專利名稱：一種枯草菌脂肽鈉的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體的說是涉及一種枯草菌脂肽鈉的純化方法。
背景技術(shù)：
表面活性劑(Surfactants)是指能顯著降低溶劑表面張力和液-液界面張力，并具有一定結(jié)構(gòu)、親水親油特性和特殊吸附性能的物質(zhì)，包括化學(xué)表面活性劑和生物表面活性劑。化學(xué)表面活性劑大都是以石油為原料化學(xué)合成而來，在生產(chǎn)和使用過程中常常會(huì)帶來嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。生物表面活性劑(Biosurfactants)是由微生物所產(chǎn)生的一類具有表面活性的生物大分子物質(zhì)，除了具有降低表面張力、穩(wěn)定乳化液和增加泡沫等相同作用外，還具有一般化學(xué)合成表面活性劑所不具備的特性，如具有結(jié)構(gòu)多樣性，較低的毒性， 較高的生物可降解性，良好的生物相容性，高的起泡性，對極端的溫度、PH值和鹽濃度有較高的選擇性和專一性，可以由低廉的可再生原料生產(chǎn)得到等特點(diǎn)，因此在環(huán)保、石油開采、 醫(yī)藥、食品加工等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用研究價(jià)值。
枯草菌脂肽鈉是枯草菌脂肽的鈉鹽，枯草菌脂肽譯為Surfactin，是一種由枯草芽孢桿菌合成的環(huán)肽，多以鈉鹽形式應(yīng)用。自1968年被Arima等人首次發(fā)現(xiàn)以來,Surfactin 一直是表面活性最強(qiáng)、研究較多的生物表面活性劑之一，被廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)、環(huán)境工業(yè)作為良好的生物相容性表面活性劑。除了具有較強(qiáng)的表面活性外，Surfactin還能增加憎水烴類的可生物降解性，在受烴類污染土壤和海洋的生物修復(fù)中發(fā)揮重要作用，它還能與部分重金屬結(jié)合而移除受污染土壤和沉積物中的重金屬，并具有一定的抗菌活性等。因此在環(huán)保、石油開采、高端化妝品、醫(yī)藥、食品加工等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用研究價(jià)值。
Surfactin生產(chǎn)成本較高，是化學(xué)生物表面活性劑的3 10倍，其中產(chǎn)物的提取和下游的處理費(fèi)用占生產(chǎn)費(fèi)用的絕大部分，尤其是在預(yù)處理枯草菌脂肽鈉發(fā)酵液時(shí)由于產(chǎn)品和菌體的特殊性導(dǎo)致發(fā)酵液粘度大，菌液分離成本高昂。因此，開發(fā)簡單廉價(jià)的產(chǎn)物分離和提純方法十分必要。
2000 年,Randhir 等提出通過泡沫回收分離 Surfactin。2007 年 Hue1-Li Chen 等利用酸沉淀和PVDF樹脂吸附對Surfactin進(jìn)行提純操作。2007年貢國鴻等人用高速離心機(jī)離心去除菌體，上清液酸化得Surfactin粗提物后進(jìn)行溶劑抽提。2008年Hue1-Li Chen 等又利用硫酸銨對Surfactin進(jìn)行混合鹽析,再通過超濾和納濾收集Surfactin。2008年 Mohd Hafez Mohd Isa等利用超濾膜過濾收集Surfactin。但以上工藝均為實(shí)驗(yàn)室手段，若進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)則成本較高。因此開發(fā)一種適合于工業(yè)化生產(chǎn)的簡單廉價(jià)的枯草菌脂肽鈉純化方法具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)均為實(shí)驗(yàn)室手段，生產(chǎn)成本高的缺陷，提供一種簡單廉價(jià)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)的枯草菌脂肽鈉的純化方法。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，`本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種枯草菌脂肽鈉的純化方法，包括步驟I :取枯草菌脂肽發(fā)酵液離心收集上清液，經(jīng)膜過濾后收集截留液；步驟2 :緩慢加入堿溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液干燥后獲得枯草菌肽鈉成品。進(jìn)一步的，本發(fā)明所述純化方法步驟I還包括在離心前對枯草菌脂肽發(fā)酵液進(jìn)行 預(yù)處理的步驟，所述預(yù)處理為將枯草菌脂肽發(fā)酵液稀釋1-10倍，調(diào)pH值調(diào)至6. 