專利名稱：：蜱傳黃病毒的全長感染性cDNA克隆的制作方法蜱傳黃病毒的全長感染性cDNA克隆本申請為分案申請，原申請的申請閂為2001年2月9日，申請?zhí)枮?1807849.4(PCT/US01/04460)，發(fā)明名稱為"蜱傳黃病毒的全長感染性cDNA克隆"。
背景技術(shù)：
：在黃病毒科家族的節(jié)肢動物傳播黃病毒屬中有超過60種抗原性相關(guān)的、正鏈RNA病毒，其中許多是重要的人類病原體。黃病毒家族的抗原性相關(guān)的蜱傳腦炎病毒復(fù)合體包括蜱傳腦炎病毒(TBEV，以前被稱為俄國春夏腦炎病毒)、科薩努爾森林疾病、Langat、跳躍病、Negishi、鄂木斯克出血熱以及Powassan病毒(Calisher,C.H.，Karabatsos,N.，Dalrymple,J.M.，Shope,R.E.,Porterfield,J.,Westaway，E.G.,和Brant，W.E.(1989)通過用多克隆抗血清的交叉中和試驗確定黃病毒之間的抗原性相互關(guān)系。J.Gen.Virol.,70，27-43.;Monath，T.P.，和Heinz,F.X.(1996)黃病毒。見"菲爾茲病毒學(xué)"。(B.N.Fields，D.M.Knipe&P.M.Howley,主編)，第三版，961-1035頁。Lippincott-Raven發(fā)行商，費城和紐約)。這些病毒在北半球大多數(shù)地區(qū)流行，且除了Langat外，引起不同嚴(yán)重程度的人類疾病，可有高達(dá)20%至30%的死亡率。蜱傳腦炎在東歐和俄羅斯仍然是一種急需解決的公共衛(wèi)生問題，每年有9，000-12，000個病人得到診斷。據(jù)記載1956年和1964年死亡率明顯增加，其死亡率達(dá)到每100,000人中4,500-4,600人(Gaidamovich，S.Y.(1995)蜱傳黃病毒感染。見"外來病毒感染"。(J.S.Porterfield,主編)203-221頁。Chapman&Ha11，倫J^)。蜱傳腦炎黃病毒具有衣殼糖蛋白表位，后者經(jīng)常誘導(dǎo)組內(nèi)病毒之間的交叉抗性。大約30年前，這些抗原交叉反應(yīng)的特性和隨后對毒力多樣性的認(rèn)識表明，成功的免疫作用可以采用一個活的、天然減毒的蜱傳黃病毒來獲得(II'enko，V.I.，Smorodincev,A.A.,Prozorova，I.N.，和Platonov，V.G.(1968)從研究來自馬來Langat病毒TP21株的一個活疫苗中獲得了經(jīng)驗。Bull.W.H.0.39，425-431.;Price,W.H.，Thind,I.S,，Teasdall,R.D.,和0，Leary,W.(1970)用減毒的LangatE5病毒對人類志愿者進行抗俄國春夏病毒(RSS)復(fù)合體的免疫。Bull.W.H.0.42,89_94.;Mayer，V.，0rolin,D.，Pogady,_J.，Starek，M.,Kubistova，K.，Gajdo-Sova，E.,和Buran,I.(1976)試驗性活蜱傳腦炎疫苗(LangatE5"14"病毒克隆)志愿者單劑量免疫后1年和2年。Actavirol.,20,215-225.)。推動這個研究的是從馬來西亞的虱子中發(fā)現(xiàn)的一種病毒，稱為Langat病毒(LGT)，TP21株，它看起來在自然條件下與人類疾病沒有關(guān)系(GordonSmith,C.E.(1956)—種來自馬來亞硬蜱的類似俄國春夏腦炎病毒的病毒。自然(倫敦)178，581-582。)。用LGT對動物和人志愿者的免疫作用引起高水平的、抗TBEV復(fù)合體許多成員的病毒中和抗體，如Powassan、科薩努爾森林病毒和TBEV(Price,W.H.，Thind，:[S.，Teasdall，R.D.，和0'Leary，W.(1970)用減毒W(wǎng)LafigatE5病毒對犬類;S1慰者進行抗俄國春夏病毒(RSS)復(fù)合體的免疫。Bull.W.H.0.42,89-94.;Price,W.11.，和Thind，I.S.，(1973)用減毒的LangatE5病毒免疫小鼠抗俄國春夏病毒復(fù)合體，免疫猴抗Powassan病毒。Am.J.Trop.Med.Hyg.22，100-108.)。盡管如此，TP21在小鼠中檢驗時具有神經(jīng)毒性和神經(jīng)侵襲性("外周毒性")，因此作為一個疫苗候選物來應(yīng)用時被認(rèn)為太危險。(GordonSmith,C.E.(1956)—種來自馬來亞硬蜱的類似俄國春夏腦炎病毒的病毒。自然(倫敦)178，581-582.;Thind,I.S.,和Price,W.H.(1966a)—個Langat病毒的雞胚減毒株(TP21E5)。I.病毒對小鼠和猴的毒性。Am.J.Epidemiol.，84,193-213.;Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998)通過與蚊傳黃病毒登革熱4型嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，1746-1751。)。雖然通過腦內(nèi)接種觀察的TP21Langat病毒可檢測到直接的神經(jīng)毒性，其外周毒性(神經(jīng)侵襲性)明顯低于很毒的TBEV遠(yuǎn)東株，后者引起有20%至30%死亡率的人類疾病。用于小鼠和猴的部分減毒的幾個LGT株已在美國、俄羅斯和捷克被分離和研究(Nathanson,N.，Thind，I.S.,O'Leary,W.,和Price,W.H.(1968)B組蟲媒病毒的猴神經(jīng)毒性的組織學(xué)研究。IV.Langat病毒一個減毒株(E5)的評價。Am.J.Epidemiol.88,103-112.;Price,W.H.,Thind,I.S.，Teasdall,R.D.，和0，Leary，W.