專利名稱：枯草桿菌酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對存在于卵中的物質(zhì)如IV-0類胰蛋白酶抑制劑的抑制作用具有降低的被抑制趨勢的新枯草桿菌酶(subtilase)變體。具體地說，本發(fā)明涉及這樣的新枯草桿菌酶變體，該變體在位置42-43、51-55、155-160、187-189、217-218或218-219之間(按照枯草桿菌蛋白酶BPN’(BASBPN)編號，見下文)包含至少一個額外的氨基酸殘基。這些枯草桿菌酶變體是有用的，當(dāng)用于諸如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣組合物和洗盤組合物，包括自動洗盤組合物中時，對卵污漬表現(xiàn)出優(yōu)良的或改進的洗滌性能。本發(fā)明還涉及編碼該變體的分離的DNA序列、表達載體、宿主細胞，以及生產(chǎn)和使用本發(fā)明的變體的方法。而且，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明變體的清潔和洗滌劑組合物。
背景技術(shù)：
在洗滌劑工業(yè)，酶已在洗滌制劑中使用了30年以上。用于這些制劑的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶和其它酶或它們的混合物。商業(yè)上最為重要的酶是蛋白酶。
數(shù)量不斷增長的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程化變體，如DURAZYM(Novozymes A/S)、RELASE(NovozymesA/S)、MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT(GenencorInternational，Inc.)。
而且，本領(lǐng)域描述了許多蛋白酶變體。WO 99/27082中給出了現(xiàn)有技術(shù)中蛋白酶變體的完整列表。
雖然已描述了大量有用的蛋白酶和蛋白酶變體，但是對于許多工業(yè)應(yīng)用而言，仍需要新的改進的蛋白酶或蛋白酶變體。
具體而言，由于卵清中存在的物質(zhì)抑制許多種絲氨酸蛋白酶，因而已提出從如衣物或硬表面上除去卵污漬的問題。此類物質(zhì)的實例包括IV-0類胰蛋白酶抑制劑(卵抑制蛋白)和III-0類胰蛋白酶抑制劑(卵類粘蛋白)。
因此，本發(fā)明的一個目的在于提供改進的枯草桿菌酶，它不被或僅有限地被此類物質(zhì)抑制。本發(fā)明的又一目的是提供適于從如衣物和/或硬表面除去卵污漬的改進枯草桿菌酶。
發(fā)明概述因此，在第一方面，本發(fā)明涉及選自以下的枯草桿菌酶變體在位置42和43之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置51和56之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置155和161之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置187和190之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置216和217之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置217和218之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置218和219之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體。
在第二方面，本發(fā)明涉及這樣的分離核酸序列，其包含編碼本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的核酸序列。
在第三方面，本發(fā)明涉及這樣的核酸構(gòu)建體，其包含可操作地連接至一個或多個調(diào)控序列的本發(fā)明的核酸序列，其中所述調(diào)控序列可指導(dǎo)枯草桿菌酶在合適宿主中表達。
在第四方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達載體。
在第五方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的重組宿主細胞。
在第六方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明枯草桿菌酶變體的方法，所述方法包括(a)在有助于產(chǎn)生枯草桿菌酶的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細胞；和(b)回收枯草桿菌酶變體。
在第七方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明枯草桿菌酶的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)來自芽胞桿菌屬，優(yōu)選地培養(yǎng)來自克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)種的菌株如克勞氏芽孢桿菌DSM 13585，以產(chǎn)生含有枯草桿菌酶變體的上清；和(b)回收枯草桿菌酶變體。
在第八方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的枯草桿菌酶變體的清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選地為洗衣或洗盤組合物。
本發(fā)明進一步的方面涉及本發(fā)明的枯草桿菌酶在清潔或洗滌劑組合物中的用途；本發(fā)明的枯草桿菌酶或組合物用于除去卵污漬的用途；一種用于清潔或洗滌的方法，包括從硬表面或衣物上除去卵污漬的方法，所述方法包括使硬表面或衣物與本發(fā)明的組合物接觸。
在第七方面，本發(fā)明涉及用于從硬表面或衣物上除去卵污漬的方法，所述方法包括使含有卵污漬的硬表面或含有卵污漬的衣物與含有本發(fā)明枯草桿菌酶變體的清潔或洗滌劑組合物接觸，優(yōu)選地與洗衣或洗盤組合物接觸。
關(guān)于序列對比和編號參見

圖1，該圖顯示在枯草桿菌蛋白酶BPN′(a)(BASBPN)(SEQ ID NO7)和枯草桿菌蛋白酶309(b)(BLSAVI)(SEQ IDNO8)之間的序列對比。
在本專利申請中這些序列對比(alignment)用作對殘基進行編號的參照。
定義在更詳細地討論本發(fā)明之前，首先定義以下的術(shù)語和約定。
氨基酸和核酸命名法在整個說明書、圖和權(quán)利要求書中使用氨基酸殘基的公認IUPAC命名法，大部分為單字母代碼形式，但也有三字母代碼形式。同樣，在整個說明書、圖和權(quán)利要求書中使用核酸的公認IUPAC命名法。
變體名稱的命名法和約定在描述本發(fā)明產(chǎn)生的或考慮的多種枯草桿菌酶變體時，采用以下的命名法和約定以易于參照首先通過將分離的酶或親本酶與枯草桿菌蛋白酶BPN′(BASBPN)對比來定義參考框。
可以由GCG程序包9.1版的GAP程序獲得序列對比，用于對變體進行編號，其間使用了以下參數(shù)間隔(gap)創(chuàng)建罰分＝8，間隔擴展罰分＝8，且所有的其它參數(shù)保持為它們的默認值。
另一種方法是使用枯草桿菌酶之間的已知公認對比，如在WO91/00345中所示的序列對比。在大部分情況下，差異并不重要。
由此，可以相對BASBPN定義缺失和插入的數(shù)目。在圖1中，枯草桿菌蛋白酶309與BASBPN相比，在位置36、58、158、162、163和164位有6處缺失。這些缺失在圖1中由星號(*)表示。
一般采用以下的三個元素來表示對親本酶所進行的多種修飾原始氨基酸位置替換的氨基酸因此，符號G195E意指195位的甘氨酸被谷氨酸替換。
在原始氨基酸殘基可以是任意氨基酸殘基的情況下，有時可以用簡略表達方式僅表示位置和替換的氨基酸位置替換的氨基酸這種符號尤其與同源枯草桿菌酶中的修飾相關(guān)(見下文)。
類似地，當(dāng)替換氨基酸殘基的種類不重要時
原始氨基酸位置當(dāng)原始氨基酸和替換氨基酸均可以包含任意氨基酸時，則只指出位置，如170。
當(dāng)原始氨基酸和/或替換的氨基酸可以包含一種以上但不是所有的氨基酸時，所選擇的氨基酸表示在括號內(nèi)原始氨基酸位置{替換的氨基酸1，...，替換的氨基酸n}對于具體的變體，使用具體的三個或一個字母代碼，包括代碼Xaa和X用來表示任何氨基酸殘基。
替換用谷氨酸替換195位的甘氨酸表示為Gly195Glu或G195E或者用任意氨基酸殘基替換195位的甘氨酸表示為Gly195Xaa或G195X或Glv195或G195因此用絲氨酸替換170位的任意氨基酸殘基將表示為Xaa170Ser或X170S或170Ser或170S這種符號尤其與同源枯草桿菌酶的修飾相關(guān)(見下文)。因此170Ser意在包括例如，BASBPN中的Lys170Ser修飾和BLSAVI中的Arg170Ser修飾(參見圖1)。
對于其中的原始氨基酸和/或替換的氨基酸可以包含一種以上但不是所有的氨基酸的修飾而言，由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸替換170位的精氨酸表示為Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}或R170{G，A，S，T}以表示變體R170G、R170A、R170S和R170T。
缺失195位甘氨酸的缺失表示為Gly195*或G195*相應(yīng)地，一個以上氨基酸殘基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示為Gly195*+Leu196*或G195*+L196*插入額外的氨基酸殘基的插入，如在G195后插入賴氨酸表示為Gly195GlyLys或G195GK；或者，當(dāng)插入一個以上的氨基酸殘基，如在G195后插入Lys和Ala時，這種插入表示為Gly195GlyLysAla或G195GKA在這些情況下，通過將小寫字母加到插入氨基酸殘基之前的氨基酸殘基位置號中來對插入氨基酸殘基進行編號。在以上的實例中，序列194-196因此為194 195 196BLSAVIA-G-L194 195 195a 195b 196變體 A-G-K-A-L(SEQ ID NO1)當(dāng)插入與所存在的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基時，顯然在命名法中出現(xiàn)了簡并性。例如，如果在以上的實施例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，則將它表示為G195GG。對從194 195 196BLSAVIA-G-L194 195 195a 196至變體A-G-G-L(SEQ ID NO2)194 194a 195 196的事實上同樣的變化還可以表示為A194AG。
這些例子對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，因此表示法G195GG和用于此類插入的相應(yīng)表示法意在包含這些等價的簡并表示法。
填補間隔當(dāng)與用于編號的枯草桿菌蛋白酶BPN′序列進行參照比較，在酶中存在缺失時，則對于在36位插入天冬氨酸而言，此位置處的插入表示為*36Asp或*36D多重修飾用加號分隔含多重修飾的變體，如Arg170Tyr+Gly195Glu或R170Y+G195E代表在170和195位分別用酪氨酸和谷氨酸替換精氨酸和甘氨酸的修飾。
因此，Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}表示以下變體Tyr167Gly+Arg170Gly， Tyr167Gly+Arg170Ala，Tyr167Gly+Arg170Ser， Tyr167G1y+Arg170Thr，Tyr167Ala+Arg170Gly， Tyr167Ala+Arg170Ala，Tyr167Ala+Arg170Ser， Tyr167Ala+Arg170Thr，Tyr167Ser+Arg170Gly， Tyr167Ser+Arg170Ala，Tyr167Ser+Arg170Ser， Tyr167Ser+Arg170Thr，Tyr167Thr+Arg170Gly， Tyr167Thr+Arg170Ala，Tyr167Thr+Arg170Ser， 和Tyr167Thr+Arg170Thr.
