格低廉，生產(chǎn)所用設(shè)備為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)備，易于操作。4.生物活性強(qiáng)，無(wú)毒害物質(zhì)本發(fā)明分泌的蛋白質(zhì)濃度高，生物活性強(qiáng)。圖1:抗菌肽CAD的抑菌圈圖l(l):重組枯草桿菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌K88的抑菌圈，如l所示；圖1(2):重組枯草桿菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈，如1所示；圖1(3):重組枯草桿菌發(fā)酵液對(duì)沙門氏桿菌的抑菌圈，如1和2所示；圖1(4):重組枯草桿菌發(fā)酵液對(duì)糞腸球菌的抑菌圈，如l、2和3所示；圖1(5):重組枯草桿菌發(fā)酵液對(duì)糞鏈球菌的抑菌圈，如l、2和3所示。圖2:抗菌肽CAD的16%Tris-tricineSDS-PAGE分析1:對(duì)照組1A747上清凍干樣品(0.25mg/ul);2:實(shí)驗(yàn)組上清凍干樣品(0.25mg/ul);3:MARK(KD):分子量(20.100，14.400,7.823,5.856,3.313);具體實(shí)施例方式實(shí)施例l1.sumo蛋白酶的表達(dá)操縱子、釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與天蠶素AD的融合蛋白表達(dá)操縱子基因合成l)人工合成含編碼sumo蛋白酶的表達(dá)操眾子基因，設(shè)計(jì)引物為Fl:GATAGCC通過(guò)5輪PCR合成；PCR反應(yīng)體系為引物對(duì)2fxl(10ixmol/L);5pJdNTPMixture(2.5mmol/L);5^110xBuffer;35.7fil無(wú)菌ddH20;PCR反應(yīng)條件94。C變性5min;緩慢降溫到55。C;分別加入0.3plPyrobestDNA聚合酶(5U4il);然后72'C延伸5min;2)人工合成含編碼釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與天蠶素AD的融合蛋白表達(dá)操縱子基因，設(shè)計(jì)引物為Fl:GGCCTTTA通過(guò)5輪PCR合成；PCR反應(yīng)體系為引物2fil(10(xmol/L)，5|JdNTPMixture(2.5mmol/L);5pl10xBuffer;35.7^1無(wú)菌ddH20;PCR反應(yīng)條件94X:變性5分鐘；緩慢降溫到55X:;分別加入0.3|11PyrobestDNA聚合酶(5U4il);然后72-C延伸5分鐘；3)人工合成的兩個(gè)片段連入pBluescriptIISK(+)載體將所述步驟l)中人工的基因片段用￡coi/和^7mi7/雙酶切，將所述步驟2)中人工的基因片段用5^7///和Sac/雙酶切，構(gòu)建入載體pBluescriptIISK(+)，構(gòu)建成命名為D1778-1的質(zhì)粒。2.天蠶素AD母體基因枯草桿菌表達(dá)載體pNFll的構(gòu)建；提取枯草桿菌168菌株的基因組DNA，擴(kuò)增出枯草桿菌的高效啟動(dòng)子p43，通過(guò)T載體克隆后測(cè)序得到完整的含啟動(dòng)子基因質(zhì)粒，構(gòu)建入質(zhì)粒pGJ103，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGJ284;質(zhì)粒pGJ284和D1778-l分別用￡co/I與SacI進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，將兩個(gè)回收酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶在16X:水浴鍋連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pNFll;其中PCR鑒定引物為Fl:CGTTTGCGCTTGTTCCGGAACRl:CTGCCGGGCCTGCAGAAATAACPCR擴(kuò)增體系質(zhì)粒pNF11模板2ul;dNTP，2.5mmol/L，3ul;LAtaq聚合酶buffer,2.5ul;Fl，L5ul;Rl，1.5ul;LAtaq聚合酶，0.3ul;滅菌超純水，14.2ul;PCR反應(yīng)條件94"C預(yù)變性3分鐘，進(jìn)入PCR循環(huán)94"C30秒，退火56°C30秒，72"C3分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72'C延伸10分鐘；擴(kuò)增出1300bp片段。3.重組表達(dá)載體pNFll在感受態(tài)枯草桿菌lA747中的轉(zhuǎn)化將感受態(tài)枯草桿菌1A74780nl，質(zhì)粒pNFll5pl相混合，轉(zhuǎn)移至0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2500V、5ms電擊，立即加入800ul預(yù)冷的枯草桿菌電轉(zhuǎn)恢復(fù)培養(yǎng)基LBSPG，于37°C、200rpm恢復(fù)培養(yǎng)1小時(shí)，4500rpm離心集菌涂布于Cm5LB平板上，于37'C培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行￡coR/、S^/雙酶切及PCR鑒定；鑒定擴(kuò)增出1300bp的克隆定義為pNFll-CADl、pNFll-CAD2、pNF11-CAD3、pNF11-CAD4的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。4.