(1970)用減毒的LangatE5病毒進行抗俄國春夏(RSS)病毒復(fù)合體的人類志愿者接種。Bull.W.H.0.42，89-94.;Mayer,V.，0rolin,D.，Pogady，J.，Sta.rek，M.，Kubistova，K.，Gajdo-Sova,E.,禾口Buran，I.(1976)試驗性活蜱傳腦炎疫苗(LangatE5"14"病毒克隆)志愿者單劑量免疫后l年和2年。Actavirol.，20，215-225.;Smorodincev,A.A.,和Dubov，A.V.(1986)抗蜱傳腦炎的活疫苗。見"蜱傳腦炎及其疫苗預(yù)防"，(A.A.Smorodincev,主編.)，190-211頁。Meditsina，Leningrad.)。在20世紀(jì)70年代早期，作為抗TBEV的一個試驗性活疫苗，一個被命名為Yela核苷酸ev的這樣的病毒株在俄羅斯超過600,000個被接種者中進行了廣泛的研究(Smorodincev,A.A.,和Dubov，A.V.(1986)抗蜱傳腦炎的活疫苗。見"蜱傳腦炎及其疫苗預(yù)防"，(A.A.Smorodincev,主編.)，190-211頁。Meditsina，Leningrad.)。當(dāng)知道疫苗的接種伴有發(fā)生頻率非常低的腦炎時，研究被中止，發(fā)生率大約為每20，000次接種有一例。盡管如此，此經(jīng)歷證實了最初的觀點，即LGT是高度減毒的，并明顯地是蜱傳黃病毒復(fù)合體中最良性的成員。此后不久，LGT的一個更加減毒的變異體，命名為E5株，通過在受孕的雞卵中傳42代被篩選出來。LGTE5較其TP21親代對小鼠和猴具有更低的毒性。最近，一個研究證明E5在小鼠中具有較其TP21親代更低的神經(jīng)毒性(Pletnev,A.G.，和Men，R.(1998)通過與蚊傳黃病毒登革熱4型嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci,USA,95，1746-1751。)。而且，與其TP21親代不同，E5具有非常小的神經(jīng)侵襲性，僅在用最大可能劑量的病毒外周接種的一小部分小鼠中能被檢測到。在考慮將LGT毒性更小的E5變異株用作預(yù)防由蜱傳黃病毒組特定成員引起的嚴(yán)重人類疾病的候選物之前，為了安全起見，科學(xué)家必須降低或去除LGTTP21和E5對小鼠的最終殘余毒性，通過采用過去曾成功用于減毒登革熱病毒的方法，即，將位點特異的變異導(dǎo)入病毒的全長感染性cDNA。因此，需要Ungat的全長感染性cDNA克隆。附圖簡述圖1.LGTTP21基因組全長cDNA的構(gòu)建。(A).TP21的全長cDNA在一個質(zhì)粒中的裝配釆用cDNA片段進行，該片段按以前所述被克隆和測序(Pletnev,A.G.，和Men,R.(1998)通過與蚊傳黃病毒登革熱4型嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95，1746-1751。)或得自長PCR。(B).通過單一的長PCR構(gòu)建全長cDNA。(C).從基因組的兩個cDNA片段裝配全長cDNA，兩個片段來自一個較低滴度的病毒制劑(3.8Xl(fPFU/ml)。Notl、Kpnl、Apal、Nsil和EcoRV在cDNA上切割位點的位置在A或C中通過虛線來表示。實線表示PCRcDNA片段或TP21基因組克隆的片段。短的水平箭頭表示SP6啟動子的位置或引物的位置；垂直的實線箭頭表示克隆方法中的后續(xù)步驟。在LGTcDNA片段末端的數(shù)字分別代表基因組的第一個和最后一個核苷酸位置。NT編號來自TP21基因組RT-PCR的測序結(jié)果(表1)。注BgIII和BamHI片段在質(zhì)粒p51或p624-3的連接消除了BgIII和BamHI的切割位點。圖2.來自TP21基因組的PCR擴增cDNA通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳分析。盯-PCR產(chǎn)物用TP21病毒的RNA合成，該病毒分離自低滴度病毒(l道；Vero細(xì)胞中滴度為3.8Xl()3pFU/ml)或高滴度病毒(2道；在同一個細(xì)胞系中滴度為2.4X109PFU/ml)。PCR采用寡聚1444和1445作為引物在實例中描述的條件下進行，10升反應(yīng)混合物上膠。大約llkb長度的片段(A帶)代表完全或接近完全的全長基因組cDNA。從膠中分離并用于轉(zhuǎn)錄RNAs，后者接著被用來在細(xì)胞培養(yǎng)中轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。大約4kb長度的較短片段(B帶)從膠中提取后被測序。分子量標(biāo)記在M道中顯示。緊鄰頂端的標(biāo)記對應(yīng)于llkb。圖3.在SCID小鼠中檢測LGTTP21的兩個感染性cDNA來源的克隆的神經(jīng)侵襲性。在腹腔內(nèi)接種102PFU的克隆636或656后，比較它們與未克隆的TP21親代病毒及其毒性更低的E5衍生物的死亡率。前面描述的對正常小鼠有感染性的TP21/DEN4和E5/DEN4嵌合體作為病毒對照，在SCID小鼠中是完全減毒的。因此嵌合體以較高的劑量(即，105PFU)腹腔內(nèi)接種。圖4.LGTE5基因組全長cDNA的構(gòu)建。(圖4A).E5的全長cDNA在質(zhì)粒中的裝配采用pTP21-636和來自長PCR的Sfil(133)-Agel(9737)片段進行，pTP2l-636如前所述被克隆和測序。(圖4B).在E5基因組的3'-NCR中缺失部分的構(gòu)建和定位。cDNA中的Notl、Sfil、Agel、AfIII、Kpnl和EcoRV切割位點的位置在(圖4A)或(圖4B)中以虛線表示。實線表示來自E5基因組的PCRcDNA片段。短的水平箭頭表示SP6啟動子的位置或引物的位置；垂直實箭頭表示克隆方法中的隨后步驟。