這種命名法與針對替換、代替、插入或缺失具有特定共同性質(zhì)的氨基酸殘基，如帶正電荷(K、R、H)、帶負電荷(D、E)的殘基的修飾，或諸如意味著可以用一種小氨基酸替換另一種小氨基酸的Tyr167{Gly，Ala，Ser，Thr}+Arg170{Gly，Ala，Ser，Thr}的保守氨基酸修飾特別相關(guān)。進一步的詳細描述參見“發(fā)明詳述”部分。
蛋白酶斷裂蛋白質(zhì)底物中的酰胺鍵的酶歸類為蛋白酶，或(可互換地)肽酶(見Walsh，1979，酶反應(yīng)機理(Enzymatic Reaction Mechanisms).W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。
氨基酸位置/殘基的編號如果沒有另外指出，本文所用的氨基酸編號對應(yīng)于枯草桿菌酶BPN′(BASBPN)序列的氨基酸編號。對BPN′序列的詳細描述，參見圖1或Siezen等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Engng.)4(1991)719-737。
絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，其中在活性位點存在必需的絲氨酸殘基(White，Handler和Smith，1973“生物化學(xué)原理(Principles of Biochemistry)，”第五版，McGraw-Hill Book公司，紐約，第271-272頁)。
細菌絲氨酸蛋白酶的分子量在20,000-45,000道爾頓的范圍內(nèi)。它們被二異丙基氟代磷酸抑制。它們水解簡單末端脂類，且其活性與真核生物糜蛋白酶(也是一種絲氨酸蛋白酶)相似。一個更為狹義的術(shù)語，堿性蛋白酶(包括一個亞組)反映某些絲氨酸蛋白酶的高pH最適值，為pH9.0-11.0(綜述參見Priest(1977)細菌學(xué)評論(BacteriologicalRev.)41711-753)。
枯草桿菌酶Siezen等人提出絲氨酸蛋白酶的一個亞組，其暫稱為枯草桿菌酶(subtilase)，見蛋白質(zhì)工程，4(1991)719-737和Siezen等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)6(1997)501-523。它們是通過對170多個先前稱為枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列進行同源性分析而定義的?？莶輻U菌蛋白酶以前通常被定義為由革蘭氏陽性細菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)Siezen等人則為枯草桿菌酶的一個亞組。已鑒定了大量的枯草桿菌酶，并已測定了一些枯草桿菌酶的氨基酸序列。對此類枯草桿菌酶及其氨基酸序列的更詳細描述參見Siezen等人(1997)。
枯草桿菌酶的一個亞組，I-S1或″真″枯草桿菌蛋白酶，包含“經(jīng)典的”枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168(BSS168)、枯草桿菌蛋白酶BPN′(BASBPN)、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(BLSCAR)(ALCALASE，Novozymes A/S)和枯草桿菌蛋白酶DY(BSSDY)。令人感興趣的其它I-S1亞組枯草桿菌酶為與BSS168密切相關(guān)的枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶Amylosacchariticus(BSSAS)、枯草桿菌蛋白酶J(BSAPRJ)、枯草桿菌蛋白酶NAT(BSAPRN)和腸膜肽酶(mesentericopeptidase)(BMSAMP)；與BLSCAR密切相關(guān)的枯草桿菌蛋白酶，如角蛋白酶(BLKERA)、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg 11594(BLSCA1)、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg 15413(BLSCA2)、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg 14353(BLSCA3)；以及枯草桿菌蛋白酶絲氨酸蛋白酶C(BSSPRC)和絲氨酸蛋白酶D(BSSPRD)，或者它們的功能變體，其中所述功能變體保留了亞組I-S1的特征。
Siezen等人(見上文)識別了枯草桿菌酶的另一亞組，I-S2或強堿性枯草桿菌蛋白酶。亞組I-S2蛋白酶被描述為強堿性枯草桿菌蛋白酶并包括枯草桿菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL，Gist-BrocadesNV)、枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI，BLS309)(SAVINASE，Novozymes A/S)、枯草桿菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE，Novozymes A/S)和堿性彈性蛋白酶YaB(BSEYAB)。令人感興趣的其它I-S2亞組枯草桿菌酶為枯草桿菌蛋白酶ALPI(BSAPRQ)、與BLS147密切相關(guān)的枯草桿菌蛋白酶如枯草桿菌蛋白酶AprM(BSAPRM)和堿性蛋白酶AH-101(BAH101)、Savinase(BLSAVI)(或密切相關(guān)的枯草桿菌蛋白酶M-蛋白酶(BSKSMK)、枯草桿菌蛋白酶PB92(BAALKP)、枯草桿菌蛋白酶BL(BLSUBL))、堿性彈性蛋白酶YaB(BSEYAB)、Thermitase(TVTHER)、枯草桿菌蛋白酶Sendai(BSAPRS)，或者它們的功能變體，其中所述功能變體保留了亞組I-S2的特征。
″SAVINASE″SAVINASE由NOVOZYMES A/S銷售。它是來自遲緩芽孢桿菌(B.Lentus)的枯草桿菌蛋白酶309，并且只在一個位置處不同于BAALKP(N87S，見此處的圖1)。SAVINASE具有在圖1中稱為b)的氨基酸序列。
親本枯草桿菌酶術(shù)語“親本枯草桿菌酶”描述根據(jù)Siezen等人(1991和1997)定義的枯草桿菌酶。關(guān)于進一步的細節(jié)，參見緊上述對“枯草桿菌酶”的描述。親本枯草桿菌酶也可以是從天然來源分離的、并隨后在保持枯草桿菌酶特性的情況下經(jīng)過修飾的枯草桿菌酶。而且，親本枯草桿菌酶還可以是通過如以下文獻所述的DNA改組技術(shù)制備的枯草桿菌酶J.E.Ness等人，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，17，893-896(1999)。術(shù)語“親本枯草桿菌酶”可另外稱為“野生型枯草桿菌酶”。
枯草桿菌酶變體的修飾本文所用的術(shù)語“修飾”定義為包括枯草桿菌酶的化學(xué)修飾以及對編碼枯草桿菌酶的DNA所進行的遺傳操作。修飾可以是氨基酸側(cè)鏈的取代、目標氨基酸處的替換、缺失和/或插入。
枯草桿菌酶變體在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語枯草桿菌酶變體或突變的枯草桿菌酶指由表達突變基因或修飾基因的生物體產(chǎn)生的枯草桿菌酶，該基因來源于含原始或親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)親本酶的親本微生物，為產(chǎn)生突變基因?qū)λ鲇H本基因進行了突變，這種突變基因在適宜的宿主中表達時產(chǎn)生所述的突變枯草桿菌酶。類似地，所述突變基因還可以來自通過DNA改組技術(shù)產(chǎn)生的親本基因。
同源枯草桿菌酶序列在本上下文中，兩種氨基酸序列之間的同源性用參數(shù)“同一性”描述。
為了確定兩種枯草桿菌酶之間的同一性程度，可以使用相同的設(shè)定值應(yīng)用(下文)GCG程序包9.1版的GAP方法。此方法的計算結(jié)果除了氨基酸序列對比外，還有兩個序列之間的“同一性百分率”的計算結(jié)果。
根據(jù)此說明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地鑒定適宜的同源性枯草桿菌酶和相應(yīng)的同源活性位點環(huán)區(qū)，它們可以根據(jù)本發(fā)明進行修飾。
分離的DNA序列或多核苷酸本文所用術(shù)語“分離的核酸序列”是指具有明確核酸序列的多核苷酸分子，其已經(jīng)分離和純化并因此為適用于遺傳工程化的蛋白質(zhì)產(chǎn)生體系的形式。這些分離的分子可以是與其自然環(huán)境分離的分子，包括cDNA和基因組克隆以及來自DNA改組實驗或定點誘變實驗的多核苷酸或核酸序列。本發(fā)明的分離的多核苷酸或核酸序列不含其它通常與之相關(guān)的基因，但可包括5′和3′非翻譯區(qū)如啟動子和終止子。相關(guān)區(qū)域的鑒定對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的(例如，參見Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。術(shù)語“分離的核酸序列”或“分離的多核苷酸”另外可稱為“分離的DNA序列”、“克隆的多核苷酸”“克隆的核酸序列”或“克隆的DNA序列”。
分離的蛋白質(zhì)術(shù)語“分離的”在應(yīng)用于蛋白質(zhì)時指此蛋白質(zhì)已從其自然環(huán)境中分離出來。
在優(yōu)選的形式中，分離的蛋白質(zhì)基本上不含其它蛋白質(zhì)，特別是其它同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(參見以下))。
通過SDS-PAGE測定，分離的蛋白質(zhì)的純度大于10％，優(yōu)選大于20％，更優(yōu)選大于30％。還優(yōu)選提供通過SDS-PAGE測定純度大于40％，大于60％，大于80％，更優(yōu)選大于95％，并最優(yōu)選大于99％的高度純化形式的蛋白質(zhì)。
術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”可另稱為“純化的蛋白質(zhì)”。
同源雜質(zhì)術(shù)語“同源雜質(zhì)”意指任何來源于最初獲得本發(fā)明枯草桿菌酶的同源細胞的雜質(zhì)(如非本發(fā)明枯草桿菌酶的另一多肽)。
自……獲得本文所用與特定的微生物源相關(guān)的術(shù)語“自……獲得”意指該多核苷酸和/或枯草桿菌酶是由此特定來源或由如下細胞產(chǎn)生，其中所述細胞中已插入來自于該來源的基因。
底物本文所用的與蛋白酶的底物相關(guān)的術(shù)語“底物”應(yīng)以其最廣義的形式解釋為包括含有至少一個易于被枯草桿菌蛋白酶水解的肽鍵(酰胺鍵)的化合物。
產(chǎn)物本文所用的與來自蛋白酶酶促反應(yīng)的產(chǎn)物有關(guān)的術(shù)語“產(chǎn)物”在本發(fā)明的上下文中應(yīng)解釋為包括涉及蛋白酶枯草桿菌酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。產(chǎn)物可以是隨后的水解反應(yīng)的底物。
洗滌性能在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“洗滌性能”用以表示酶在例如洗滌或硬表面清潔過程中除去存在于待清潔物體上的卵污漬的能力。還參見本文實施例3中的“標準的洗滌劑洗滌性能試驗”。
性能因子用下式定義術(shù)語“性能因子”
P＝R變體-R親本其中，P為性能因子，R變體為按“標準的洗滌劑洗滌性能試驗”中所述采用枯草桿菌酶變體處理之后的試驗材料的反射能力(reflectance)(于460nm處測定)，而R親本為按“標準的洗滌劑洗滌性能試驗”中所述采用對應(yīng)的親本枯草桿菌酶處理之后的試驗材料的反射能力(于460nm處測定)。進一步的詳情參見本文實施例3中的“標準的洗滌劑洗滌性能試驗”。
剩余活性術(shù)語“剩余活性”的定義見本文在“卵抑制測定”中的描述(見實施例3)。
附圖簡述圖1表示使用上述的GAP法進行的枯草桿菌蛋白酶BPN′(a)和Savinase(b)之間的序列對比。
發(fā)明詳述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，其中某些區(qū)域較目前已知的區(qū)域長的枯草桿菌蛋白酶變體較親本枯草桿菌酶相比被存在于卵中的物質(zhì)如IV-0類胰蛋白酶抑制劑抑制的程度顯著地降低，因此本發(fā)明的變體對卵污漬的清除表現(xiàn)出改進的洗滌性能。
其鑒定已在構(gòu)建枯草桿菌蛋白酶的變體，尤其是枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI或Savinase)的變體的過程中進行。不被任何特定的理論所束縛，目前認為由于空間位阻和/或構(gòu)象變化，卵清抑制劑與枯草桿菌酶變體底物結(jié)合區(qū)的結(jié)合受阻。
因此，認為適于此處所述用途的變體是這樣的變體，其中當(dāng)與野生型枯草桿菌酶比較時，在以下位置的一處或多處已插入了一個或多個氨基酸殘基位置42和43之間、位置51和52之間、位置52和53之間、位置53和54之間、位置54和55之間、位置55和56之間、位置155和156之間、位置156和157之間、位置157和158之間、位置158和159之間、位置159和160之間、位置160和161之間、位置187和188之間、位置188和189之間、位置189和190之間、位置216和217之間、位置217和218之間、或位置218和219之間(BASBPN編號)，特別是在位置217和218之間。
本發(fā)明第一方面的枯草桿菌酶變體可為從自然界中鑒定并分離的親本或野生型枯草桿菌酶。
這樣的親本野生型枯草桿菌酶可通過本領(lǐng)域公知的標準技術(shù)進行特異性篩選。
進行特異性篩選的一種優(yōu)選方式為通過特異性PCR從許多不同的微生物，優(yōu)選地從不同的芽孢桿菌菌株擴增已知編碼枯草桿菌酶中活性位點環(huán)的DNA區(qū)域。
枯草桿菌酶為一組保守的酶，這是從它們的DNA和氨基酸序列具有同源性這一意義上說的。因此可在活性位點環(huán)的側(cè)翼構(gòu)建相對特異的引物。
構(gòu)建相對特異引物的一種方式是研究不同枯草桿菌酶的序列對比(參見如Siezen等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)6(1997)501-523)。根據(jù)此常規(guī)工作，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以構(gòu)建位于任一I-S1組或I-S2組如BLSAVI的上述位置側(cè)翼的PCR引物。使用此類PCR引物從許多不同的微生物(優(yōu)選地不同的芽孢桿菌菌株)擴增DNA，然后對該擴增的PCR片段進行DNA測序，可鑒定到產(chǎn)生屬于這些組的、與如BLSAVI的序列相比包含插入的枯草桿菌酶的菌株。鑒定完菌株及此目標枯草桿菌酶的部分DNA序列后，克隆、表達和純化此枯草桿菌酶為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)工作。
但是，可以想到的是，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體主要是親本枯草桿菌酶的變體。
適用于此處所述用途的枯草桿菌酶變體可通過本領(lǐng)域公知的標準技術(shù)構(gòu)建，如對不同枯草桿菌酶序列進行定點/隨機誘變或DNA改組。進一步的詳情參見本文的″材料和方法″部分(下文)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到本文所述的變體可包含一個或多個其它的修飾，尤其是一個或多個其它的插入或替換。
而且，在本文所述區(qū)域中的插入可包括一個以上氨基酸殘基的插入。例如，本發(fā)明的變體可包含一個插入、兩個插入或兩個以上的插入，如三個、四個或五個插入。
在本發(fā)明的一個令人感興趣的實施方案中，在位置42和43之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置42和43之間的插入優(yōu)選為選自以下的插入(BASBPN編號)X42X{A，T，G，S}，如X42XA，X42XT，X42XG，X42XS；X42X{D，E，K，R}，如X42XD，X42XE，X42XK，X42XR；X42X{H，V，C，N，Q}，如X42XH，X42XV，X42XC，X42XN，X42XQ；以及X42X{F，I，L，M，P，W，Y}，如X42XF，X42XI，X42XL，X42XM，X42XP，X42XW，X42XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為D42D{A，T，G，S}，如D42DA，D42DT，D42DG，D42DS；D42D{D，E，K，R}，如D42DD，D42DE，D42DK，D42DR；D42D{H，V，C，N，Q}，如D42DH，D42DV，D42DC，D42DN，D42DQ；以及D42D{F，I，L，M，P，W，Y}，如D42DF，D42DI，D42DL，D42DM，D42DP，D42DW，D42DY。
在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置51和52之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置51和52之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X51X{A，T，G，S}，如X51XA，X51XT，X51XG，X51XS；X51X{D，E，K，R}，如X51XD，X51XE，X51XK，X51XR；X51X{H，V，C，N，Q}，如X51XH，X51XV，X51XC，X51XN，X51XQ；以及
X51X{F，I，L，M，P，W，Y}，如X51XF，X51XI，X51XL，X51XM，X51XP，X51XW，X51XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為V51V{A，T，G，S}，例如，V51VA，V51VT，V51VG，V51VS；V51V{D，E，K，R}，例如，V51VD，V51VE，V51VK，V51VR；V51V{H，V，C，N，Q}，例如，V51VH，V51VV，V51VC，V51VN，V51VQ；和V51V{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，V51VF，V51VI，V51VL，V51VM，V51VP，V51VW，V51VY.