5-8. 5。作為優(yōu)選，步驟I所述枯草菌脂肽鈉發(fā)酵液離心的分離因數(shù)為5000_17000g。作為優(yōu)選，步驟I所述膜過濾的膜為陶瓷膜。作為優(yōu)選，步驟I所述膜過濾的膜溫度為10_50°C。作為優(yōu)選，步驟2所述中和反應(yīng)的溫度為20_55°C。作為優(yōu)選，步驟2所述堿溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉中的一種或幾種的 混合物。作為優(yōu)選，步驟I還包括離心除雜的步驟，所述離心除雜為取膜過濾所得截留液 調(diào)pH至5. 0-6. 6，離心收集上清液。作為優(yōu)選，步驟I還包括酸化沉淀步驟，所述酸化沉淀為取離心除雜所得上清液 加入酸溶液至PH值2. 0-5. O,收集沉淀。作為優(yōu)選，所述酸化沉淀步驟中所述酸溶液為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、鹽酸、乳酸、 蘋果酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、延胡索酸、山梨酸中的一種或幾種的混合物。本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化方法，首先利用離心去除枯草菌脂肽發(fā)酵液中 的菌體，然后利用一定孔徑的膜對離心所得上清液進(jìn)行過濾處理，最后將膜截留液加入堿 溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，干燥獲得枯草菌肽鈉成品。高效液相色譜法檢測純化后制得枯草菌脂 肽鈉成品純度達(dá)到75%-80%。為了進(jìn)一步提高枯草菌肽鈉成品純度本發(fā)明所述枯草菌脂 肽鈉的純化方法在膜過濾后采用離心去除枯草菌脂肽中混有的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，純度達(dá)到 80-85%，進(jìn)一步，用酸調(diào)節(jié)離心上清液pH值至枯草菌脂肽等電點(diǎn)，使枯草菌脂肽沉降下來， 使制得的枯草菌脂肽鈉成品純度達(dá)到85%-88%。本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化方法制得 枯草菌脂肽鈉成品純度可達(dá)75%-88%，可以作為化妝品添加劑廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例公開了一種枯草菌脂肽鈉的純化方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本 文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例 進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進(jìn)行 改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種枯草菌脂肽鈉的純化方法，包括步驟I :取枯草菌脂肽發(fā)酵液離心收集上清液，經(jīng)膜過濾后收集截留液；步驟2 :緩慢加入堿溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液干燥后獲得枯草菌肽鈉成品。目前枯草菌脂肽多采用發(fā)酵的方法制備得到，由于發(fā)酵液成分復(fù)雜，存在大量菌 體，而菌體自溶會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)增多，因此本發(fā)明所述純化方法首先利用離心去除發(fā)酵液中的 菌體，為提取和精制等后續(xù)工序創(chuàng)造有利條件。
枯草菌脂肽的等電點(diǎn)為2-5，在發(fā)酵液pH值接近枯草菌脂肽等電點(diǎn)時(shí)，部分枯草菌脂肽會(huì)沉淀析出從而與菌體混合，當(dāng)離心去除菌體時(shí)，析出的枯草菌脂肽與菌體混合在一起被離心除掉，造成枯草菌脂肽的損失，降低枯草菌脂肽的收率。因此為了避免枯草菌脂肽會(huì)沉淀析出，保證枯草菌脂肽的收率，本發(fā)明所述純化方法步驟I還包括在離心前對枯草菌脂肽發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理的步驟，所述預(yù)處理為將枯草菌脂肽發(fā)酵液稀釋1-10倍，調(diào)PH 值調(diào)至6. 5-8. 5。
離心就是利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強(qiáng)大的離心力，加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)和浮力密度的物質(zhì)分離開。衡量離心機(jī)分離性能的重要指標(biāo)是分離因數(shù)，它表示被分離物料在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)所受的離心力與其重力的比值，分離因數(shù)越大，通常分離也越迅速，分離效果越好。為了達(dá)到更好的去除菌體的效果，本發(fā)明所述純化方法步驟I所述枯草菌脂肽鈉發(fā)酵液離心的分離因數(shù)為5000g-17000g。