LGTcDNA片段末端的數(shù)字分別代表基因組第一個和最后一個核苷酸位置。核苷酸(nt)編號來自E5基因組(GenBank登記號AF253420)RT-PCR的測序結(jié)果。顯示了在3，-NCR中引入缺失的位置，從ntl0,379延伸至斑紋方框頂端指示的位置。(圖4C).測定缺失變異體cDNA基因組的3'-NCR連接的序列。LGTE5核苷酸序列以粗體字母顯示。用于產(chǎn)生缺失的AfIII切割位點和TAA終止密碼子用下劃線的序列表示。也顯示了缺失的大小、其位置及相應(yīng)的質(zhì)粒構(gòu)建物。圖5.分析親代E5及其重組衍生病毒在猿LLQ^和Vero細(xì)胞中的生長。細(xì)胞用指定的病毒以O(shè).OlMOI感染，在病毒吸附l小時后，移除接種物并加入新鮮的培養(yǎng)基。在指定的時間收獲培養(yǎng)基中的病毒，并用斑點形成試驗在不同的細(xì)胞上按實例中所述測定其滴度。表格的簡要描述表1.1XTTP21株和E5株之間基因組序列的差異，通過最初在大腸桿菌中克隆的病毒基因組片段的序列分析來確定，或在通過RT-PCR衍生后直接測定。表2.在從質(zhì)粒cDNA中獲取感染性LGTTP21過程中發(fā)生的序列變化。表3.在成年Swiss小鼠中，親代LGT株和cDNA來源的LGTTP21病毒克隆的神經(jīng)侵襲性。表A.在蚊子細(xì)胞中回收TP21/DEN4和E5/DEN4嵌合體時獲得的變異體適合于在猿Vero細(xì)胞中有效生長。表B.用來免疫的、在Vero細(xì)胞中生長的LGT/DEN4嵌合體的神經(jīng)侵襲性。表C.用低劑量LangatTP21/DEN4(vac)嵌合體腹腔內(nèi)(IP)免疫近親繁殖的小鼠可防護隨后的高毒力TBEVAbsettarov株的腹腔內(nèi)激發(fā)。表D.用Langat(LGT)/DEN4嵌合體腹腔內(nèi)(IP)免疫Swiss小鼠可防護隨后的高毒力TBEVSofjin株的腹腔內(nèi)激發(fā)。表I.在克隆、從全長cDNA中獲取E5以及在猿Vero或雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞培養(yǎng)中傳代過程中發(fā)生的E5共有序列的改變。表II.在卵中傳代、隨后從全長cDNA中回收、以及從其3'非編碼區(qū)中刪除320個核苷酸的過程中，Langat病毒(LGT)神經(jīng)侵襲性的承襲和降低。表III.腹腔內(nèi)接種E5或重組cDNA來源的E5(克隆E5-651或克隆E5-3，--320)后14或28天，從瀕死小鼠腦中回收的病毒中的非編碼或編碼改變。表IV.在Swiss小鼠中LGT病毒株的抗體反應(yīng)和保護效應(yīng)。發(fā)明概述7Langat蜱傳黃病毒的感染性cDNA克隆在外周神經(jīng)毒力方面與其親代不同。從體虱中獲得(rescued)的蜱傳黃病毒株LangatTP21(LGTTP21)，對人類是自然減毒的，但保留了對小鼠的可確證的神經(jīng)毒性和外周毒性("神經(jīng)侵襲性")。以前，一個對小鼠毒性較低的變異體，E5株，得自LGTTP21。從大腸桿菌中克隆的cDNA片段制備一個全長感染性TP21cDNA的許多嘗試都沒有成功。一個較從這些克隆的cDNA片段和相似的E5cDNA片段中獲得的序列具有更多信息的序列，來自RT-PCR片段，該片段還沒有在大腸桿菌中克隆。對TP21和E5的RT-PCR共有序列的比較確定了僅有7個氨基酸的差異，可能是觀察到的這些病毒株對小鼠毒性不同的原因。TP21的ll個獨立的感染性cDNA克隆采用兩個重疊的長RT-PCR片段進行回收。重要的是，用來制備cDNA作為PCR模板的低滴度病毒在生長周期的早期收獲以減少在感染晚期積累的缺失變異體的頻率。用來分析的4個獲得克隆與共有序列存在克隆特異性的最小偏差，但這種有限的變化與對免疫活性小鼠的外周毒性消失有關(guān)。這些克隆的基因操作將促使LGT毒性的降低，并加速形成安全和有效的蜱傳黃病毒疫苗，這將產(chǎn)生對高度毒性的蜱傳腦炎病毒復(fù)合體病毒的防護。嵌合的Langat/登革熱病毒可保護小鼠免受蜱傳腦炎病毒高毒力株的異種激發(fā)Langat病毒(LGT)，一種蜱傳黃病毒，對人類是天然減毒的，但它對SCID小鼠卻毒性很高。相反，在蚊子細(xì)胞培養(yǎng)中收獲的LGT(preM和E基因)和登革熱4型病毒(所有其他序列)的活性重組嵌合體在SCID小鼠中是完全減毒的，但仍然能夠提供抗LGT的保護作用。為了將嵌合體發(fā)展成為疫苗侯選物，我們將它們適于在猿Vero細(xì)胞中有效地復(fù)制，這是人體疫苗的一個滿意底物。適合的嵌合體對SCID小鼠仍然是完全減毒的，并在免疫活性小鼠中顯著地提供了抗蜱傳腦炎病毒的保護作用，后者是蜱傳黃病毒中毒性最強的。減毒Langat蜱傳黃病毒(E5株)的感染性cDNA克隆和從它構(gòu)建的3'缺失變異體在免疫缺陷(SCID)小鼠中具有神經(jīng)侵襲性降低。45年前，一種天然減毒的蜱傳黃病毒，Langat(LGT)TP21株，在馬來西亞從體虱中獲得。隨后，它被作為毒性蜱傳腦炎病毒的活減毒疫苗而進行測試。在一個大型臨床試驗中，其減毒作用被證實，但有低水平殘余毒性的證據(jù)。35年前，LGTTP21的進一步減毒通過在雞胚中多次傳代產(chǎn)生變異體E5而獲得。為了研究E5具有的進一步減毒作用的遺傳決定簇，并使我們能夠操作該病毒的基因組以開發(fā)一個滿意的活減毒蜱傳黃病毒疫苗，我們從一個全長cDNA克隆中獲得感染性E5病毒。從一個全長感染性cDNA克隆中獲得的重組E5病毒(克隆651)在免疫缺陷小鼠中較其生物學(xué)來源的E5親代毒性更低。減毒作用的增加與三個^基酸替代有關(guān)，兩個位于結(jié)構(gòu)性蛋白E，一個位于非結(jié)構(gòu)性蛋白NS4B上。隨后通過在感染性全長E5cDM的3'-非編碼區(qū)產(chǎn)生一個活的320核苷酸缺失區(qū)達(dá)到了更大程度的減毒。