在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置52和53之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置52和53之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X52X{A，T，G，S}，例如，X52XA，X52XT，X52XG，X52XS；X52X{D，E，K，R}，例如，X52XD，X52XE，X52XK，X52XR；X52X{H，V，C，N，Q}，例如，X52XH，X52XV，X52XC，X52XN，X52XQ；和X52X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X52XF，X52XI，X52XL，X52XM，X52XP，X52XW，X52XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為P52P{A，T，G，S}，例如，P52PA，P52PT，P52PG，P52PS；P52P{D，E，K，R}，例如，P52PD，P52PE，P52PK，P52PR；P52P{H，V，C，N，Q}，例如，P52PH，P52PV，P52PC，P52PN，P52PQ；和P52P{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，P52PF，P52PI，P52PL，P52PM，P52PP，P52PW，P52PY.
在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置53和54之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置53和54之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X53X{A，T，G，S}，例如，X53XA，X53XT，X53XG，X53XS；X53X{D，E，K，R}，例如，X53XD，X53XE，X53XK，X53XR；X53X{H，V，C，N-，Q}，例如，X53XH，X53XV，X53XC，X53XN，X53XQ；和X53X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X53XF，X53XI，X53XL，X53XM，X53XP，X53XW，X53XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為G53G{A，T，G，S}，例如，G53GA，G53GT，G53GG，G53GS；G53G{D，E，K，R}，例如，G53GD，G53GE，G53GK，G53GR；G53G{H，V，C，N，Q}，例如，G53GH，G53GV，G53GC，G53GN，G53GQ；和G53G{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，G53GF，G53GI，G53GL，G53GM，G53GP，G53GW，G53GY.
又在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置54和55之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置54和55之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X54X{A，T，G，S}，例如，X54XA，X54XT，X54XG，X54XS；X54X{D，E，K，R}，例如，X54XD，X54XE，X54XK，X54XR；X54X{H，V，C，N，Q}，例如，X54XH，X54XV，X54XC，X54XN，X54XQ；和X54X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X54XF，X54XI，X54XL，X54XM，X54XP，X54XW，X54XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為E54E{A，T，G，S}，例如，E54EA，E54ET，E54EG，E54ES；E54E{D，E，K，R}，例如，E54ED，E54EE，E54EK，E54ER；E54E{H，V，C，N，Q}，例如，E54EH，E54EV，E54EC，E54EN，E54EQ；和E54E{F ，I，L，M，P，W，Y}，例如，E54EF，E54EI，E54EL，E54EM，E54EP，E54EW，E54EY.
在本發(fā)明再一個令人感興趣的實施方案中，在位置55和56之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置55和56之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X55X{A，T，G，S}，例如，X55XA，X55XT，X55XG，X55XS；X55X{D，E，K，R}，例如，X55XD，X55XE，X55XK，X55XR；X55X{H，V，C，N，Q}，例如，X55XH，X55XV，X55XC，X55XN，X55XQ；和X55X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X55XF，X55XI，X55XL，X55XM，X55XP，X55XW，X55XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為P55P{A，T，G，S}，例如，P55PA，P55PT，P55PG，P55PS；P55P{D，E，K，R}，例如，P55PD，P55PE，P55PK，P55PR；P55P{H，V，C，N，Q}，例如，P55PH，P55PV，P55PC，P55PN，P55PQ；和P55P{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，P55PF，P55PI，P55PL，P55PM，P55PP，P55PW，P55PY.
在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置155和156之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置155和156之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X155X{A，T，G，S}，例如，X155XA，X155XT，X155XG，X155XS；X155X{D，E，K，R}，例如，X155XD，X155XE，X155XK，X155XR；X155X{H，V，C，N，Q}，例如，X155XH，X155XV，X155XC，X155XN，X155XQ；和X155X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X155XF，X155XI，X155XL，X155XM，X155XP，X155XW，X155XY；
或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為N155N{A，T，G，S}，例如，N155NA，N155NT，N155NG，N155NS；N155N{D，E，K，R}，例如，N155ND，N155NE，N155NK，N155NR；N155N{H，V，C，N，Q}，例如，N155ANH，N155NV，N155NC，N155NN，N155NQ；和N155N{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，N155NF，N155NI，N155NL，N155NM，N155NP，N155NW，N155NY.
在本發(fā)明的又一個令人感興趣的實施方案中，在位置156和157之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置156和157之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X156X{A，T，G，S}，例如，X156XA，X156XT，X156XG，X156XS；X156X{D，E，K，R}，例如，X156XD，X156XE，X156XK，X156XR；X156X{H，V，C，N，Q}，例如，X156XH，X156XV，X156XC，X156XN，X156XQ；和X156X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X156XF，X156XI，X156XL，X156XM，X156XP，X156XW，X156XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為S156S{A，T，G，S}，例如，S156SA，S156ST，S156SG，S156SS；S156S{D，E，K，R}，例如，S156SD，S156SE，S156SK，S156SR；S156S{H，V，C，N，Q}，例如，S156SH，S156SV，S156SC，S156SN，S156SQ；和S156S{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，S156SF，S156SI，S156SL，S156SM，S156SP，S156SW，S156SY.
又在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置157和158之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置157和158之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)
X157X{A，T，G，S}，例如，X157XA，X157XT，X157XG，X157XS；X157X{D，E，K，R}，例如，X157XD，X157XE，X157XK，X157XR；X157X{H，V，C，N，Q}，例如，X157XH，X157XV，X157XC，X157XN，X157XQ；和X157X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X157XF，X157XI，X157XL，X157XM，X157XP，X157XW，X157XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為G157G{A，T，G，S}，例如，G157GA，G157GT，G157GG，G157GS；G157G{D，E，K，R}，例如，G157GD，G157GE，G157GK，G157GR；G157G{H，V，C，N，Q}，例如，G157GH，G157GV，G157GC，G157GN，G157GQ；和G157G{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，G157GF，G157GI，G157GL，G157GM，G157GP，G157GW，G157GY.
在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置158和159之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置158和159之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X158X{A，T，G，S}，例如，X158XA，X158XT，X158XG，X158XS；X158X{D，E，K，R}，例如，X158XD，X158XE，X158XK，X158XR；X158X{H，V，C，N，Q}，例如，X158XH，X158XV，X158XC，X158XN，X158XQ；和X158X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X158XF，X158XI，X158XL，X158XM，X158XP，X158XW，X158XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為*158{A，T，G，S}，例如，*158A，*158T，*158G，*158S；*158{D，E，K，R}，例如，*158D，*158E，*158K，*158R；*158{H，V，C，N，Q}，例如，*158H，*158V，*158C，*158N，*158Q；和*158{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，*158F，*518I，*158L，*158M，*158P，*158W，*158Y.
在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置159和160之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置159和160之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X159X{A，T，G，S}，例如，X159XA，X159XT，X159XG，X159XS；X159X{D，E，K，R}，例如，X159XD，X159XE，X159XK，X159XR；X159X{H，V，C，N，Q}，例如，X159XH，X159XV，X159XC，X159XN，X159XQ；和X159X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X159XF，X159XI，X159XL，X159XM，X159XP，X159XW，X159XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為A159A{A，T，G，S}，e.g.，A159AA，A159AT，A159AG，A159AS；A159A{D，E，K，R}，e.g.，A159AD，A159AE，A159AK，A159AR；A159A{H，V，C，N，Q}，e.g.，A159AH，A159AV，A159AC，A159AN，A159AQ；和A159A{F，I，L，M，P，W，Y}，e.g.，A159AF，A159AI，A159AL，A159AM，A159AP，A159AW，A159AY.
又在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置160和161之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置160和161之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X160X{A，T，G，S}，例如，X160XA，X160XT，X160XG，X160XS；X160X{D，E，K，R}，例如，X160XD，X160XE，X160XK，X160XR；X160X{H，V，C，N，Q}，例如，X160XH，X160XV，X160XC，X160XN，X160XQ；和X160X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X160XF，X160XI，X160XL，X160XM，X160XP，X160XW，X160XY；
或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為G160G{A，T，G，S}，例如，G160GA，G160GT，G160GG，G160GS；G160G{D，E，K，R}，例如，G160GD，G160GE，G160GK，G160GR；G160G{H，V，C，N，Q}，例如，G160GH，G160GV，G160GC，G160GN，G160GQ；和G160G{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，G160GF，G160GI，G160GL，G160GM，G160GP，G160GW，G160GY.
在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置187和188之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置187和188之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X187X{A，T，G，S}，例如，X187XA，X187XT，X187XG，X187XS；X187X{D，E，K，R}，例如，X187XD，X187XE，X187XK，X187XR；X187X{H，V，C，N，Q}，例如，X187XH，X187XV，X187XC，X187XN，X187XQ；和X187X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X187XF，X187XI，X187XL，X187XM，X187XP，X187XW，X187XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為A187A{A，T，G，S}，例如，A187AA，A187AT，A187AG，A187AS；A187fA{D，E，K，R}，例如，A187AD，A187AE，A187AK，A187AR；A187A{H，V，C，N，Q}，例如，A187AH，A187AV，A187AC，A187AN，A187AQ；和A187A{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，A187AF，A187AI，A187AL，A187AM，A187AP，A187AW，A187AY.
在本發(fā)明的又一個令人感興趣的實施方案中，在位置188和189之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置188和189之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)
X188X{A，T，G，S}，例如，X188XA，X188XT，X188XG，X188XS；X188X{D，E，K，R}，例如，X188XD，X188XE，X188XK，X188XR；X188X{H，V，C，N，Q}，例如，X188XH，X188XV，X188XC，X188XN，X188XQ；和X188X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X188XF，X188XI，X188XL，X188XM，X188XP，X188XW，X188XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為S188S{A，T，G，S}，例如，S188SA，S188ST，S188SG，S188SS；S188S{D，E，K，R}，例如，S188SD，S188SE，S188SK，S188SR；S188S{H，V，C，N，Q}，例如，S188SH，S188SV，S188SC，S188SN，S188SQ；andS188S{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，S188SF，S188SI，S188SL，S188SM，S188SP，S188SW，S188SY.
又在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置189和190之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置189和190之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X189X{A，T，G，S}，例如，X189XA，X189XT，X189XG，X189XS；X189X{D，E，K，R}，例如，X189XD，X189XE，X189XK，X189XR；X189X{H，V，C，N，Q}，例如，X189XH，X189XV，X189XC，X189XN，X189XQ；和X189X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，X189XF，X189XI，X189XL，X189XM，X189XP，X189XW，X189XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為F189F{A，T，G，S}，例如，F(xiàn)189FA，F(xiàn)189FT，F(xiàn)189FG，F(xiàn)189FS；F189F{D，E，K，R}，例如，F(xiàn)189FD，F(xiàn)189FE，F(xiàn)189FK，F(xiàn)189FR；F189F{H，V，C，N，Q}，例如，F(xiàn)189FH，F(xiàn)189FV，F(xiàn)189FC，F(xiàn)189FN，F(xiàn)189FQ；和F189F{F，I，L，M，P，W，Y}，例如，F(xiàn)189FF，F(xiàn)189FI，F(xiàn)189FL，F(xiàn)189FM，F(xiàn)189FP，F(xiàn)189FW，F(xiàn)189FY.
在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置216和217之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置216和217之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X216X{A，T，G，S}，例如.，X216XA，X216XT，X216XG，X216XS；X216X{D，E，K，R}，例如.，X216XD，X216XE，X216XK，X216XR；X216X{H，V，C，N，Q}，例如.，X216XH，X216XV，X216XC，X216XN，X216XQ；和X216X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，X216XF，X216XI，X216XL，X216XM，X216XP，X216XW，X216XY；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為S216S{A，T，G，S}，例如.，S216SA，S216ST，S216SG，S216SS；S216S{D，E，K，R}，例如.，S216SD，S216SE，S216SK，S216SR；S216S{H，V，C，N，Q}，例如.，S216SH，S216SV，S216SC，S216SN，S216SQ；和S216S{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，S216SF，S216SI，S216SL，S216SM，S216SP，S216SW，S216SY.