重組枯草桿菌在搖瓶中的誘導(dǎo)表達(dá)將篩選得到的pNFll-CADl、pNFll-CAD2、pNFll-CAD3、pNFll-CAD4的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種到25ml的LB培養(yǎng)基中，于32°C、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)至600nm波長(zhǎng)處的吸光值(OD600)達(dá)到24，加質(zhì)量百分比濃度為30%麥芽糖5ml，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；于32'C、250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)36小時(shí)后，調(diào)整pH至8.5、溫度25。C培養(yǎng)12小時(shí)，10000rpm離心10分鐘收集培養(yǎng)液上清，即為抗菌肽CAD。實(shí)施例2抗菌肽CAD抑菌活性的鑒定采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法，以大腸桿菌K88、金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)菌株，將供試菌懸浮液(OD600=0.2~0.3)20u1與55°C的LB固體培養(yǎng)基25ml混勻后平鋪板待其凝固后，用滅過(guò)菌的打孔器(直徑5mm)打孔，孔中滴加20們待測(cè)的表達(dá)上清，在37"C培養(yǎng)12h。大腸桿菌K88抑菌圈直徑9.3mm直徑的抑菌圈，殺菌活力X=(9.3mm-2.3mm)/2=3.5，殺菌效價(jià)(U/ml"7000U/ml;抑菌圈見(jiàn)圖l(l)所示，同樣表達(dá)條件下培養(yǎng)的1A747菌發(fā)酵液做抑菌圈陰性對(duì)照。金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑12.4mm直徑的抑菌圈，殺菌活力X=(12.4mm-2.3mm)/2=5.05;殺菌效價(jià)(U/ml)=11000U/ml;抑菌圈見(jiàn)圖1(2)所示。沙門氏桿菌抑菌圈直徑5.8mm直徑的抑菌圈，殺菌活力X二(5.8mm-2.3mm)/2=1.75;殺菌效價(jià)(U/ml)=3500U/ml;抑菌圈見(jiàn)圖1(3)所示。糞腸球菌抑菌圈直徑3.9mm直徑的抑菌圈，殺菌活力X=(3.9mm-2.3mm)/2=0.8;殺菌效價(jià)(U/ml)=1600U/ml;抑菌圈見(jiàn)圖1(4)所示。糞鏈球菌抑菌圈直徑6.1mm直徑的抑菌圈，殺菌活力X=(6.1mm-2.3mmy2=1.9;殺菌效價(jià)(U/ml)=3800U/ml;抑菌圈見(jiàn)圖1(5)所示。實(shí)施例3重組枯草桿菌所分泌抗菌肽CAD蛋白的Tris-tricineSDS-PAGE鑒定發(fā)酵上清液經(jīng)美國(guó)MILLIPORE截留分子量IOKD的超濾管超濾，然后用截留分子量2000的透析袋透析，再經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到枯草桿菌表達(dá)產(chǎn)物CAD，用16X的Tricine-SDS-PAGE方法進(jìn)行蛋白電泳分析及考馬斯亮藍(lán)G-250濃度測(cè)定。1.16%的聚丙烯酰胺凝膠(分離膠+濃縮膠)制備<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.電泳內(nèi)槽加入陰極緩沖液，外槽加入陽(yáng)極緩沖液，形成Tricine-SDS-PAGE電泳系統(tǒng)，用50v恒電壓5個(gè)小時(shí)，考馬斯亮蘭染色，用甘油孵育，并用凝膠成像儀攝影。待溴酚蘭指示劑離開(kāi)凝膠，停止電泳，按常規(guī)方法剝膠脫色。見(jiàn)附圖2。結(jié)果表明，重組枯草桿菌能明顯分泌表達(dá)出3.7KD左右的蛋白，與CAD蛋白的理論值一致。薄層凝膠掃描分析電泳結(jié)果圖，經(jīng)band5.0軟件分析估測(cè)所分泌表達(dá)的蛋白可占菌體上清總蛋白的39.9%。實(shí)施例4重組枯草桿菌分泌抗菌肽CAD蛋白含量的確定(BCA蛋白定量測(cè)定法)分別取同等條件發(fā)酵表達(dá)的重組枯草桿菌和1A747菌的發(fā)酵上清液，用美國(guó)MILLIPORE截留分子量10KD的超濾管超濾，而后用截留分子量2000的透析袋透析，按一定比例計(jì)算恢復(fù)到發(fā)酵液本身的蛋白含量測(cè)定。表lBCA蛋白定量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線<image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>注Y軸代表在562nm波長(zhǎng)測(cè)量的吸光度值，X軸代表BSA的終濃度X100ug/ml。BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程c;0.0456A+48.3(R二0.9992,r^3),線性范圍0—2000ug/ml。通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定，得到重組枯草桿菌目的蛋白抗菌肽CAD的分泌表達(dá)含量為1.08mg/ml。序列表<110>北京龍科方舟<120>抗菌肽CAD在枯草桿菌中的分泌表達(dá)及重組枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)<160><210>1<211>747<212>DNA<213>人工序列<220>747<221>gene<222>(1)..