這種缺失變異體在猿Vero細(xì)胞中不是細(xì)胞變性的，它較其E5-651親代復(fù)制至較低的滴度。此外，E53，缺失變異體在SCID小鼠中的神經(jīng)侵襲性較其E5-651親代低。明顯地，已證明缺失變異體在SCID小鼠中較其祖先，LGTTP21株的神經(jīng)侵襲性低119,750倍。盡管其高水平的減毒，E53'缺失變異體保留了高度的免疫原性，在Swiss小鼠中腹腔內(nèi)接種10PFU導(dǎo)致對隨后腹腔內(nèi)2，000LDs。野生型LGTTP21激發(fā)的完全保護作用。發(fā)明詳述I部分Langat蜱傳黃病毒的感染性cDNA克隆，在外周神經(jīng)毒性上與其親代不同TP21和E5基因組的共有序列。野生型LGT病毒(TP21株)基因組以及它在雞胚組織經(jīng)多次傳代后獲得的毒性更低的衍生物，E5株，的全部核苷酸序列以前從大腸桿菌中克隆的cDNA片段測定(Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998)通過與蚊傳黃病毒登革熱4型嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，1746-1751。)。最初從這些來自TP21高滴度病毒懸液RNA的cDNA片段中制備LGTTP21的感染性全長cDNA克隆的嘗試均未成功(圖1，A部分)。在質(zhì)粒中組裝了12個穩(wěn)定的單個全長cDNAs，但從這些cDNA克隆中轉(zhuǎn)錄的RNAs對猿Vero或LLCMK2細(xì)胞培養(yǎng)物是非感染性的，其原因在當(dāng)時并不清楚。這可能是在Vero細(xì)胞中的病毒擴增過程中或全長cDNA克隆在細(xì)菌載體中擴增的過程中，LGT基因組中自發(fā)變異的結(jié)果。由于這個原因，決定重新測定LGT基因組的序列，通過直接測序RT-PCRcDNA片段而沒有像先前在細(xì)菌中克隆。代表TP21或E5病毒全長基因組的4個重疊cDNA片段采用高精度PCR來產(chǎn)生，并測定這些重疊片段的序列。每個病毒的序列測定兩次，一次用來源于滴度為3.8X103pFU/ml(TP21)或1.2X104pFU/ml(E5)病毒懸液的片段，一次用一天后收獲的、滴度為2.2X106pFU/ml(TP21)或4.0X106PFU/ml(E5)的病毒懸液的片段。發(fā)現(xiàn)兩個LGT株基因組的共有序列與以前公布的、從大腸桿菌中克隆的cDNA片段確定的序列不同(表1)。TP21和E5基因組在長度上均是10，943個核苷酸(nt)，并含有一個130個核苷酸的5'非編碼區(qū)和一個568個核苷酸的3'非編碼區(qū)。兩個LGT株的5'末端序列是相同的。3'末端也是一樣。來自RT-PCR的TP21和E5的共有序列被認(rèn)為對于鑒定病毒株特異的變異較來自大腸桿菌中克隆的單一DNA片段的序列具有更多的信息，這些特異的變異可能是生物學(xué)特性不同的原因。在兩種LGT株(TP21和E5)的共有序列中有12個核苷酸差異，其中7個在包衣結(jié)構(gòu)蛋白E或非結(jié)構(gòu)蛋白NS3或NS5上產(chǎn)生了一個氨基酸替代(表1)。在TP21和E5RT-PCR共有序列的7個氨基酸改變中，以前當(dāng)TP21和E5cDNA在大腸桿菌中被克隆時(Pletnev，A.G.,和Men,R.(1998)通過與蚊傳黃病毒登革熱4型嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95，1746-1751.)曾觀察到有4個氨基酸差異(在E上AsnM9變成Asp，在NS3上Asn22變成Ser、Phe248變成Tyr和Phe3,7變成Leu)。其他三個氨基酸替代(在E蛋白上Phe119變成Val，在NS5蛋白上Ser422變成Thr,Arg542變成Lys)在從TP21和E5的RT-PCR片段中確定的共有序列中被確定。以前在TP21和E5克隆片段的序列中檢測到的其他6個氨基酸差異(Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998)通過與蚊傳黃病毒登革熱4型嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95，1746-1751。)，未在RT-PCR共有序列中發(fā)現(xiàn)。用克隆cDNA觀察到的稍微大的變異性可能反映了在克隆過程中的細(xì)菌篩選作用和/或用于大腸桿菌中cDNA克隆的病毒RNA's中的序列異源性。感染性全長TP21cDNA。在細(xì)菌中組裝TP21基因組的感染性cDNA失敗后(圖1，A部分)，我們嘗試通過采用長PCR制備感染性全長cDNA來避免在一個細(xì)菌載體中克隆cDNA的困難。而且，我們發(fā)現(xiàn)，LGT基因組自發(fā)變異的可能性對于在細(xì)胞培養(yǎng)中長期生長過程中獲得高滴度的病毒來說是更高的。當(dāng)采用一個正向引物和一個反向引物來進行高精度PCR時，產(chǎn)生了TP21病毒的全長cDNA(圖1，B部分和圖2)，該正向引物在緊接LGT序列的第一個22核苷酸的上游含有SP6聚合酶啟動子，該反向引物與LGT3'末端的核苷酸10,921-10,943是互補的。后一個引物在緊接3'末端序列后含有一個EcoRV切割位點。如圖2所示，來自低滴度病毒(3.8X103pFU/ml)的主要PCR產(chǎn)物IA(I道，A帶)大約有l(wèi)lkb長。相反，來自高滴度病毒(2.4Xl()9pFU/ml)的PCR產(chǎn)物2A(2道，A帶)含有很少的全長cDNA,而主要的產(chǎn)物相當(dāng)短，大約4kb長(2道，B帶)。序列分析表明這個片段(l道或2道，B帶)代表一個截斷的LGT基因組，從核苷酸1延伸至3779，與存在于反向引物(寡聚1445)基因組3'末端的最后23核苷酸相連接，被用于RT和PCR。