在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置217和218之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置217和218之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X217X{A，T，G，S}，例如.，X217XA，X217XT，X217XG，X217XS；X217X{D，E，K，R}，例如.，X217XD，X217XE，X217XK，X217XR；X217X{H，V，C，N，Q}，例如.，X217XH，X217XV，X217XC，X217XN，X217XQ；和X217X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，X217XF，X217XI，X217XL，X217XM，X217XP，X217XW，X217XY；
或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為L217L{A，T，G，S}，例如.，L217LA，L217LT，L217LG，L217LS；L217L{D，E，K，R}，例如.，L217LD，L217LE，L217LK，L217LR；L217L{H，V，C，N，Q}，例如.，L217LH，L217LV，L217LC，L217LN，L217LQ；和L217L{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，L217LF，L217LI，I217LL，L217LM，L217LP，L217LW，L217LY.
又在本發(fā)明的另一個令人感興趣的實施方案中，在位置218和219之間插入額外的氨基酸殘基。
在位置218和219之間的插入優(yōu)選是選自以下的插入(BASBPN編號)X218X{A，T，G，S}，例如.，X218XA，X218XT，X218XG，X218XS；X218X{D，E，K，R}，例如.，X218XD，X218XE，X218XK，X218XR；X218X{H，V，C，N，Q}，例如.，X218XH，X218XV，X218XC，X218XN，X218XQ；和X218X{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，X218XF，X218XI，X218XL，X218XM，X218XP，X218XW，X218XY ；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK，為N218N{A，T，G，S}，例如.，N218NA，N218NT，N218NG，N218NS；N218N{D，E，K，R}，例如.，N218ND，N218NE，N218NK，N218NR；N218N{H，V，C，N，Q}，例如.，N218NH，N218NV，N218NC，N218NN，N218NQ；和N218N{F，I，L，M，P，W，Y}，例如.，N218NF，N218NI，N218NL，N218NM，N218NP，N218NW，N218NY.
而且，據(jù)認為除了根據(jù)本發(fā)明進行上述的插入外，在位置95至103(BASBPN編號)的活性位點環(huán)(b)區(qū)域中插入至少一個額外的氨基酸殘基將會進一步降低由IV-0類胰蛋白酶抑制劑引起的抑制?？梢韵氲?，在位置98和99之間的額外插入和/或在位置99和100之間的插入將尤其有益。此類額外插入的實例為X98X{A，T，G，S}，如X98XA，X98XT，X98XG，X98XS；X98X{D，E，K，R}，如X98XD，X98XE，X98XK，X98XR；X98X{H，V，C，N，Q}，如X98XH，X98XV，X98XC，X98XN，X98XQ；以及X98X{F，I，L，M，P，W，Y}，如X98XF，X98XI，X98XL，X98XM，X98XP，X98XW，X98XY；優(yōu)選地為X98XD和X98XE；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶，為A98A{A，T，G，S}，如A98AA，A98AT，A98AG，A98AS；A98A{D，E，K，R}，如A98AD，A98AE，A98AK， A98AR；A98A{H，V，C，N，Q}，如A98AH，A98AV，A98AC，A98AN，A98AQ；A98A{F，I，L，M，P，W，Y}，如A98AF，A98AI，A98AL，A98AM，A98AP，A98AW，A98AY；優(yōu)選地為A98AD和A98AE。
另外的實例包括X99X{A，T，G，S}，如X99XA，X99XT，X99XG，X99XS；X99X{D，E，K，R}，如X99XD，X99XE，X99XK，X99XR；X99X{H，V，C，N，Q}，如X99XH，X99XV，X99XC，X99XN，X99XQ；以及X99X{F，I，L，M，P，W，Y}，如X99XF，X99XI，X99XL，X99XM，X99XP，X99XW，X99XY；優(yōu)選地為X99XD和X99XE；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶，為S99S{A，T，G，S}，如S99SA，S99ST，S99SG，S99SS；S99S{D，E，K，R}，如S99SD，S99SE，S99SK，S99SR；S99S{H，V，C，N，Q}，如S99SH，S99SV，S99SC，S99SN，S99SQ；S99S{F，I，L，M，P，W，Y}，如S99SF，S99SI，S99SL，S99SM，S99SP，S99SW，S99SY；優(yōu)選地為S99SD和S99SE。
對于位置99和100之間的插入，優(yōu)選該插入與在位置99的替換相結(jié)合。因此，除了上述所考慮到的插入外，還認為在位置99的下列替換是適當(dāng)?shù)腦99{A，T，G，S}，如X99A，X99T，X99G，X99S；X99{D，E，K，R}，如X99D，X99E，X99K，X99R；X99{H，V，C，N，Q}，如X99H，X99V，X99C，X99N，X99Q，以及X99{F，I，L，M，P，W，Y}，如X99F，X99I，X99L，X99M，X99P，X99W，X99Y；或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶，為S99{A，T，G}，如S99A，S99T，S99G；S99{D，E，K，R}，如S99D，S99E，S99K，S99R；S99{H，V，C，N，Q}，如S99H，S99V，S99C，S99N，S99Q；以及S99{F，I，L，M，P，W，Y}，如S99F，S99I，S99L，S99M，S99P，S99W，S99SY。
在一個優(yōu)選的實施方案中，在位置99處的替換選自X99{A，T，G，S}，特別是X99A，或更具體地，對枯草桿菌蛋白酶309和密切相關(guān)的枯草桿菌酶為S99{A，.T，G}，特別是S99A。
現(xiàn)有技術(shù)中已知，用類似的氨基酸殘基對某氨基酸殘基進行的所謂保守替代預(yù)期將僅造成酶特征的微小變化。
下列表I列出了保守氨基酸替換的組表I保守氨基酸替換共性氨基酸堿性(帶正電荷)K＝賴氨酸H＝組氨酸酸性(帶負電荷)E＝谷氨酸D＝天冬氨酸極性 Q＝谷氨酰胺N＝天冬酰胺疏水 L＝亮氨酸I＝異亮氨酸V＝纈氨酸M＝甲硫氨酸芳族 F＝苯丙氨酸W＝色氨酸Y＝酪氨酸小G＝甘氨酸A＝丙氨酸S＝絲氨酸T＝蘇氨酸根據(jù)這個原則，包含保守替換的枯草桿菌酶變體預(yù)期不會顯示出彼此之間具有明顯不同的特性。
基于此處公開的和/或示例性的枯草桿菌酶變體，確定可對這些變體進行的合適保守修飾以獲得顯示出類似改進洗滌性能的其它枯草桿菌酶變體為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)工作。
對于從自然或人工的多樣性創(chuàng)建體中分離酶，及對于從親本枯草桿菌酶設(shè)計并產(chǎn)生變體，均優(yōu)選親本枯草桿菌酶屬于亞組I-S1和1-S2，尤其是亞組I-S2。
對于來自亞組I-S1的變體，親本枯草桿菌酶優(yōu)選地選自BSS168(BSSAS、BSAPRJ、BSAPRN、BMSAMP)、BASBPN、BSSDY、BLSCAR(BLKERA、BLSCA1、BLSCA2、BLSCA3)、BSSPRC、和BSSPRD，或它們的保留了亞組I-S1特性的功能性變體。
對于來自亞組I-S2的變體，親本枯草桿菌酶優(yōu)選地選自BSAPRQ、BLS147(BSAPRM、BAH101)、BLSAVI(BSKSMK、BAALKP(BAPB92)、BLSUBL)、BSEYAB、TVTHER和BSAPRS，或它們的保留了亞組I-S2特性的功能性變體。
尤其是，親本枯草桿菌酶可以是BLSAVI(savinase，NOVOZYMESA/S)，并且本發(fā)明優(yōu)選的枯草桿菌酶變體因此為Savinase的變體。
本發(fā)明也包含其氨基酸序列中組合有任何其它修飾的任一上述枯草桿菌酶變體。特別是可以想到與本領(lǐng)域公知的能提供改良的酶性質(zhì)的其它修飾進行組合?，F(xiàn)有技術(shù)描述了一些具有不同改良性質(zhì)的枯草桿菌酶變體，其中的一些在本文的“發(fā)明背景”部分中已有提及(見上)。這些參考文獻在此處公開作為參考，用來鑒定枯草桿菌酶變體，其可有利地與此處描述的枯草桿菌酶變體組合。
此類組合包含位置222(提高氧化穩(wěn)定性)、218(提高熱穩(wěn)定性)、在穩(wěn)定酶的Ca-結(jié)合位點如位置76處的替換、以及從現(xiàn)有技術(shù)顯而易見的許多其它位置。
在進一步的實施方案中，此處描述的枯草桿菌酶變體可有利地與任一下列位置處(BASBPN編號)的一個或多個修飾組合27，36，56，76，87，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，120，123，129，131，132，133，143，159，167，170，192，194，206，217，218，222，224，232，235，236，245，248，252或274尤其是，枯草桿菌蛋白酶Savinase(BLSAVI)、BLSUBL、BSKSMK和BAALKP的以下變體被認為適于組合K27R，*36D，T56P，N76D，N87S，A97N，A98AT，A98AS，N99ND，N99NR，N99A，N99T，R101G，P103A，V104A，V104I，V104N，V104Y，D120H，N123S，P129K，P131H，A133P，A133D，A133E，T143K，*159D，*159E，Y167X，Y167A，R170X，R170S，A194P，Q206E，F(xiàn)217R，N218S，M222S，M222A，T224S，A232V，K235L，Q236H，Q245R，N248D，N252K和T274A.