(747)<400>1atggtcagcatccgccgcagcttcgaagcgtatgtcgatgacatgaatatcattactgttctgattcctgctgaacaaaaggaaatcatgcttgttccggaacttaatgaaaaagatgatgatcaagttcaaaaagcacttgcatctagagaaaatacacaacttatgaatagagataatattgaaattacagttagagattttaaaacacttgcaccgagaagatggcttaatgatacaattattgaattttttatgaaatatattgaaaaatctacaccgaatacagttgcatttaattcttttttttatacaaatctttctgaaagaggctatcaaggcgttagaagatggatgaaaagaaaaaaaacacaaattgataaacttgataaaatttttacaccgattaatcttaatcaatctcattgggcacttggcattattgatcttaaaaaaaaaacaattggctatgttgattctctttctaatggcccgaatgcaatgtcttttgcaattcttacagatcttcaaaaatatgttatggaagaatctaaacatacaattggcgaagattttgatcttattcatcttgattgcccgcaacaaccgaatggctatgattgcggcatttatgtttgcatgaatacactttatggctctgcagatgcaccgcttgattttgattataaagatgcaattagaatgagaagatttattgcacatcttattcttacagatgcacttaaa<210>2<211><212>DNA<213>人工序列<220>738<221>gene<222>(1)..(738)<400>2taaaaaaaacgctcacatgatgtgggcgttttttttatacaaaaaaacgcactgatttacaaaaccttaacattcggttcaaaccctttttacatagaacctttactctatacgtgtaggacaaattacacattatacgcaggggatggtcagcatccgccgcagcttcgaagcgtatgtcgatgacatgaatatcattactgttctgattcctgctgaacaaaaggaaatcatgatgtctgcaaatcaagaagaagataaaaaaccgggcgatggcggcgcacatattaatcttaaagttaaaggccaagatggcaatgaagttttttttagaattaaaagaagcacacaacttaaaaaacttatgaatgcatattgcgatagacaatctgttgatatgaatagcattgcatttc飾gatggcagaagacttagagcagaacaaacaccggatgaacttgatatggaagatggcgatgaaattgatgcaatgcttcatcaaacaggcggcagcggcggcggcgcaacagcaaaatggaaactttttaaaaaaattgaaaaagttggccaaagagttagagatgcagttatttctgcaggcccggcagttgcaacagttgcacaagcaacagcacttgcaaaataaaaggagctgaccgaacagggcagctcctttaatagcactttgccactcattttttgcgttagcaaaaacataaagggtatgggatata<210>3<211><212>DNA<213>人工序列<220>59<221>gene<222>(1)..(59)<棚>3cttttttttatacaaatctttctgaaagaggctatcaaggcgttagaagatggatgaaa<210>4<211><212>DNA<213>人工序列<220>59<221>gene<222>(1).,(59)<400>4tcaagtttatcaatttgtgttttttttcttttcatccatcttctaacgccttgatagcc<210>5<211><212>DNA<213>人工序列<220>58<221>gene<222>(1)..(58)<400>5cgatggcggcgcacatattaatcttaaagttaaaggccaagatggcaatgaagttttt<210>6<211><212>DNA<213>人工序列<220>59<221>gene<222>(1)..(59)<400>6ttttaagttgtgtgcttcttttaattctaaaaaaaacttcattgccatcttggccttta<210>7<211><212>DNA<213〉人工序列<220>21<221>gene<222>(1)..(21)<400>7CGTTTGCGCTTGTTCCGGAAC<210>8<211><212>DNA<213>人工序列<220>22<221>gene<222>(1)..(22)<400>8cgtttgcgcttgttccggaac權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)抗菌肽CAD的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟1)sumo蛋白酶的表達(dá)操縱子、釀酒酵母小分子泛素樣蛋白和天蠶素AD的融合蛋白表達(dá)操縱子的基因合成；2)天蠶素AD母體基因枯草桿菌表達(dá)載體pNF11的構(gòu)建；3)重組表達(dá)載體pNF11在枯草桿菌1A747中的轉(zhuǎn)化；和4)重組枯草桿菌在搖瓶中的誘導(dǎo)表達(dá)。2.—種如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)抗菌肽CAD的方法，其特征在于所述步驟1)中sumo蛋白酶的表達(dá)操縱子、釀酒酵母小分子泛素樣蛋白和天蠶素AD的融合蛋白表達(dá)操縱子的基因合成包括以下步驟a)人工合成含編碼sumo蛋白酶的表達(dá)操眾子基因；b)人工合成含編碼釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與天蠶素AD的融合蛋白表達(dá)操眾子基因；和c)將所述步驟a)中人工的基因片段用/和雙酶切，將所述步驟b)中人工的基因片段用Baw/Z/和Sac/雙酶切，構(gòu)建入載體pBluescriptllSK(+)，構(gòu)建成命名為D1778-l的質(zhì)粒。3.