這里應(yīng)該注意的是，寡聚14453'末端上的最后7個核苷酸也與LGT基因組序列在核苷酸位置3780至3786上的是互補的?？赡茌^短的產(chǎn)物(l或2道，B帶)在RT-PCR的擴增過程中，通過在病毒基因組上結(jié)合引物與這個可選擇的位點來產(chǎn)生，而不是與通過較高的多次傳代后選擇的一個改變的3'末端序列結(jié)合。用EcoRV消化近似全長RT-PCRcDNA片段(A帶，1或2道；圖2)，來自這些模板的RNA轉(zhuǎn)錄物在Vero細(xì)胞中檢測感染性。在Vero細(xì)胞中感染的證據(jù)用免疫熒光測定法(IFA)在第12天使用LGT特異抗體來檢測。在那時，來自PCR產(chǎn)物1A的RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞80-90%是陽性的，而使用PCR產(chǎn)物2A的RNA轉(zhuǎn)錄物時，僅觀察到少數(shù)的IFA陽性細(xì)胞。這表明當(dāng)用低滴度病毒懸液作為基函4且全長C旨來源時，感染性cDNA的回收最有效。這可能反映了在達(dá)到高滴度所需的更長的病毒復(fù)制時期中，病毒RNA基因組改變的發(fā)生頻率更高。由于這種原因，感染后2天收獲的一個低滴度TP21病毒懸液的病毒RNA被用來構(gòu)建全長TP21cDM。從克隆cDNA中回收LGT病毒及它們的特性。兩個重疊cDNA片段(圖1，C部分)采用來自低滴度TP21病毒儲備(3.8Xl(fPFU/ml)RNA的RT產(chǎn)物，通過長PCR制備。代表基因組3'區(qū)的PCR產(chǎn)物(大約6.lkb)，用兩步克隆進細(xì)菌載體p5，-2(Notl、Xhol、HindIII)中，如實例中所描述和圖1(C部分)中所圖解的。得到的克隆p624-3，含有從4539至基因組末端的LGT核苷酸，以限制性酶分析為基礎(chǔ)進行篩選。隨后，通過長PCR產(chǎn)生TP21基因組的剩余5'序列(大約4.8kb)以及緊接LGT序列上游5'末端的SP6啟動子，并連接進Notl和Apal消化的p624-3質(zhì)粒。這個構(gòu)建物在大腸桿菌中的克隆產(chǎn)生了28個穩(wěn)定的全長LGTTP21cDNA克隆。但是，在穩(wěn)定的全長LGTcDNAs中，在限制性酶消化方式方面可觀察到一些多形現(xiàn)象。分析了4個質(zhì)粒(pTP21-636、pTP21-649,pTP21-656和pTP21-689)的序列，并發(fā)現(xiàn)與TP21的共有序列非常接近地一致。在獲得最終的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之前，質(zhì)粒DNA模板在EcoRV剪切位點上被線性化，該位點是LGTTP21序列3'末端下游存在的三個核苷酸。結(jié)果，RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在3'末端含有三個額外的核苷酸GAU以及在5'末端含有一個額外的G殘基。用SP6聚合酶從28個不同質(zhì)粒中產(chǎn)生的全長RNA通過轉(zhuǎn)染BHK倉鼠、或猿Vero或LLCMK2細(xì)胞被檢測感染性。ll個獨立的LGTTP21cDNA克隆是感染性的。病毒感染的證據(jù)在第五天對80—100%轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用LGT特異性超免疫小鼠的腹水(麗AF)，通過IFA來檢測。收獲的病毒是LGT的其他證據(jù)通過比較LGT特異蛋白而獲得，該特異性蛋白是由親代TP21或其后代cDNA病毒在感染的BHK、Vero或LLCMK2細(xì)胞中產(chǎn)生的，如用LGT特異性HMAF或單克隆抗體的免疫沉淀測定所證實的。RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異感染性來源于三個不同的cDNA克隆，其范圍是8X103至2X105PFU/Vg。這明顯少于TP21病毒體RNA的感染性，后者在相同的試驗條件下在Vero細(xì)胞中被測定為4X106pFUAig。通過在Vero細(xì)胞中將病毒傳代，并獲取感染培養(yǎng)物的上清培養(yǎng)基得到了獲得TP21克隆的儲存制劑。感染后7天，4個獲得的TP21克隆TP21-636、TP21-649、TP21-656和TP21-689(指定的636、649、656和689)的病毒滴度通過空斑試驗在LLCMK2細(xì)胞上測量，其范圍在1.2X10'至2.4X108PFU/ml間變化。除了649病毒產(chǎn)生小的空斑，平均直徑為0.8毫米外，感染后7天獲得的cDNA來源的LGT克隆在LLCMK2細(xì)胞上產(chǎn)生了特征性的LGTTP21空斑，直徑為3.5毫米。病毒的復(fù)制通過在Vero細(xì)胞感染后第O、1、2、3、4和5天監(jiān)測病毒滴度來進一步分析。收獲的LGT克隆及其親代病毒的生長沒有觀察到明顯的差異。回收病毒的核苷酸序列分析。從Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)染中回收的4個病毒(g卩，克隆636、649、656和689)通過在Vero細(xì)胞中進一歩傳代來擴增，病毒體RNA用于RT-PCR。隨后，獲得的病毒全基因組的測序采用4個以前沒有在大腸桿菌中克隆的重疊PCR片段來進行。RNA病毒的變異體如LGT可在RT-PCR、cDNA基因組的細(xì)菌克隆和/或病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中適應(yīng)和繁殖的過程中積累。