更讓人特別感興趣的為這樣的本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，其中的修飾包含以下任一種修飾R101G+V104N，S101G+V104N，S87N+S101G+V104N，K27R+V104Y+N123S+T274A，N76D+V104A，或R101G+P103A+V104I+*159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K；或這些修飾(K27R，N76D，R101G，S101G，P103A，V104I，V104N，V104A，V104Y，N123S，*159D，A232V，Q236H，Q245R，N248D，N252K，T274A)的其它組合，以及任意一種或多種上述或下述顯示出改進特性的修飾。
特別令人感興趣的變體為這樣的變體，其中除了根據(jù)本發(fā)明的插入外，還包含下列替換S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K。
而且，本發(fā)明主要方面的枯草桿菌酶變體優(yōu)選與一個或多個在位置129、131和194之任一處的修飾組合，所述修飾優(yōu)選地為129K、131H和194P修飾，且最優(yōu)選地為P129K、P131H和A194P修飾。在生產(chǎn)枯草桿菌酶變體時，預(yù)期所有這些修飾都可以提供更高的枯草桿菌酶變體表達水平。
如上所述，本發(fā)明的變體只有限地被IV-0類胰蛋白酶抑制劑抑制，結(jié)果它們呈現(xiàn)出對卵污漬良好的洗滌性能。因此，為了使技術(shù)人員在其進行工作的早期階段可選出有效且優(yōu)選的變體用于此目的，本發(fā)明人提供了適當(dāng)?shù)念A(yù)試驗，該試驗易于被技術(shù)人員實施，旨在初步評估所討論的變體的性能。
因此，可采用在本文實施例4中所公開的″卵抑制測定″來初步評估所選擇變體的潛力。換言之，可采用″卵抑制測定″來評估所選擇的變體是否被IV-0類胰蛋白酶抑制劑抑制，以及抑制程度如何。應(yīng)用這種測試可評估所選擇的變體在去除卵污漬方面的適用性，其原理為如果所選擇的變體被IV-0類胰蛋白酶抑制劑強烈抑制，則通常無需進行進一步的測試實驗。
因此，對于此處描述的目的而言，尤其令人感興趣的變體為這樣的變體，當(dāng)在本文實施例4中描述的″卵抑制測定″試驗中測試時其具有至少15％(如至少20％)，優(yōu)選地至少25％(如至少30％)，更優(yōu)選地至少35％的剩余活性。在本發(fā)明的一個尤其令人感興趣的實施方案中，當(dāng)在本文實施例4中描述的″卵抑制測定″試驗中測試時，變體具有至少40％的剩余活性，如至少45％，諸如至少50％，優(yōu)選地至少55％的剩余活性，如至少60％，更優(yōu)選地至少65％，如至少70％，甚至更優(yōu)選地至少75％，如至少80％，諸如至少90％的剩余活度。
明顯地，優(yōu)選本發(fā)明的變體至少在所述的最低水平上，更優(yōu)選在所述的中等水平上，最優(yōu)選在所述的最高水平上符合上述標準。
作為備選方案或聯(lián)合上述試驗，所選擇變體的適用性可用本文實施例3中所公開的“標準的洗滌劑洗滌性能試驗”進行測試?？梢詫⒆凅w摻入標準的洗滌劑組合物中，與參照體系即親本枯草桿菌酶進行比較(將親本枯草桿菌酶摻入同樣的標準洗滌劑體系并在相同的條件下測試)，用“標準的洗滌劑洗滌性能試驗”評價變體除去標準紡織物上的卵污漬的能力。利用這種試驗，可以初步研究所選擇的變體除去卵污漬的適用性，其原理是如果所選擇的變體在試驗中沒有表現(xiàn)出相對于親本枯草桿菌酶的明顯改進，則一般不需要進行進一步的試驗。
因此，對于此處描述的目的而言，尤其令人感興趣的變體為這樣的變體如本文“標準的洗滌劑洗滌性能試驗”中所述，當(dāng)它在包含以下成分的標準洗滌劑組合物中試驗時，與在相同條件下試驗的親本枯草桿菌酶相比表現(xiàn)出改進的卵污漬洗滌性能，標準的洗滌劑組合物包含6.2％ LAS(Nansa 80S)2％ C16-C18脂肪酸的鈉鹽4％ 非離子表面活性劑(Plurafax LF404)22％ 沸石P10.5％Na2CO34％ Na2Si2O52％ 羧甲基纖維素(CMC)6.8％ 丙烯酸鹽液體CP540％20％ 過硼酸鈉(經(jīng)驗式NaBO2.H2O2)0.2％ EDTA21％ Na2SO4水(平衡量)可以采用在本文的實施例3中定義的所謂“性能因子”對洗滌性能的改進進行定量。
在本發(fā)明的一個非常令人感興趣的實施方案中，本發(fā)明的變體在“洗滌性能試驗”中測試時，其性能因子至少為1，如至少為1.5，例如至少為2，優(yōu)選至少為2.5，如至少為3，例如至少為3.5，特別是至少為4，如至少為4.5，例如至少為5。
明顯地，優(yōu)選本發(fā)明的變體至少在所述的最低水平上，更優(yōu)選在所述的中等水平上，最優(yōu)選在所述的最高水平上符合上述標準。
產(chǎn)生枯草桿菌酶變體用于克隆枯草桿菌酶的許多方法和用于將插入物導(dǎo)入基因(如枯草桿菌酶基因)的許多方法在本領(lǐng)域是熟知的，參見在“發(fā)明背景”部分引用的參考文獻。
通?？梢圆捎糜糜诳寺』蚝拖蛟摶蛞氩迦胛?隨機和/或定點)的標準方法以獲得本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。對于適宜的技術(shù)的進一步描述，參照本文的實施例(見下文)和(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel，F(xiàn).M.等人(編輯)“分子生物學(xué)最新方法”(“Current protocols in Molecular Biology”)，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編輯)“用于芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”(“Molecular Biological Methods forBacillus”)，John Wiley和Sons，1990)；和WO 96/34946。
而且，枯草桿菌酶變體可以通過用于人工產(chǎn)生多樣性的標準技術(shù)構(gòu)建，如通過不同枯草桿菌酶基因的DNA改組構(gòu)建(參見WO 95/22625；Stemmer WPC，自然370389-91(1994))。例如將編碼Savinase的基因與一種或多種部分枯草桿菌酶序列進行DNA改組，其中所述一種或多種部分枯草桿菌酶序列實際上已鑒定出與BLSAVI(Savinase)相比在任一上述位置處包含插入，在隨后進行卵抑制測定篩選后，即可提供適用于此處所述目的的枯草桿菌酶變體。
表達載體包含編碼本發(fā)明酶的DNA構(gòu)建體的重組表達載體可以是任何可方便地進行重組DNA操作的載體。載體的選擇一般取決于它將被導(dǎo)入的宿主細胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體而存在的載體，這種載體的復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒。
另外，所述載體可以在導(dǎo)入宿主細胞后被部分或全部整合入宿主細胞基因組中，并與其整合的染色體一起復(fù)制。
所述載體優(yōu)選為這樣的表達載體，其中編碼本發(fā)明的酶的多核苷酸可操作地與DNA轉(zhuǎn)錄所需的其它片段相連接。一般來說，表達載體來自質(zhì)?；虿《綝NA，或可以含有兩者的元件。術(shù)語“可操作地連接”指將諸片段以使其能按它們的預(yù)期目的協(xié)同發(fā)揮功能的方式排列，如轉(zhuǎn)錄在啟動子中引發(fā)并前行通過編碼此酶的DNA序列。
所述的啟動子可以是任何在所選擇的宿主細胞內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的多核苷酸序列，并可以得自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
用于細菌宿主細胞的適宜的啟動子的實例包括以下基因的啟動子嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)麥芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或λ噬菌體的PR或PL啟動子或大腸桿菌的lac、trp-或tac-啟動子。
如果需要，編碼本發(fā)明酶的DNA序列還可以可操作地連接到適宜的終止子上。
本發(fā)明的重組載體還可包含能夠使所述載體在所討論的宿主細胞中復(fù)制的多核苷酸。
所述載體還可以包含可選擇的標記，例如其產(chǎn)物彌補宿主細胞缺陷的基因，或編碼如對抗生素像卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等的抗性，或?qū)χ亟饘倩虺輨┑目剐缘幕颉?br> 為了指導(dǎo)本發(fā)明的酶進入宿主細胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號序列(也稱為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)?？梢詫⒎置谛盘栃蛄性谡_讀框中連接編碼酶的DNA序列。分泌信號序列一般位于編碼此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信號序列可以是通常與該酶相關(guān)的或來自編碼另一種分泌蛋白質(zhì)的基因。
分別用于連接編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動子和任選地終止子和/或分泌信號序列，或通過適宜的PCR擴增方案組裝這些序列和將它們插入含有復(fù)制或整合所需信息的適宜載體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的(參見例如，Sambrook等人，前引書)。
宿主細胞具有編碼本發(fā)明酶的DNA序列并導(dǎo)入到宿主細胞中的多核苷酸可以與所討論的宿主同源或異源。如果與所述宿主細胞同源，即由該宿主細胞天然產(chǎn)生，則該多核苷酸一般可操作地與非其天然環(huán)境中存在的另一啟動子序列相連接，或者適當(dāng)時與另一分泌信號序列和/或終止子序列相連接。術(shù)語″同源″旨在包括編碼天然存在于所討論的宿主生物體中的酶的DNA序列。術(shù)語“異源的”旨在包括所述宿主細胞本身不表達的DNA序列。因此DNA序列可以來源于另一生物體或者是合成的序列。
導(dǎo)入本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或重組載體的宿主細胞可以包括任何能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細胞，包括細菌、酵母、真菌和高等真核細胞，包括植物。
通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細菌宿主細胞的實例是革蘭氏陽性細菌，如芽孢桿菌菌株，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)或蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)，或鏈霉菌菌株(streptomyces)，如變鉛青鏈霉菌(S.lividans)或鼠灰鏈霉菌(S.murinus)，或革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌(Echerichia coli)。
細菌的轉(zhuǎn)化可以通過已知的方式用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或使用感受態(tài)細胞進行(參見Sambrook等人，見上)。
當(dāng)在細菌如大腸桿菌中表達酶時，該酶一般以非溶解性顆粒駐留于細胞質(zhì)中(稱作包涵體)，或可以由細菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)間隙。在前一種情況下，將細胞裂解，回收所述顆粒，變性，其后通過稀釋變性試劑使酶重新折疊。后一種情況下，該酶可以通過以下操作從周質(zhì)間隙中回收如超聲或滲透壓休克破壞細胞，使所述的周質(zhì)間隙的內(nèi)容物釋放，再回收該酶。
當(dāng)在革蘭氏陽性細菌如芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬菌株中表達該酶時，該酶可以駐留于細胞質(zhì)中，或由細菌分泌序列引導(dǎo)到胞外培養(yǎng)基中。在后一種情況下，該酶可按下述方法從培養(yǎng)基中回收。
產(chǎn)生枯草桿菌酶變體的方法本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的分離的酶的方法，其中在允許該酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)已用具有編碼該酶的DNA序列的多核苷酸轉(zhuǎn)化的合適宿主細胞，以及從培養(yǎng)物中回收所得的酶。
當(dāng)將含有編碼該酶的DNA序列的表達載體轉(zhuǎn)化入異源宿主細胞中時即可使本發(fā)明的酶異源重組產(chǎn)生。
由此可以產(chǎn)生以不含同源雜質(zhì)為特征的高度純化的枯草桿菌酶組合物。
本文中，同源雜質(zhì)是指來源于最初獲得本發(fā)明的酶的同源細胞的任何雜質(zhì)(例如除本發(fā)明的酶之外的其他多肽)。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞的培養(yǎng)基可以是任何適合于所討論的宿主細胞生長的常規(guī)培養(yǎng)基。所表達的枯草桿菌酶可方便地分泌到培養(yǎng)基中，然后可以通過已知的方法回收，所述方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞，再利用鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)性成分，接下來進行層析，如離子交換層析、親和層析等。
清潔和洗滌劑組合物一般來說，清潔和洗滌劑組合物已在本領(lǐng)域中有充分描述，對合適的清潔和洗滌劑組合物的進一步描述可以參見WO 96/34946；WO97/07202；WO 95/30011。
而且本文的實施例證明許多枯草桿菌酶變體對卵污漬具有改進的洗滌性能。
洗滌劑組合物枯草桿菌酶變體可以添加到洗滌劑組合物中而成為其中的組分。
例如，本發(fā)明的洗滌劑組合物可以制成用于手洗或機洗的洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理污染織物的洗滌添加劑組合物和漂洗添加的織物柔順劑組合物，或制成用于清潔普通家庭硬表面的洗滌劑組合物，或配制以用于手洗或機洗的洗盤操作。
在一特定的方面，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的枯草桿菌酶的洗滌添加劑。所述的洗滌添加劑和洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它的酶如另一種蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、例如漆酶，和/或過氧化物酶。
一般來說，所選擇的酶的性能應(yīng)當(dāng)與所選擇的洗滌劑相適應(yīng)(即最適pH，與其它酶和非酶組分具相容性等)，且所述的酶應(yīng)以有效劑量存在。
蛋白酶合適的蛋白酶包括來自動物、植物、微生物的蛋白酶。來源于微生物的蛋白酶是優(yōu)選的。也包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。所述的蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例為枯草桿菌蛋白酶，特別是來自芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例為胰蛋白酶(例如來自豬或牛的)和如WO 89/06270和WO 94/25583中所公開的鐮孢霉屬(Fusarium)的蛋白酶。
有用的蛋白酶的實例是如WO 92/19729，WO 98/20115，WO98/20116和WO 98/34946所描述的變體，特別是在一個或多個下述位置發(fā)生替換的變體27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。
優(yōu)選的可商購的蛋白酶包括AlcalaseTM，SavinaseTM，PrimaseTM，DuralaseTM，EsperaseTM和KannaseTM(Novozymes A/S)，MaxataseTM，MaxacalTM，MaxapemTM，ProperaseTM，PurafectTM，Purafect OxPTM，F(xiàn)N2TM和FN3TM(Genencor International Inc.)。