—種如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)抗菌肽CAD的方法，其特征在于所述步驟2)中天蠶素AD母體基因枯草桿菌表達(dá)載體pNFl1的構(gòu)建包括以下步驟提取枯草桿菌168菌株的基因組DNA，擴(kuò)增出枯草桿菌的高效啟動(dòng)子p43,通過(guò)T載體克隆后測(cè)序得到完整的含啟動(dòng)子基因質(zhì)粒，構(gòu)建入質(zhì)粒pGJ103，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGJ284;將質(zhì)粒pGJ284和D1778-l分別用五coR/和&c/進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，將兩個(gè)回收酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶在16"C水浴鍋連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pNFll。4.一種如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)抗菌肽CAD的方法，其特征在于所述步驟3)中重組表達(dá)載體pNFll-CAD在枯草桿菌1A747中的轉(zhuǎn)化包括以下步驟將感受態(tài)枯草桿菌1A747和質(zhì)粒pNFll混合，轉(zhuǎn)移至0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2500V、5ms電擊，加入800ul預(yù)冷的枯草桿菌電轉(zhuǎn)恢復(fù)培養(yǎng)基LBSPG，于37°C、200rpm的條件下恢復(fù)培養(yǎng)1小時(shí)，4500rpm離心集菌涂布于Cm5LB平板上，于37。C培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行Ecoi7、雙酶切及PCR鑒定；鑒定擴(kuò)增出1300bp的克隆定義為pNF11-CAD1、pNFll-CAD2、pNFll-CAD3、pNFll-CAD4的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。5.—種如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)抗菌肽CAD的方法，其特征在于所述步驟4)中重組枯草桿菌在搖瓶中的誘導(dǎo)表達(dá)包括下步驟將篩選得到的pNFll-CADl、pNFll-CAD2、pNFll-CAD3、pNFll-CAD4的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種到25ml的LB培養(yǎng)基中，于32°C、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)812小時(shí)至600nm波長(zhǎng)處的吸光值達(dá)到24，加質(zhì)量百分比濃度為30%麥芽糖5ml，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；于32°C、250rpm的條件下振蕩培養(yǎng)2436小時(shí)后，調(diào)整pH至8.5、溫度25。C的條件下培養(yǎng)812小時(shí)，10000rpm離心10分鐘收集培養(yǎng)液上清，即為抗菌肽CAD蛋白。6.—種如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)抗菌肽CAD的方法，其特征在于所述步驟1)中合成的含編碼sumo蛋白酶的表達(dá)操眾子基因共有747bp，其核苷酸序列為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>7.一種如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)抗菌肽CAD的方法，其特征在于所述步驟2)中合成的含編碼釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與天蠶素AD的融合蛋白表達(dá)操眾子基因共有738bp，其核苷酸序列為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>8.一種表達(dá)抗菌肽CAD的重組枯草桿菌表達(dá)載體，其保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏登記編號(hào)為CGMCCNo.2373、由構(gòu)建的重組質(zhì)粒pNFll轉(zhuǎn)化枯草桿菌1A747所得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。全文摘要本發(fā)明涉及一種以重組枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)天蠶素CAD抗菌肽的方法，通過(guò)人工合成sumo蛋白酶的表達(dá)操縱子、釀酒酵母小分子泛素樣蛋白與天蠶素AD的融合蛋白表達(dá)操縱子基因，克隆天蠶素AD母體基因枯草桿菌表達(dá)載體pNF11，轉(zhuǎn)化重組表達(dá)載體pNF11-CAD，從而使重組枯草桿菌在搖瓶中誘導(dǎo)表達(dá)；本發(fā)明具有表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單，用于大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低，生物活性強(qiáng)，無(wú)毒害物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)；為臨床上的疾病防治和治療提供一種價(jià)格便宜、抗菌力強(qiáng)的藥物，也可作為飼料添加劑。文檔編號(hào)C12N15/62GK101307316SQ200810132258公開(kāi)日2008年11月19日申請(qǐng)日期2008年7月22日優(yōu)先權(quán)日2008年7月22日發(fā)明者姬生躍,宋青龍,岳隆耀,張建東,明耀華,潘寶海,王春平,祝發(fā)明,譙仕彥申請(qǐng)人:北京龍科方舟生物工程技術(shù)中心