為了更好的理解剛回收的LGT病毒的基因可變性的來源(i)每個獲得病毒基因組的5'部分(核苷酸1-5300)在病毒生長的單獨試驗中進行兩次序列分析，分離病毒RNA并進行RT-PCR;病毒基因組的3'部分用同樣的方式進行測序，但僅一次；和(ii)同時也測定病毒插入4個質(zhì)粒中每一個的核苷酸序列，感染性RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物來自這4個質(zhì)粒。對TP21的4個選擇的感染性克隆的分析表明，在氨基酸序列上與以前通過其基因組片段的RT-PCR(表l)確定的E5共有序列有6個差異。這些差異可在以下位點觀察到E的119和389;NS3的248和317，NS5的542。因此，4個獲得的克隆含有TP21共有序列7個位點中的6個，在這些位點上TP21不同于其E5衍生物。每個感染性克隆在位點NS5的422上有Thr，類似于E5，而不是TP21NS5的Ser殘基(表1)。在這4個回收病毒的每個基因組的3，部分鑒定了有三個保守的核苷酸變化，沒有在表l中顯示。第一個，在3'非編碼區(qū)，A,。,64G，另兩個改變發(fā)現(xiàn)在非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS3(A5357~>G)和NS5(G9—A)，在NS3蛋白上可引起Thr2M4Ala，在NS5蛋白上發(fā)生Asp691—Asn。存在于回收病毒基因組上的核苷酸殘基G5357，A，和GIM36也發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒DNA中，以及中間構(gòu)建物，質(zhì)粒p624-3中，每個病毒均來自前面的質(zhì)粒DNA。這表明這些變化發(fā)生在大腸桿菌克隆過程中，并對含有LGT序列的質(zhì)粒的擴增是有利的，或這些差異反映了一個正義RNA病毒的"準(zhǔn)種屬性"。為了支持后一種解釋，應(yīng)該注意的是在位點9734或10，436位點的核苷酸可變性G/A已經(jīng)在高滴度病毒儲備庫的TP21RT-PCR基因組的共有序列中觀察到。序列分析也鑒定出了在4個獲得克隆的每個基因組的5'部分中，與TP21共有序列存在一些其他的獨特差異(表2)。來自TP21共有序列的18個核苷酸差異中的14個也存在于質(zhì)粒DNA中，從中可獲得4個克隆。這提供了證據(jù)，即克隆實際上來源于cDNA。在TP21的共有序列和4個獲得病毒基因組的序列之間的總共18個核苷酸差異中，有10個在結(jié)構(gòu)性蛋白preM或E中或在非結(jié)構(gòu)性蛋白NS2A或NS2B中產(chǎn)生了一個氨基酸替代。在RNA轉(zhuǎn)錄和Vero細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，或病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的增殖過程中，至少發(fā)生了三個核苷酸改變(克隆636和689中C4299~>U;在表2中下劃線的克隆656中Aw?！狦和U29—U)，因為這些變異體不存在于質(zhì)粒DNA模板中，這些病毒來自這些質(zhì)粒DNA?？寺?36具有3個與TP21共有序列不同的核苷酸，僅其中2個引起氨基酸改變。位于包衣蛋白E的跨膜區(qū)附近的His^Tyr替代發(fā)生的位點，在所有蚊傳和蜱傳黃病毒中是高度保守的(Pletnev，A.G.,Yamshchikov，V.F.,和Blinov,V.M.(1990)蜱傳腦炎病毒聚合蛋白的全部氨基酸序列和基因組核苷酸序列。病毒學(xué)(Virology)174，250-263;Gritsun，T.S.,Holmes,E.C,,和Gould，E.A.(1995)黃病毒包衣蛋白的分析揭示了反映其抗原性，并可能決定其發(fā)病機制的可變區(qū)。病毒研究(VirusResearch)35，307-321)。其他的氨基酸改變，在非結(jié)構(gòu)性蛋白NS2B上Ala32~>Val,在克隆689病毒體中頁存在有很明顯的部分。克隆649較其他病毒與TP21親代病毒的差異更明顯，因為它的病毒基因組含有7個核苷酸差異(表2)。當(dāng)其他4個引起NS2A或NS2B蛋白上氨基酸替代時，這些變異體中的三個是沉默的?？赡苓@些獨特的變異體可以解釋在LLCMK2細(xì)胞上649克隆的空斑大小較其親代TP21和其他獲得的病毒減少4倍。有趣的是克隆649和克隆689在位點2230,3001和3599處具有三個普遍性的核苷酸改變。這些變異體中的一個在NS2A蛋白的N末端區(qū)引起了Pro29替代為一個Ser殘基，這在TBEV復(fù)合體病毒中是保守的(Pletnev，A.G.，Yamshchikov,V.F.，和Blinov,V.M.(1990)蜱傳腦炎病毒聚合蛋白的全部氨基酸序列和基因組核苷酸序列。病毒學(xué)(Virology)174，250-263。)。在克隆656中鑒定出結(jié)構(gòu)蛋白preM(Met3^Val)和E(Asp，4Ala)中的氨基酸替代以及兩個沉默變異體。因為preM蛋白N末端部分的功能和三維結(jié)構(gòu)未知，Met:,8—Val在preM蛋白中改變的意義很難評價。在位點308上Asp—Ala的替代發(fā)生在E蛋白的III區(qū)，被認(rèn)為在蜱傳和蚊傳黃病毒對小鼠的神經(jīng)侵襲性中具有重要作用(Ray,F.A.，Heinz,F.X.，Mandl，C.,Kunz，C,，和Harrison,S.C.(1995)蜱傳腦炎病毒包衣蛋白以2的分辨率。自然375，291-298.;Mcminn,P.C.(1997)腦炎源性黃病毒毒性的分子基礎(chǔ)。J.Gen.Virol.，78,2711-2722.)。而且，早期發(fā)現(xiàn)Lo叩ing病病毒，一種TBEV-復(fù)合體黃病毒，經(jīng)過在E蛋白308位點的一個單氨基酸替代Asp—Asn后顯示神經(jīng)侵襲性降低(Jiang，W.R.,Lowe,A.,Higgs,S.