脂肪酶合適的脂肪酶包括那些來源于細菌或真菌的脂肪酶。也包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。有用的脂肪酶的實例包括來自腐質(zhì)霉屬(Humicola)(Thermomyces與之同物異名)，如EP 258 068和EP 305 216中所述的來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶或如WO 96/13580中所述的來自H.Insolens的脂肪酶；假單胞菌(Pseudomonas)脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)，施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，熒光假單胞菌(P.fluorescens)，假單胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/1201)；芽孢桿菌脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等人(1993)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(Biochemica et Biophysica Acta)，1131，253-360)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)。
其它的實例為如WO 92/05249，WO94/01541，EP 407 225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所述的脂肪酶變體。
優(yōu)選的可商購的脂肪酶包括LipolaseTM和LipolaseUltraTM(Novozymes A/S)。
淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括那些來源于細菌或真菌的淀粉酶。也包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。淀粉酶包括例如來源于芽孢桿菌的α-淀粉酶，例如來自地衣芽孢桿菌的特定菌株，詳細內(nèi)容參見GB 1,296,839。
有用的淀粉酶的實例是如WO 94/02597，WO 94/18314，WO96/23873和WO 97/43424中所描述的變體，尤其是那些在一個或多個下列位置發(fā)生替換的變體15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。
可商購的淀粉酶是DuramylTM，TermamylTM，F(xiàn)ungamylTM和BANTM(Novozymes A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(來自GenencorInternational Inc.)。
纖維素酶合適的纖維素酶包括來源于細菌或真菌的纖維素酶。也包括其經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮孢霉屬(Fusarium)、草根霉屬(Thielavia)、枝頂孢霉屬(Acremonium)的纖維素酶，例如可由在US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US 5,776,757和WO 89/09259中公開的Humicola insolens、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)產(chǎn)生的真菌纖維素酶。
特別合適的纖維素酶是具有顏色保護優(yōu)勢的堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的實例為如EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中所公開的纖維素酶。其它的實例為如那些在WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所公開的纖維素酶變體。
可商購的纖維素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(NovozymesA/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括那些來源于植物、細菌或真菌的過氧化物酶/氧化酶。也包括化學(xué)修飾或蛋白工程化的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括如WO 93/24618，WO 95/10602和WO 98/15257所述的來自鬼傘屬(Coprinus)(例如來自灰蓋鬼傘(C.cinereus))和其變體的過氧化物酶。
可商購的過氧化物酶包括GuardzymeTM(Novozymes A/S)。
所述的洗滌劑酶可以通過添加含一種或多種酶的獨立添加劑，或通過添加含所有這些酶的組合添加劑而被包含于洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，也就是獨立添加劑或組合添加劑可以制成例如顆粒狀、液體、漿狀等等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑形式為顆粒狀(特別是無粉塵顆粒)、液體(特別是穩(wěn)定的液體)或漿。
無粉塵顆?？梢勒绽鏤S 4,106,991和4,661,452所述進行生產(chǎn)并可任選地用已知的方法加包衣。蠟狀包衣材料的實例是平均分子量為1000到20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中，醇含12到20個碳原子且其中存在15到80個環(huán)氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中給出了適合于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實例。液體酶制劑可以依照現(xiàn)成的方法通過例如添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以穩(wěn)定。受保護的酶可依照EP 238,216中所公開的方法進行制備。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如棒狀、片狀、粉末、顆粒、粘團或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般含高達70％的水和0-30％的有機溶劑，或不含水的。
所述的洗滌劑組合物一般包含一種或多種表面活性劑，它們可以是非離子(包括半極性的)和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子表面活性劑。所述的表面活性劑一般占到0.1％到60％的重量。當(dāng)包含在所述洗滌劑中時，通常包含約1％到約40％的陰離子表面活性劑，如直鏈烷基苯磺酸鹽、α-烯屬磺酸鹽、硫酸烷基酯(硫酸脂肪醇酯)、乙氧基硫酸醇酯、仲鏈烷磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或鏈烯基琥珀酸或皂。
當(dāng)包含在所述洗滌劑中時，通常含有約0.2％到約40％的非離子表面活性劑例如乙氧基化脂肪醇、乙氧基化壬基酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
所述的洗滌劑可以包含0-65％的洗滌劑增潔劑或絡(luò)合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)盈B式硅酸鹽(例如購自Hoechst的SKS-6)。
所述的洗滌劑還可以包含一種或多種聚合物。實例為羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸如聚丙烯酸、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。
所述的洗滌劑還可以含有可以包含H2O2來源的漂白體系，如可以與形成過酸的漂白活化劑如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ趸交撬猁}結(jié)合的過硼酸鹽或過碳酸鹽?？蛇x擇地，所述的漂白體系可以包含例如酰胺、二酰亞胺或砜類的過氧酸。
本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶可以通過諸如以下的常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，且所述的組合物也可以按WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。
所述的洗滌劑還可以包含其它的常規(guī)洗滌劑成分例如織物調(diào)理劑包括黏土、增泡劑、泡沫抑制劑、抗腐蝕劑、污物懸浮劑、抗污物再沉淀劑、染料、殺菌劑、光學(xué)增白劑、助溶劑、失澤抑制劑或香料。
目前認為在所述洗滌劑組合物中任何酶，特別是本發(fā)明的酶可以以相當(dāng)于每升洗滌液中具有0.01-100mg酶蛋白質(zhì)，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選每升洗滌液中具有0.1-1mg酶蛋白質(zhì)的量加入。
此外，本發(fā)明的酶可以添加到如WO 97/07202所公開的洗滌劑制劑中，該文獻引入本文作為參考。
通過下述的實施例對本發(fā)明進行更詳細說明，這些實施例不作為對本發(fā)明請求保護范圍的任何限制。
在洗滌劑組合物中，簡寫成分的意義如下
LAS 直鏈C12烷基苯磺酸鈉TAS 牛油烷基硫酸鈉XYASC1x-C1y烷基硫酸鈉SS 式2-丁基辛酸的仲皂化表面活性劑25EY與平均為Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的主要為C12-C15的直鏈伯醇45EY與平均為Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的主要為C14-C15的直鏈伯醇XYEZS 每摩爾與平均Z摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的C1x-C1y烷基硫酸鈉非離子表面活性劑平均乙氧基化程度為3.8而平均丙氧基化程度為4.5的C13-C15混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，由BASF GmbH售出，商品名為PlurafaxLF404CFAAC12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAAC16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺硅酸鹽 無定型硅酸鈉(SiO2∶Na2O比率＝2.0)NaSKS-6 分子式為δ-Na2Si2O5的晶狀多層硅酸鹽碳酸鹽 無水碳酸鈉磷酸鹽 三磷酸鈉MA/AA 1∶4馬來酸/丙烯酸共聚物，平均分子量約為80,000聚丙烯酸平均分子量為8,000的聚丙烯酸均聚物，由BASF GmbH銷售，商品名為PA30沸石A 基本顆粒大小在1-10微米范圍內(nèi)的分子式為Na12(AlO2SiO2)12·27 H2O的水合硅鋁酸鈉檸檬酸鹽二水合三檸檬酸鈉Citric 檸檬酸過硼酸鹽無水過硼酸鈉一水合物漂白劑，經(jīng)驗式為NaBO2·H2O2PB4 無水過硼酸鈉四水合物過碳酸鹽經(jīng)驗式為2Na2CO3·3H2O2的無水過碳酸鈉漂白劑
TAED 四乙?；叶稢MC羧甲基纖維素鈉DETPMP 二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)，由Monsanto出售，商品名為Dequest 2060PVP聚乙烯吡咯烷酮聚合物EDDS 鈉鹽形式的乙二胺-N，N′-二琥珀酸[S，S]異構(gòu)體抑泡劑 25％固體石蠟，熔點溫度50℃，17％疏水硅石，58％石蠟油粒狀抑泡劑 12％硅氧烷/硅石，18％十八烷醇，70％粒狀淀粉硫酸鹽 無水硫酸鈉HMWPEO 高分子量聚環(huán)氧乙烷TAE 25 乙氧基(25)化牛油醇洗滌劑實施例I本發(fā)明的粒狀織物清潔組合物可如下制備直鏈C12烷基苯磺酸鈉 6.5硫酸鈉 15.0沸石A26.0次氮基三乙酸鈉 5.0酶 0.1PVP 0.5TAED 3.0硼酸 4.0過硼酸鹽 18.0苯酚磺酸鹽 0.1次要組分 補充至100％
洗滌劑實施例II本發(fā)明的致密顆粒織物清潔組合物(密度800g/l)可依照下述制備45AS 8.025E3S 2.025E5 3.025E3 3.0TFAA 2.5沸石A 17.0NaSKS-6 12.0檸檬酸3.0碳酸鹽7.0MA/AA 5.0CMC 0.4酶0.1TAED 6.0過碳酸鹽 22.0EDDS 0.3粒狀抑泡劑3.5水/次要組分 補充至100％
洗滌劑實施例III本發(fā)明的對洗滌彩色織物特別有用的粒狀織物清潔組合物可依照下述制備LAS 10.7 -TAS 2.4-TFAA- 4.045AS3.110.045E74.0-25E3S - 3.068E11 1.8 -25E5- 8.0檸檬酸鹽15.0 7.0碳酸鹽 - 10.0檸檬酸 2.53.0沸石A 32.1 25.0Na-SKS-6- 9.0MA/AA 5.05.0DETPMP 0.20.8酶 0.10 0.05硅酸鹽 2.5-硫酸鹽 5.23.0PVP 0.5-聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/ - 0.2乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物過硼酸鹽1.0 -苯酚磺酸鹽 0.2 -水/次要組分 補充至100％
洗滌劑實施例IV本發(fā)明的提供“洗滌過程中的柔順處理”能力的粒狀織物清潔組合物可依照下述制備45AS-10.0LAS 7.6 -68AS1.3 -45E74.0 -25E3- 5.0椰油-烷基-二甲基羥基乙基氯化銨 1.4 1.0檸檬酸鹽5.0 3.0Na-SKS-6- 11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.0 4.0DETPMP 0.4 0.4過硼酸鹽15.0 -過碳酸鹽- 15.0TAED5.0 5.0綠土黏土10.0 10.0HMWPEO - 0.1酶 0.10 0.05硅酸鹽 3.0 5.0碳酸鹽 10.0 10.0粒狀抑泡劑 1.0 4.0CMC 0.2 0.1水/次要組分 補充至100％
洗滌劑實施例V本發(fā)明的重垢型液體織物清潔組合物可依照下述制備酸式LAS- 25.0檸檬酸 5.0 2.0酸式25AS 8.0 -酸式25AE2S 3.0 -25AE7 8.0 -CFAA 5 -DETPMP 1.0 1.0脂肪酸 8 -油酸 - 1.0乙醇 4.0 6.0丙二醇 2.0 6.0酶 0.10 0.05椰油-烷基二甲基羥基乙基氯化銨 - 3.0綠土黏土 - 5.0PVP2.0 -水/次要組分 補充至100％粉末自動洗盤組合物I

粉末自動洗盤組合物II

粉末自動洗盤組合物III

粉末自動洗盤組合物IV

粉末自動洗盤組合物V

粉末和液體的具洗滌表面活性劑系統(tǒng)的洗盤組合物VI

非水性液態(tài)自動洗盤組合物VII

非水性液態(tài)洗盤組合物VIII

觸變性液體自動洗盤組合物IX

液體自動洗盤組合物X

含被保護的漂白顆粒的液體自動洗盤組合物XI

XII如I、II、III、IV、VI和X所述的自動洗盤組合物，其中，由過碳酸鹽替代過硼酸鹽。
XIII如I-VI所述的自動洗盤組合物，其還含有錳催化劑。所述的錳催化劑可以是例如，在“用于低溫漂白的高效錳催化劑”(“Efficientmanganese catalysts for low-temperature bleaching”)，自然，(1994)，369，637-639中所述的化合物中的一種。
材料和方法織物WFK10N標準織物片(卵污漬)由德國的WFK Testgewebe GmbH(Christenfeld 10，D-41379 Bruggen-Bracht)獲得。
菌株枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen等人，1990)。
遲緩芽孢桿菌309和147為遲緩芽孢桿菌的特定菌株，保藏在NCIB且保藏號為NCIB 10309和10147，在美國專利號3,723,250(此處引用作為參考)中進行了描述。
大腸桿菌MC 1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)138 179-207)通過常規(guī)方法成為r-，m+，也在美國專利申請系列號039,298中進行了描述。
質(zhì)粒pJS3包含編碼枯草桿菌酶309的合成基因的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體(Jacob Schiφdt等人在蛋白質(zhì)和肽通訊(Protein and Peptideletters)339-44(1996)中描述)。
pSX222枯草芽孢桿菌表達載體(描述見WO 96/34946)。
常規(guī)的分子生物學(xué)方法除非另外指出，DNA操作和轉(zhuǎn)化使用分子生物學(xué)標準方法進行(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel，F(xiàn).M.等人(編輯)“分子生物學(xué)最新方法”(“Currentprotocols in Molecular Biology”)，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編輯)“用于芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”(“Molecular Biological Methods for Bacillus”)，John Wiley和Sons，1990)。
DNA操作中使用的酶按照供應(yīng)商的說明書進行操作。
用于DNA操作的酶除非另外指出，所有用于DNA操作的酶如限制性內(nèi)切酶、連接酶等均來自New England Biolabs，Inc。