離心機(jī)的種類繁多，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述離心機(jī)為臥式離心機(jī)、三足式離心機(jī)、 袋式離心機(jī)、管式離心機(jī)、碟式離心機(jī)中的一種。
本發(fā)明所述純化方法在離心去除菌體后，利用分子易于聚合的特性，借助一定孔徑的膜對離心所得上清液進(jìn)行過濾處理。
膜過濾是一種與膜孔徑大小相關(guān)的篩分過程，以膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動(dòng)力，以膜為過濾介質(zhì)，在一定的壓力下，當(dāng)原液流過膜表面時(shí)，膜表面密布的許多細(xì)小的微孔只允許水及小分子物質(zhì)通過而成為透過液，而原液中體積大于膜表面微孔徑的物質(zhì)則被截留在膜的進(jìn)液側(cè)，成為截留液，因而實(shí)現(xiàn)對原液的分離純化的目的。
膜孔徑的選擇對膜過濾的分離純化效果具有重要影響。為了達(dá)到去除枯草菌脂肽中的小分子雜質(zhì)及色素的目的，本發(fā)明所述純化方法步驟I所述膜過濾的膜為陶瓷膜。
進(jìn)一步的，本發(fā)明所述陶瓷復(fù)合膜的孔徑優(yōu)選為10nm-800nm。更優(yōu)選為 20nm_100nm
陶瓷膜性能的發(fā)揮與溫度高低有直接的關(guān)系，因此，為了膜過濾的效果，本發(fā)明所述純化方法步驟I所述膜過濾的膜溫度優(yōu)選為10-50°C。
本發(fā)明所述純化方法步驟2將膜截留液加入堿溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，制得枯草菌肽鈉，干燥可獲得枯草菌肽鈉成品。其中所述中和反應(yīng)是指加入堿溶液反應(yīng)至中性，即反應(yīng)至 pH6. 5-8. 5ο
其中，作為優(yōu)選，所述中和反應(yīng)的溫度為20_55°C。
作為優(yōu)選，步驟2所述堿溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉中的一種或幾種的混合物。
干燥泛指從濕物料中除去水分或其他濕分的各種操作。如在日常生活中將潮濕物料置于陽光下曝曬以除去水分，工業(yè)上用硅膠、石灰、濃硫酸等除去空氣、工業(yè)氣體或有機(jī)液體中的水分。在化工生產(chǎn)中，干燥通常指用熱空氣、煙道氣以及紅外線等加熱濕固體物料，使其中所含的水分或溶劑汽化而除去，是一種屬于熱質(zhì)傳遞過程的單元操作。干燥的目的是使物料便于貯存、運(yùn)輸和使用， 或滿足進(jìn)一步加工的需要。根據(jù)熱量的供應(yīng)方式，有多種干燥類型①對流干燥使熱空氣或煙道氣與濕物料直接接觸，依靠對流傳熱向物料供熱，水汽則由氣流帶走。對流干燥在生產(chǎn)中應(yīng)用最廣，它包括氣流干燥、噴霧干燥、流化干燥、回轉(zhuǎn)圓筒干燥和廂式干燥等；②傳導(dǎo)干燥濕物料與加熱壁面直接接觸，熱量靠熱傳導(dǎo)由壁面?zhèn)鹘o濕物料，水汽靠抽氣裝置排出。它包括滾筒干燥、冷凍干燥、真空耙式干燥等；③ 輻射干燥熱量以輻射傳熱方式投射到濕物料表面，被吸收后轉(zhuǎn)化為熱能，水汽靠抽氣裝置排出，如紅外線干燥介電加熱干燥將濕物料置于高頻電場內(nèi)，依靠電能加熱而使水分汽化，包括高頻干燥、微波干燥。
其中，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述純化方法步驟2所述干燥為噴霧干燥。
本發(fā)明采用高效液相色譜法檢測本發(fā)明所述經(jīng)離心去除菌體、膜過濾處理、中和成鹽的步驟純化獲得的枯草菌肽鈉成品，純度可達(dá)75%-80%。
發(fā)酵制備枯草菌脂肽的發(fā)酵液成分復(fù)雜，除了存在大量菌體外，還含有未被微生物完全利用的蛋白質(zhì)等。為了進(jìn)一步提高枯草菌肽鈉成品純度，本發(fā)明所述純化方法步驟 I還包括離心除雜的步驟，以去除枯草菌脂肽中混有的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
作為優(yōu)選，所述離心除雜為取膜過濾所得截留液調(diào)pH至5. 0-6. 6，離心收集上清液。利用目標(biāo)產(chǎn)品枯草菌脂肽與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)等電點(diǎn)不同，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)在溶液PH達(dá)到其等電點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生自然沉降的原理，將膜截留液PH調(diào)至5. 0-6. 6，將目標(biāo)產(chǎn)品枯草菌脂肽與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離，離心除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。