，Reid,H.，和Gould,E.A.(1993)在Lo叩ing病病毒抗體抗性變異體中可檢測到的單個氨基酸密碼子的改變，以及降低的神經(jīng)毒性。J.Gen.Virol.，74,931-935.)。因此，LGT的克隆656可提供另一個機會來研究E308位點的變異體(Asp—Ala)對小鼠神經(jīng)侵襲性的作用。在小鼠中評價cDNA來源的病毒。采用小鼠作為實驗?zāi)Ｐ蛠肀容^收獲的LGT克隆及其親代病毒的神經(jīng)侵襲性水平，即病毒從外周擴散至中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及引起的腦炎的能力。首先，成年的遠(yuǎn)系繁殖的Swiss小鼠腹腔內(nèi)(IP)注射每種病毒的104或106PFU，記錄死亡率28天(表3)。以前野生型LGTTP21株顯示對3周齡Swiss小鼠是致命的，其腹腔IA。為lO"PFU(Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)。兩個克隆，649和689病毒，較其LGTTP21親代的外周毒性低，因為僅有分別12.5%或40%的IP接種200LD5。(l(fPFU)成年小鼠可發(fā)展為腦炎的癥狀并死亡。當(dāng)小鼠用104PFU649病毒接種時不發(fā)生死亡。這兩種病毒在NS2A蛋白均僅有一個普遍的氨基酸改變，Prc^變成Ser，這可能與正常小鼠中這些獲得病毒外周神經(jīng)毒性的降低有關(guān)。其他的兩個獲得克隆，636和&56請f毒，^及弒毒的LGTE5株，在神經(jīng)侵襲性方面較其親代LGTTP21毒性更低。這表明這些克隆和LGTE5在正常免疫活性小鼠中的神經(jīng)侵襲性較其LGTTP21親代低200倍。在較早的研究中(Pletnev，A.G.,和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型嵌合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)，只有當(dāng)病毒接種量增至107PFU、或采用一個更敏感的檢測系統(tǒng)，如使用SCID小鼠檢測神經(jīng)侵襲性時，來自TP21的減毒E5株才在成年小鼠中表現(xiàn)外周神經(jīng)毒性。為了評價毒性更低的獲得病毒(克隆636和656)，SCID小鼠，在檢測外周神經(jīng)毒性時其敏感性較正常小鼠至少高106倍，腹腔內(nèi)IP注射1C)2PFU(圖3)(Pletnev,A.G.，和Men，R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95,1746-1751。)。克隆636在SCID小鼠中的神經(jīng)侵襲性與其TP21親代并無差異?？寺?56在觀察期內(nèi)也殺死了所有的接種小鼠，但生存時間至少增加了2倍。最后一個656接種小鼠在感染后34天死亡，較TP21接種小鼠最后一個死亡的時間延遲了21天。這種在死亡時間的延遲表明克隆656在神經(jīng)缺陷小鼠中的復(fù)制和播散更慢一些。因此對這個克隆進行更詳細(xì)的研究。其LD5。是通過以1，10或100PFU腹腔接種5個SCID小鼠來評價。以這種方式獲得的LDs。估計值是40PFU。因此克隆656的神經(jīng)侵襲性較TP21(SCID小鼠估計LDs。值為0.004PFU)低101倍,較E5，減毒的TP21衍生物(Pletnev,A.G.,和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)的致病性低6.6X102倍。但是，克隆656的減毒水平要明顯低于LGT/登革熱嵌合病毒(Pletnev，A.G.，和Men,R,(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95，1746-1751。)以及TBEV/DEN4嵌合體(Pletnev，A.G.，Bray，M.，Huggins，J.,和Lai，C.J.(1992)蜱傳腦炎/登革熱4型病毒的構(gòu)建和特性。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10532-10536.;Pletnev,A.G.，Bray，M.,和Lai,C.J.(1993)嵌合的蜱傳腦炎和登革熱4型病毒變異對小鼠神經(jīng)毒性的影響。J.Viro1.，67，4956-4963.)(Dr.J.Huggins，USAMRIID，個人交流)。當(dāng)小鼠IP接種105PFU劑量，并在觀察期間存活(圖3)時，可證實對于SCID小鼠TP21/DEN4和E5/DEN4嵌合體沒有發(fā)生可檢測到的神經(jīng)侵襲性。野生型LGTTP21株及其減毒衍生物E5株基因組的RT-PCR產(chǎn)生的cDNA片段的序列分析，可識別變異，就可以解釋這些株對小鼠和猴外周神經(jīng)毒性差異以及在HeLa細(xì)胞中生長率的差異(Thind和Price,1966a和1966b;Nathanson等人，1968;Price和Thind，1973)。在這些株的聚合蛋白的共有序列中僅鑒定出7個氨基酸差異(表l);以前當(dāng)LGT的兩個株在大腸桿菌中克隆時，可觀察到這些改變中的4個(Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)。7個氨14基酸差異中僅有兩個(Phe9變成Val和AsnM9變成Asp)定'位在結(jié)構(gòu)蛋白￡上。變異體Asr^Asp定位在E蛋白結(jié)構(gòu)域I11的側(cè)表面上，并對應(yīng)一個位點，在此，變異體被認(rèn)為可減少小鼠TBEV或MurrayValley腦炎病毒(Rey，F(xiàn).A.