蛋白水解活性在本發(fā)明的上下文中蛋白水解活性是用Kilo NOVO蛋白酶單位(KNPU)表示的。所述的活性相對于酶標準品(SAVINASE)而確定，所述的測定是基于在標準條件下蛋白水解酶對二甲基酪蛋白(DMC)溶液的消化進行的，所述的標準條件為50℃，pH8.3，反應(yīng)時間9分鐘，測定時間3分鐘。需要時可向Novozymes A/S，Denmark索取AF 220/1文件夾(folder)，該文件夾特此包括在此作為參考。
GU是甘氨酸單位，定義為蛋白水解酶活性，即在標準條件下，N-乙?；业鞍鬃鳛榈孜镌?0℃溫育15分鐘，產(chǎn)生相當(dāng)于1毫摩爾甘氨酸的NH2-基團量。
也可以用PNA試驗根據(jù)與在美國油脂化學(xué)家學(xué)會會志(Journal ofAmerican Oil Chemists Society)，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，L.A.，(1988)中描述的可溶性底物琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯基-丙氨酸-對硝基苯酚反應(yīng)測定酶活性。
發(fā)酵產(chǎn)生枯草桿菌酶的發(fā)酵是通過將含有100ml BPX培養(yǎng)基的500ml帶擋板的三角瓶在回轉(zhuǎn)式搖床上(300轉(zhuǎn)/分鐘)于30℃培養(yǎng)5天而進行的。
因此，為了制備如2升的肉湯，同時發(fā)酵了20個三角瓶。
培養(yǎng)基BPX培養(yǎng)基組成(每升)馬鈴薯淀粉100g大麥粉50g大豆粉20gNa2HPO4×12H2O 9g泊洛尼克(Pluronic)0.1g酪蛋白酸鈉10g培養(yǎng)基中的淀粉用α-淀粉酶液化，并將培養(yǎng)基于120℃加熱滅菌45分鐘。滅菌后通過加入NaHCO3至0.1M，將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至9。
實施例1酶變體的構(gòu)建和表達定點誘變包含特定插入并包含特定替換的本發(fā)明的枯草桿菌酶309(savinase.)定點變體通過DNA片段的常規(guī)克隆(Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，1989)制備，其中所述DNA片段通過用包含所需插入的寡聚物進行PCR而產(chǎn)生(見下面)。
模板質(zhì)粒DNA為pJS3(見下面)，或為其包含枯草桿菌酶309的變體的類似物。
通過寡聚物定向誘變導(dǎo)入插入和替換來構(gòu)建變體。
將枯草桿菌酶309變體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。從這些轉(zhuǎn)化體的過夜培養(yǎng)物中純化的DNA通過限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段的純化、連接、枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化，從而轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌的轉(zhuǎn)化如Dubnau等人，1971，分子生物學(xué)雜志，56，209-221頁中所述進行。
定點誘變以在特定區(qū)域?qū)氩迦牒吞鎿Q用于進行定點誘變的總體策略是合成對應(yīng)于插入和替換位點側(cè)翼DNA序列的誘變引物(寡核苷酸)，通過限定插入和替換的DNA堿基對區(qū)分。
接下來，所得的誘變引物用于PCR反應(yīng)，模板為改變了的質(zhì)粒pJS3(見上面)。純化得到的PCR片段，并在第二輪PCR反應(yīng)中延伸，純化所得的PCR產(chǎn)物并在第三輪PCR反應(yīng)中延伸，然后用內(nèi)切酶消化，并克隆入大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體(見下面)。PCR反應(yīng)在通常條件下進行。
遵循這個策略，在savinase中構(gòu)建了兩個插入和一個替換，其中插入分別在位置99(*99aD)和217(*217aP)導(dǎo)入，替換在位置S99A導(dǎo)入(見下面)。
在位置99處的插入和替換是通過誘變引物(5′CCG AAC CTG AACCAT CCG CGG CCC CTA GGA CTT TAA CAG C 3′(有義)(SEQ IDNO3)與反向引物(5′GAG TTA AGC CCA GAA GAT GTG GAC GCG3′(反義)(SEQ ID NO4)進行PCR反應(yīng)而導(dǎo)入的。
所產(chǎn)生的PCR片段通過第二輪PCR向Savinase的C-端延伸，用引物5′CAT CGA TGT ACC GTT TGG TAA GCT GGC ATA TGT TG 3′(SEQ ID NO5)在位置217處導(dǎo)入插入。第二輪PCR產(chǎn)物用引物5′AACCGC ACA GCG TTT TTT TAT TGA TTA ACG CGT TGC3′(SEQ IDNO6)通過第三輪PCR向Savinase的C-端延伸，該引物位于pJS3中MluI位點下游。所有的PCR反應(yīng)使用質(zhì)粒pJS3作為模板。將從第三輪PCR得到的延伸DNA片段克隆入改變了的質(zhì)粒pJS3(見上面)的Sal I-和Mlu I-位點。
通過公知的技術(shù)將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，并對一個大腸桿菌菌落測序，以證實所設(shè)計的突變。
為了純化本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，將包含本發(fā)明變體的枯草芽孢桿菌pJS3表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌株，并如上所述在含有10μg/ml氯霉素(CAM)的培養(yǎng)基中發(fā)酵。
實施例2酶變體的純化該過程涉及到對在芽孢桿菌宿主細胞中產(chǎn)生本發(fā)明的枯草桿菌酶的2升規(guī)模發(fā)酵物進行純化。
用1升的燒杯于5000轉(zhuǎn)/分鐘離心約1.6升發(fā)酵肉湯35分鐘。用10％醋酸將上清調(diào)節(jié)至pH6.5，并通過Seitz Supra S100過濾板過濾。
用配備有Amicon SLY10 UF柱體的Amicon CH2A UF單元濃縮濾液至約400ml。離心并過濾該UF濃縮物，然后室溫下吸附于pH7的桿菌肽親和柱上。使用pH調(diào)節(jié)至7的25％異丙醇和1M氯化鈉(在具有0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖液中)將蛋白酶從該桿菌肽柱上室溫洗脫下來。
合并來自桿菌肽純化步驟的具蛋白酶活性的級分，并加至用pH調(diào)節(jié)至6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖液平衡過的750ml Sephadex G25柱(直徑為5cm)。
合并來自Sephadex G25柱的具蛋白水解活性的級分，并加至用pH調(diào)節(jié)至6.5的含0.01M二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣的緩沖液平衡過的150ml CM Sepharose CL 6B陽離子交換柱(直徑為5cm)。
使用在2升同一緩沖液中的0-0.1M氯化鈉線性梯度洗脫蛋白酶(對于枯草桿菌蛋白酶147，用0-0.2M氯化鈉)。
在最后的純化步驟中，合并來自CM Sepharose柱的含蛋白酶的級分，并在配備有GR81PP膜(來自Danish Sugar Factories Inc.)的Amicon超濾室中濃縮。
通過使用實施例1的技術(shù)來構(gòu)建和發(fā)酵，并通過以上的分離步驟，產(chǎn)生并分離了下列枯草桿菌蛋白酶309變體L42LN+P129PAS99SD+L42LNL42LN+L217LPL42LN+S99SD+P129PAS99A+S99SD+N155NA＝S99AD+N155NAS99A+S99SD+N155ND＝S99AD+N155NDS99A+S99SD+N155NR＝S99AD+N155NRS99A+S99SD+N155NF＝S99AD+N155NFS99A+S99SD+S188SE＝S99AD+S188SES99A+S99SD+S188SD＝S99AD+S188SDS99A+S99SD+S188SK＝S99AD+S188SKS99A+S99SD+S188SL＝S99AD+S188SLS99A+S99SD+S188SA＝S99AD+S188SAS99A+S99SD+S216SP＝S99AD+S216SPS99A+S99SD+S216SDP＝S99AI+S216SDPS99A+S99SD+S216SPD＝S99AD+S216SPDS99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+S216SDS99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+S216SEL217LPL217LAL217LDPS99SD+L217LPP129PA+L217LPS99A+S99SD+L217LP＝S99AD+L217LPS99A+S99SD+L217LDP＝S99AD+L217LDPS99A+S99SD+L217LPD＝S99AD+L217LPDS99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217LDS99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217LES99A+S99SD+N218NP＝S99AD+N218NPS99A+S99SD+N218NDP＝S99AD+N218NDPS99A+S99SD+N218NPD＝S99AD+N218NPD
實施例3“標準的洗滌劑洗滌性能試驗”為評估所選擇的枯草桿菌酶變體在標準洗滌劑組合物中的洗滌性能，用下述的實驗條件進行了標準洗滌實驗洗滌劑 標準洗滌劑洗滌劑劑量4.0g/lpH10.1洗滌時間 20分鐘溫度30℃水硬度 15°dH酶濃度 10nm(在洗滌劑溶液中)測試系統(tǒng)10ml燒杯和攪拌棒織物/體積 5件織物(2.5cm)/50ml洗滌劑溶液測試材料WFK10N(卵污漬)所述的標準洗滌劑的組成如下6.2％LAS(Nansa 80S)2％ C16-C18脂肪酸鈉鹽4％ 非離子表面活性劑(Plurafax LF404)22％ 沸石P10.5％ Na2CO34％ Na2Si2O52％ 羧甲基纖維素(CMC)6.8％丙烯酸液體CP5 40％20％ 過硼酸鈉(經(jīng)驗式NaBO2·H2O2)0.2％EDTA21％ Na2SO4水(平衡量)
通過添加HCl或NaOH將洗滌劑溶液的pH調(diào)節(jié)到10.1。通過向測試系統(tǒng)中添加CaCl2和MgCl2(Ca2+∶Mg2+＝4∶1)將水硬度調(diào)節(jié)到15°dH。洗滌后織物用自來水沖洗并于空氣中干燥。
對試驗材料的反射能力(R變體)的測定是用Macbeth ColorEye 7000光度計(Macbeth，Division of Kollmorgen Instruments Corporation，德國)在460nm下進行的。測定按照制造商的方法進行。
為確定空白值，進行了不添加酶的類似洗滌實驗。接下來如上述進行反射能力(R空白)的測定。
然后如上所述進行參考實驗，其中測定了親本酶的洗滌性能。接下來，如上所述測定了反射能力(R親本)。
洗滌性能用下述公式定義的性能因子(P)進行評估P＝(R變體-R空白)-(R親本-R空白)＝R變體-R親本實施例4″卵抑制測定″如下抑制試驗基于的原理是待試驗的枯草桿菌酶變體將催化肽-pNA鍵的水解，因此釋放黃色的pNA，其在405nm處可方便地檢測。在一段給定的時間后釋放的pNA量為對枯草桿菌酶活性的直接測定值。分別在存在或不存在抑制劑時實施此水解實驗，可獲得特定枯草桿菌酶變體被抑制程度的定量測定值。
反應(yīng)條件酶濃度 0.0003mg/mlIV-0類胰蛋白酶抑制劑的濃度 0.0015mg/ml起始底物濃度 0.81mM反應(yīng)時間 11分鐘試驗溫度 25℃試驗pH 8.6吸光度的測定波長在 405nm
試驗溶液底物溶液(2mM)將500mg Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA溶于4mlDMSO(200mM)。用下述緩沖液將該溶液稀釋100倍。在所得底物溶液中底物濃度為2mM。
抑制劑溶液(0.005mg/ml)將5mg IV-0類胰蛋白酶抑制劑(SigmaT-1886)溶于10ml水。用下述緩沖液將該溶液稀釋100倍。在所得抑制劑溶液中抑制劑濃度為0.005mg/ml。
酶溶液(0.001mg/ml)將1mg酶溶于10ml水。用下述緩沖液將該溶液稀釋100倍。在所得酶溶液中酶濃度為0.001mg/ml。
緩沖液(pH8.6)將15.7mg Tris溶于適量水中，并加入0.75ml 30％(w/v)BRIJ(BRIJ 35聚氧乙烯十二烷基醚，30％(w/v)，Sigma目錄號430AG-6)。用4M NaOH將pH調(diào)節(jié)至8.6，并用水稀釋該溶液至1升。
存在抑制劑的試驗將1體積單位(如80μl)抑制劑溶液與1體積單位(如80μl)酶溶液在合適的反應(yīng)容器(如分光光度計小室或微滴定板)中混合，并在25℃平衡15分鐘。向該反應(yīng)容器中加入1.375體積單位(如110μl)底物溶液，此后于405nm處測定吸光度11分鐘(如每10秒或每30秒測定一次)。用線性回歸分析計算吸光度曲線的斜率。吸光度曲線的斜率表示為α抑制劑。
不存在抑制劑的試驗將1體積單位(如80μl)緩沖液與1體積單位(如80μl)酶溶液在合適的反應(yīng)容器(如分光光度計小室或微滴定板)中混合，并在25℃平衡15分鐘。向該反應(yīng)容器中加入1.375體積單位(如110μl)底物溶液，此后于405nm處測定吸光度11分鐘(如每10秒或每30秒測定一次)。用線性回歸分析計算吸光度曲線的斜率。吸光度曲線的斜率表示為α。
空白將1體積單位(如80μl)抑制劑溶液與1體積單位(如80μl)緩沖液在合適的反應(yīng)容器(如分光光度計小室或微滴定板)中混合，并在25℃平衡15分鐘。向該反應(yīng)容器中加入1.375體積單位(如110μl)底物溶液，此后于405nm處測定吸光度15分鐘。這些測定值不用于計算，僅用作對照，即緩沖液和/或底物溶液中沒加入酶的情況。
剩余活性(RA)的計算根據(jù)下列公式計算酶剩余活性(RA)RA＝(α抑制劑/α)×100％用上述試驗獲得了下列結(jié)果

序 列 表<110> 諾和酶股份有限公司(Novozymes A/S)<120> 枯草桿菌酶變體<130> 10081.204-WO<140>
<141>
<160> 8<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 5<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述命名法舉例<400> 1Ala Gly Lys Ala Leu1 5<210> 2<211> 4<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述命名法舉例<400> 2Ala Gly Gly Leu1<210> 3<211> 40<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述有義引物<400> 3ccgaacctga accatccgcg gcccctagga ctttaacagc 40<210> 4<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述反義引物<400> 4gagttaagcc cagaagatgt ggacgcg 27<210> 5<211> 35<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 5catcgatgta ccgtttggta agctggcata tgttg 35<210> 6<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物<400> 6aaccgcacag cgttttttta ttgattaacg cgttgc36<210> 7
<211> 275<212> PRT<213> 解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) (枯草桿菌蛋白酶BPN′)<400> 7Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser
210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln275<210> 8<211> 269<212> PRT<213> 遲緩芽孢桿菌(B.Lentus)(枯草桿菌蛋白酶309)<400> 8Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp20 25 30Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser35 40 45Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr50 55 60His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu65 70 75 80Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala85 90 95Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala100 105 110Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile180 185 190Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr195 200 205Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala210 215 220Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 240Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu245 250 255Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 26權(quán)利要求
1.選自以下的枯草桿菌酶變體在位置42和43之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置51和56之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置155和161之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置187和190之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置216和217之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置217和218之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體；在位置218和219之間(BASBPN編號)包含至少一個額外氨基酸殘基的插入的枯草桿菌酶變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的變體，其中所述插入選自在位置51和52之間的插入、在位置52和53之間的插入、在位置53和54之間的插入、在位置54和55之間的插入、在位置55和56之間的插入(BASBPN編號)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的變體，其中所述插入選自在位置155和156之間的插入、在位置156和157之間的插入、在位置157和158之間的插入、在位置158和159之間的插入、在位置159和160之間的插入、在位置160和161之間的插入(BASBPN編號)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的變體，其中所述插入選自在位置187和188之間的插入、在位置188和189之間的插入、以及在位置189和190之間的插入(BASBPN編號)。
5.根據(jù)前面的權(quán)利要求中任意一項所述的變體，其中，當(dāng)在本說明書實施例4中公開的“卵抑制測定”中測試時變體具有至少10％的剩余活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的變體，其中變體具有至少15％、優(yōu)選地至少20％、更優(yōu)選地至少25％的剩余活性。
7.根據(jù)前面的權(quán)利要求中任意一項所述的變體，其中變體在所述位置之間包含一個以上的插入。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的變體，其中變體在不同的上述位置組之間包含兩個或多個插入。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的變體，其中變體在每一所述位置組之間包含兩個以上的插入。
10.根據(jù)前面的權(quán)利要求中任意一項所述的變體，其中變體包含至少一個其它的修飾。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的變體，其中修飾為替換。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的變體，其中所述插入選自X42XA，X42XT，X42XG，X42XS，X42XD，X42XE，X42XK，X42XR，X42XH，X42XV，X42XC，X42XN，X42XQ，X42XF，X42XI，X42XL，X42XM，X42XP，X42XW和X42XY。
13.根據(jù)權(quán)利要求2的變體，其中所述插入選自X51XA，X51XT，X51XG，X51XS，X51XD，X51XE，X51XK，X51XR，X51XH，X51XV，X51XC，X51XN，X51XQ，X51XF，X51XI，X51XL，X51XM，X51XP，X51XW和X51XY。
14.根據(jù)權(quán)利要求2的變體，其中所述插入選自X52XA，X52XT，X52XG，X52XS，X52XD，X52XE，X52XK，X52XR，X52XH，X52XV，X52XC，X52XN，X52XQ，X52XF，X52XI，X52XL，X52XM，X52XP，X52XW和X52XY。
15.根據(jù)權(quán)利要求2的變體，其中所述插入選自X53XA，X53XT，X53XG，X53XS，X53XD，X53XE，X53XK，X53XR，X53XH，X53XV，X53XC，X53XN，X53XQ，X53XF，X53XI，X53XL，X53XM，X53XP，X53XW和X53XY。
16.根據(jù)權(quán)利要求2的變體，其中所述插入選自X54XA，X54XT，X54XG，X54XS，X54XD，X54XE，X54XK，X54XR，X54XH，X54XV，X54XC，X54XN，X54XQ，X54XF，X54XI，X54XL，X54XM，X54XP，X54XW和X54XY。
17.根據(jù)權(quán)利要求2的變體，其中所述插入選自X55XA，X55XT，X55XG，X55XS，X55XD，X55XE，X55XK，X55XR，X55XH，X55XV，X55XC，X55XN，X55XQ，X55XF，X55XI，X55XL，X55XM，X55XP，X55XW和X55XY。
18.根據(jù)權(quán)利要求3的變體，其中所述插入選自X155XA，X155XT，X155XG，X155XS，X155XD，X155XE，X155XK，X155XR，X155XH，X155XV，X155XC，X155XN，X155XQ，X155XF，X155XI，X155XL，X155XM，X155XP，X155XW和X155XY。
19.根據(jù)權(quán)利要求3的變體，其中所述插入選自X156XA，X156XT，X156XG，X156XS，X156XD，X156XE，X156XK，X156XR，X156XH，X156XV，X156XC，X156XN，X156XQ，X156XF，X156XI，X156XL，X156XM，X156XP，X156XW和X156XY。
20.根據(jù)權(quán)利要求3的變體，其中所述插入選自X157XA，X157XT，X157XG，X157XS，X157XD，X157XE，X157XK，X157XR，X157XH，X157XV，X157XC，X157XN，X157XQ，X157XF，X157XI，X157XL，X157XM，X157XP，X157XW和X157XY。
21.根據(jù)權(quán)利要求3的變體，其中所述插入選自X158XA，X158XT，X158XG，X158XS，X158XD，X158XE，X158XK，X158XR，X158XH，X158XV，X158XC，X158XN，X158XQ，X158XF，X158XI，X158XL，X158XM，X158XP，X158XW和X158XY。
22.根據(jù)權(quán)利要求3的變體，其中所述插入選自X159XA，X159XT，X159XG，X159XS，X159XD，X159XE，X159XK，X159XR，X159XH，X159XV，X159XC，X159XN，X159XQ，X159XF，X159XI，X159XI，X159XM，X159XP，X159XW和X159XY。
23.根據(jù)權(quán)利要求3的變體，其中所述插入選自X160XA，X160XT，X160XG，X160XS，X160XD，X160XE，X160XK，X160XR，X160XH，X160XV，X160XC，X160XN，X160XQ，X160XF，X160XI，X160XL，X160XM，X160XP，X160XW和X160XY。
24.根據(jù)權(quán)利要求4的變體，其中所述插入選自X187XA，X187XT，X187XG，X187XS，X187XD，X187XE，X187XK，X187XR，X187XH，X187XV，X187XC，X187XN，X187XQ，X187XF，X187XI，X187XL，X187XM，X187XP，X187XW和X187XY。
25.根據(jù)權(quán)利要求4的變體，其中所述插入選自X188XA，X188XT，X188XG，X188XS，X188XD，X188XE，X188XK，X188XR，X188XH，X188XV，X188XC，X188XN，X188XQ，X188XF，X188XI，X188XL，X188XM，X188XP，X188XW和X188XY。
26.根據(jù)權(quán)利要求4的變體，其中所述插入選自X189XA，X189XT，X189XG，X189XS，X189XD，X189XE，X189XK，X189XR，X189XH，X189XV，X189XC，X189XN，X189XQ，X189XF，X189XI，X189XL，X189XM，X189XP，X189XW和X189XY。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的變體，其中所述插入選自X216XA，X216XT，X216XG，X216XS，X216XD，X216XE，X216XK，X216XR，X216XH，X216XV，X216XC，X216XN，X216XQ，X216XF，X216XI，X216XL，X216XM，X216XP，X216XW和X216XY。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的變體，其中所述插入選自X217XA，X217XT，X217XG，X217XS，X217XD，X217XE，X217XK，X217XR，X217XH，X217XV，X217XC，X217XN，X217XQ，X217XF，X217XI，X217XI，X217XM，X217XP，X217XW和X217XY。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的變體，其中所述插入選自X218XA，X218XT，X218XG，X218XS，X218XD，X218XE，X218XK，X218XR，X218XH，X218XV，X218XC，X218XN，X218XQ，X218XF，X218XI，X218XL，X218XM，X218XP，X218XW和X218XY。
30.根據(jù)前面的權(quán)利要求中任意一項所述的變體，其中親本枯草桿菌酶屬于亞組I-S1。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的變體，其中親本枯草桿菌酶選自BSS168，BSSAS，BSAPRJ，BSAPRN，BMSAMP，BASBPN，BSSDY，BLSCAR BLKERA，BLSCA1，BLSCA2，BLSCA3，BSSPRC和BSSPRD，或它們的保留了亞組I-S1特性的功能性變體。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-29中任意一項所述的變體，其中親本枯草桿菌酶屬于亞組I-S2。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的變體，其中親本枯草桿菌酶選自BSAPRQ，BLS147，BSAPRM，BAH101，BLSAVI(BLS309)，BSKSMK，BAALKP(BAPB92)，BLSUBL，BSEYAB，TVTHER和BSAPRS，或它們的保留了亞組I-S2特性的功能性變體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的變體，其中親本枯草桿菌酶為BLSAVI(Savinase)。
35.根據(jù)權(quán)利要求32-34中任意一項所述的變體，其中變體還包含至少一個在下列位置處的修飾27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、129、131、132、133、143、159、167、170、192、194、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252或274(BASBPN編號)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的變體，其中變體還包含修飾S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K。
37.根據(jù)權(quán)利要求32-36中任意一項所述的變體，其中變體還在位置95至103(BASBPN編號)的活性位點環(huán)(b)區(qū)域中包含至少一個額外的氨基酸殘基。
38.分離的多核苷酸，其具有編碼如權(quán)利要求1-37中任意一項所定義的枯草桿菌酶變體的DNA序列。
39.包含權(quán)利要求38的分離的多核苷酸的表達載體。
40.用權(quán)利要求39的表達載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的微生物宿主細胞，其為細菌，優(yōu)選地為芽孢桿菌，尤其為遲緩芽孢桿菌。
42.根據(jù)權(quán)利要求40的微生物宿主細胞，其為真菌或酵母，優(yōu)選地為絲狀真菌，尤其為曲霉(Aspergillus)。
43.用于產(chǎn)生如權(quán)利要求1-37中任意一項所定義的枯草桿菌酶變體的方法，其中，在有益于變體表達和分泌的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求40-42中任意一項所定義的宿主，以及回收變體。
44.一種清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選地為洗衣或洗盤組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求1-37中任意一項所定義的變體。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的組合物，其還包含纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、其它蛋白酶、淀粉酶或它們的混合物。
46.如權(quán)利要求1-37中任意一項所定義的變體在洗衣和/或洗盤洗滌劑中的用途。
47.一種除去硬表面或衣物上的卵污漬的方法，所述方法包括使含卵污漬的硬表面或含卵污漬的衣物與清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選地與洗衣或洗盤組合物接觸，其中所述組合物包含如權(quán)利要求1-37中任意一項所定義的枯草桿菌酶變體。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中組合物另外還包含纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、其它蛋白酶、淀粉酶或它們的混合物。
49.清潔或洗滌劑組合物用于從衣物或硬表面上除去卵污漬的用途，其中，所述組合物優(yōu)選地為洗衣或洗盤組合物，并且所述組合物包含如權(quán)利要求1-37中任意一項所定義的枯草桿菌酶變體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的用途，其中組合物另外還包含纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化還原酶、其它蛋白酶、淀粉酶或它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了存在于卵中的物質(zhì)如IV－0類胰蛋白酶抑制劑對其的抑制作用具有降低趨勢的新枯草桿菌酶(subtilase)變體。具體地說，公開了在位置42－43，51－56，155－161，187－190，216－217，217－218或218－219(BASBPN編號)之間包含至少一個額外的氨基酸殘基的變體。這些枯草桿菌酶變體當(dāng)用于如清潔或洗滌劑組合物，諸如洗衣組合物和洗盤組合物，包括自動洗盤組合物中時，表現(xiàn)出優(yōu)良的或改進的卵污漬洗滌性能。本發(fā)明也公開了編碼變體的分離的DNA序列、表達載體、宿主細胞以及產(chǎn)生和使用本發(fā)明變體的方法。進一步地，還公開了包含變體的清潔和洗滌劑組合物。
文檔編號C12N1/21GK1592784SQ01817275
公開日2005年3月9日 申請日期2001年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月13日
發(fā)明者M·內(nèi)勒高-馬森, L·B·拉森, P·K·漢森 申請人:諾和酶股份有限公司