其中，所述膜截留液pH優(yōu)選為4. 0-6. 5。
為了達(dá)到更好的去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的效果，減輕后續(xù)精制工序的壓力，本發(fā)明所述純化方法步驟I所述離心除雜步驟中所述離心的分離因數(shù)優(yōu)選為5000g-17000g。
本發(fā)明采用高效液相色譜法檢測本發(fā)明所述經(jīng)離心去除菌體、膜過濾處理、離心除雜、中和成鹽的步驟純化獲得的枯草菌肽鈉成品，純度可達(dá)80-85%。
進(jìn)一步的，本發(fā)明所述純化方法步驟I還包括酸化沉淀步驟。利用等電點(diǎn)沉淀法， 用酸調(diào)節(jié)離心上清液PH值至枯草菌脂肽等電點(diǎn)，使枯草菌脂肽沉降下來。
作為優(yōu)選，所述酸化沉淀為取離心除雜所得上清液加入酸溶液至pH值2. 0-5. 0， 收集沉淀。更優(yōu)選為3. 0-4. O。
其中，所述酸化沉淀步驟中所述酸溶液為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、鹽酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、延胡索酸、山梨酸中的一種或幾種的混合物。
進(jìn)一步的，所述酸化沉淀還包括水洗沉淀步驟，以更好的除去沉降下來的枯草菌脂妝中混有的雜質(zhì)。
本發(fā)明采用高效液相色譜法檢測本發(fā)明所述經(jīng)離心去除菌體、膜過濾處理、離心除雜、酸化沉淀、中和成鹽的步驟純化獲得的枯草菌肽鈉成品，純度可達(dá)85-88%。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的一種枯草菌脂肽鈉的純化方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
其中高效液相色譜測定枯草菌脂肽鈉成品純度的方法如下
色譜條件色譜柱5μπι C18柱，200 X 4. 6mm ;流動(dòng)相80%乙腈+20%3. 8mM三氟乙酸(TFA)，經(jīng)O. 22 μ m有機(jī)濾膜過濾，超聲波脫氣20min ;流速1. OmL/min ;柱溫27°C;進(jìn)樣量20 μ L ;紫外檢測波長205nm。
樣品處理準(zhǔn)確稱取枯草菌脂肽鈉標(biāo)準(zhǔn)品IOmg,用5mL流動(dòng)相配制成2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液母液，吸取ImL母液用二倍梯度法稀釋為lmg/mL、0. 5mg/mL、0. 25mg/mL、0. 125mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，于冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 準(zhǔn)確稱取50. Omg(精確至O. OOOlg)制得枯草菌脂肽鈉待測樣品至50mL容量瓶中，加入流動(dòng)相配制成lmg/mL樣品溶液，超聲提取20分鐘，靜置30分鐘，經(jīng)O. 22 μ m有機(jī)微孔濾I吳過濾后，收集濾液待液相檢測。
測定將枯草菌脂肽鈉標(biāo)準(zhǔn)液按照濃度由低到高進(jìn)樣，檢測結(jié)果經(jīng)島津LC Solution工作站處理得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳細(xì)處理操作見《高效液相色譜法操作規(guī)程》。在上述色譜條件下，根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積定量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖6-30分鐘之間的峰面積之和為枯草菌脂肽鈉的峰面積。
待測樣品中枯草菌脂肽鈉響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超出濃度線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。
結(jié)果計(jì)算分析結(jié)果經(jīng)島津LC Solution工作站處理得出待測樣品純度，工作站積分處理操作見《高效液相色譜法操作規(guī)程》。
實(shí)施例1 :本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化
取枯草菌脂肽發(fā)酵液5000g離心20min，收集離心所得上清液，經(jīng)50nm、膜溫為 10°C的陶瓷復(fù)合膜過濾，收集膜過濾截留液，在20°C加入氫氧化鈉溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)噴霧干燥后即得枯草菌脂肽鈉成品。高效液相色譜法測定制得的枯草菌脂肽鈉成品純度為76%。
實(shí)施例2 :本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化
取枯草菌脂肽發(fā)酵液17000g離心lOmin，收集離心所得上清液，經(jīng)20nm、膜溫為 50°C的陶瓷復(fù)合膜過濾，收集膜過濾截留液，在50°C加入氫氧化鉀溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)噴霧干燥后即得枯草菌脂肽鈉成品。高效液相色譜法測定制得的枯草菌脂肽鈉成品純度為78%。
實(shí)施例3 :本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化
取枯草菌脂肽發(fā)酵液稀釋10倍，調(diào)pH值調(diào)至7. 0-8. 5，IOOOOg離心lOmin，收集離心所得上清液，經(jīng)50nm、膜溫為20°C的陶瓷復(fù)合膜過濾，收集膜過濾截留液，在30°C加入碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)噴霧干燥后即得枯草菌脂肽鈉成品。高效液相色譜法測定制得的枯草菌脂肽鈉成品純度為79%。
實(shí)施例4 :本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化
取枯草菌脂肽發(fā)酵液稀釋5倍，調(diào)pH值調(diào)至6. 5-7. 5，12000g離心15min，收集離心所得上清液，經(jīng)50nm、膜溫為30°C的陶瓷復(fù)合膜過濾，收集膜過濾截留液，在40°C加入氫氧化鈉溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)噴霧干燥后即得枯草菌脂肽鈉成品。高效液相色譜法測定制得的枯草菌脂肽鈉成品純度為80%。
實(shí)施例5 :本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化
取枯草菌脂肽發(fā)酵液稀釋6倍，調(diào)pH值調(diào)至6. 5-7. 0，8000g離心20min，收集離心所得上清液，經(jīng)50nm、膜溫為50°C的陶瓷復(fù)合膜過 濾，收集膜過濾截留液，調(diào)pH至5. 0-6.5， IOOOOg離心lOmin，收集上清液在20°C加入氫氧化鉀溶液進(jìn)行中和反應(yīng),反應(yīng)液經(jīng)噴霧干燥后即得枯草菌脂肽鈉成品。高效液相色譜法測定制得的枯草菌脂肽鈉成品純度為82%。
實(shí)施例6 :本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化
取枯草菌脂肽發(fā)酵液稀釋10倍，調(diào)pH值調(diào)至7. 0-8. O, 5000g離心30min，收集離心所得上清液，經(jīng)20nm、膜溫為40°C的陶瓷復(fù)合膜過濾，收集膜過濾截留液，調(diào)pH至 5. 0-6. O, IOOOOg離心lOmin，收集上清液，在50°C加入碳酸氫鈉溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)噴霧干燥后即得枯草菌脂肽鈉成品。高效液相色譜法測定制得的枯草菌脂肽鈉成品純度為 85%。
實(shí)施例7 :本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化
取枯草菌脂肽發(fā)酵液稀釋10倍，調(diào)pH值調(diào)至7. 0-7. 5，5000g離心30min，收集離心所得上清液，經(jīng)20nm、膜溫為30°C的陶瓷復(fù)合膜過濾，收集膜過濾截留液，調(diào)pH至 5. 0-6. O, IOOOOg離心IOmin,收集上清液，加入鹽酸至pH值3. 0-4. O,收集沉淀，在20。。加入氫氧化鈉溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)噴霧干燥后即得枯草菌脂肽鈉成品。高效液相色譜法測定制得的枯草菌脂肽鈉成品純度為88%。
實(shí)施例8 :本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化
取枯草菌脂肽發(fā)酵液稀釋5倍，調(diào)pH值調(diào)至6. 5-7. 5，12000g離心lOmin，收集離心所得上清液，經(jīng)50nm、膜溫為20°C的陶瓷復(fù)合膜過濾，收集膜過濾截留液，調(diào)pH至5.0-6. O, IOOOOg離心IOmin,收集上清液，加入甲酸至pH值3. 0-5. O,收集沉淀，在25。。加入氫氧化鉀溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)噴霧干燥后即得枯草菌脂肽鈉成品。高效液相色譜法測定制得的枯草菌脂肽鈉成品純度為86%。
以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原 理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種枯草菌脂肽鈉的純化方法，其特征在于，包括 步驟1:取枯草菌脂肽發(fā)酵液離心收集上清液，經(jīng)膜過濾后收集截留液； 步驟2 :緩慢加入堿溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液干燥后獲得枯草菌肽鈉成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于，步驟I還包括在離心前對枯草菌脂肽發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理的步驟，所述預(yù)處理為將枯草菌脂肽發(fā)酵液稀釋1-10倍，調(diào)PH值調(diào)至6. 0-8. 5ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述純化方法，其特征在于，步驟I所述枯草菌脂肽鈉發(fā)酵液離心的分離因數(shù)為5000-17000g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述純化方法，其特征在于，步驟I所述膜過濾的膜為陶瓷膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述純化方法，其特征在于，步驟I所述膜過濾的膜溫度為10-50。。。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述純化方法，其特征在于，步驟2所述中和反應(yīng)的溫度為20-55。。。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述純化方法，其特征在于，步驟2所述堿溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉中的一種或幾種的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述純化方法，其特征在于，步驟I還包括離心除雜的步驟，所述離心除雜為取膜過濾所得截留液調(diào)pH至5. 0-6. 6，離心收集上清液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述純化方法，其特征在于，步驟I還包括酸化沉淀步驟，所述酸化沉淀為取離心除雜所得上清液加入酸溶液至PH值2. 0-5. O,收集沉淀。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述純化方法，其特征在于，所述酸化沉淀步驟中所述酸溶液為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、鹽酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、延胡索酸、山梨酸中的一種或幾種的混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，公開了一種枯草菌脂肽鈉的純化方法。本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化方法為取枯草菌脂肽發(fā)酵液離心收集上清液，經(jīng)膜過濾后收集截留液；緩慢加入堿溶液進(jìn)行中和反應(yīng)，反應(yīng)液干燥后獲得枯草菌肽鈉成品。純化后制得枯草菌脂肽鈉成品純度達(dá)到75%-80%。為了進(jìn)一步提高枯草菌肽鈉成品純度，本發(fā)明所述純化方法在膜過濾后采用離心去除枯草菌脂肽中混有的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，純度達(dá)到80-85%，進(jìn)一步，用酸調(diào)節(jié)離心上清液pH值，使枯草菌脂肽沉降下來，成品純度達(dá)到85%-88%。本發(fā)明所述枯草菌脂肽鈉的純化方法制得枯草菌脂肽鈉成品純度可達(dá)75%-88%，可以作為化妝品添加劑廣泛應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。
文檔編號C07K1/34GK103059108SQ201310016078
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者孫文, 劉潔, 王澤建, 劉山山 申請人:安徽帝元生物科技有限公司