，Heinz,F.X.,Mandl,C.，Kunz，C.,和Harrison,S.C.(1995))蜱傳腦炎病毒包衣蛋白以2的分辨率。自然375，291-298.;Monath,T.P.,和Heinz,F.X.(1996)黃病毒。見"菲爾茲病毒學(xué)"(B.N.Fields,D.M.Knipe&P.M.Howley，主編)，第三版，96H035頁。LippincoU-Raven出版社，費城&紐約；McMinn,P.C.(1997)腦炎源性黃病毒毒性的分子基礎(chǔ)。J.Gen.Virol.,78，2711-2722.)。對一個或多個可以解釋LGTE5株較其親代LGTTP21株具有更大減毒性的變異的鑒定，現(xiàn)在可以采用反向遺傳學(xué)方法來進行。我們從病毒cDNA中獲得LGTTP21的成功允許我們?nèi)パ芯縇GTTP21及其組織培養(yǎng)傳代的衍生物，LGTE5在小鼠和猴所觀察到的神經(jīng)侵襲性差異的分子基礎(chǔ)(Thind,I.S.，和Price,W.H.(1966a)Langat病毒的一個雞胚減毒株(TP21E5)。I.病毒對小鼠和猴的毒性。Am.J.Epidemiol,,84，193-213.;Thind,I,S.,和Price,W.H.(1966b)Langat病毒的一個雞胚減毒株(TP21E5)。II.不同實驗室動物和組織培養(yǎng)中傳代后的穩(wěn)定性。Am.J.Epidemiol.,84,214-224.;Nathanson,N.，Thind,I.S.，0，Leary，W.,和Price,W.H.(1968)蟲媒病毒屬B組的猴神經(jīng)毒性的組織學(xué)研究。IV.Langat病毒一個減毒株(E5)的評價。Am.J.Epidemiol.88,103-112.;)。首先，從cDNA片段中嘗試構(gòu)建TP21的全長感染性cDNA克隆，以前這是為了序列分析的目的在大腸桿菌中構(gòu)建的。從這些DM片段中構(gòu)建的全長cDNA克隆的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一般缺少感染性。這些全長cDNAs不能作為感染性RNA的模板，可能是共有序列變異的表現(xiàn)，可通過在大腸桿菌中用來克隆cDNA的高滴度病毒和在這種細(xì)菌中的實際克隆步驟來證實。這種解釋與18個核苷酸差異是一致的(表1)，經(jīng)鑒定這些差異是存在于來源于高滴度病毒種屬的TP21儲庫的克隆cDNA片段的序列和以前沒有在大腸桿菌中克隆的TP21RT-PCR片段的共有序列之間，后者來自一個低滴度病毒懸液，在多循環(huán)生長曲線時收獲。為了在病毒制備過程中盡量減少自發(fā)性變異的頻率，采用一個低滴度TP21病毒懸液來從長RT-PCR片段中構(gòu)建一個全長cDNA的基因組。當(dāng)采用這種戰(zhàn)略時，成功的從全長TP21基因組的cDNA中產(chǎn)生感染性的RNA。當(dāng)采用低滴度的病毒(3.8X103pFU/ml)通過長PCR來制備全長cDNAs時，病毒的獲得較采用高滴度病毒(2.4X109pFlJ/ml)更為有效。隨后，當(dāng)來自低滴度TP21懸液的全長cDNA從兩個長的重疊RT-PCR片段中構(gòu)建并在大腸桿菌中克隆時，從28個穩(wěn)定的cDNA克隆出的11個RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在猿細(xì)胞培養(yǎng)中是有感染性的。當(dāng)4個獲得病毒的序列與從中獲得4個病毒的質(zhì)粒DNAs的序列相比較時，鑒定到3個核苷酸改變(在克隆636和689中C4299變成U;在克隆656中為Aw。變成G和C4429變成U)。假定這4個來自變異體的改變在從質(zhì)粒DNA中獲得感染性病毒過程中發(fā)生。在獲得病毒中鑒定到的TP21共有序列中剩余的14個核苷酸也存在于質(zhì)粒DNA中，從中得到4個克隆(表2)。這意味著這些變異發(fā)生的更早，即在RT-PCR片段裝配進入全長的質(zhì)粒cDNA中的過程中或之前，可能與用作RT-PCR擴增的病毒懸液中序列多樣現(xiàn)象("類種屬")的自發(fā)發(fā)生一樣早。應(yīng)該注意的是，區(qū)分LGTTP21及其E5衍生物的共有序列7個氨基酸中的6個被保留在每個獲得的TP21克隆中(表1)，而在每個克隆中保守的第7個TP21/E5變異氨基酸(在NS5中是LysM2)是E5的。4個獲得的病毒含有TP21/E5共有序列，除了4個克隆的每個都有三個核苷酸改變(A^57變成G,G，變成A，和A,e變成G)，這也存在于質(zhì)粒p624-3及其衍生物中，即回收病毒的全長cDNA克隆?？赡苊總€回收的病毒中的這些改變可解釋在Swiss小鼠中所觀察到的較親代TP21病毒的降低的外周神經(jīng)毒性。克隆649和689僅在大劑量IP，106PFU接種時可引起正常小鼠的腦炎和死亡(表3)。有趣的是，649和689病毒在其結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列上與TP21病毒并無差異(表1和2)，但這些獲得的病毒在肺結(jié)構(gòu)性NS2A蛋白上具有一個相同的改變Prc^變成Ser?？寺?36和656在結(jié)構(gòu)蛋白中變異的存在與正常小鼠中神經(jīng)侵襲性的顯著降低有關(guān)。當(dāng)免疫活性小鼠IP接種108PFU，這些獲得的病毒均缺少可檢測到的神經(jīng)毒性。相反，當(dāng)SCID小鼠IP接種時，在E蛋白中含有變異His咖變成Tyr以及在NS2B蛋白中含有Ala32變成Val的克隆636，，在對SC工D小鼠的神經(jīng)侵襲性上與其TP21親代并無不同；兩種病毒均是高度神經(jīng)侵襲性的。因此，在克隆636中的兩個變異對正常小鼠可引起神經(jīng)侵襲性的降低，但當(dāng)用高度易感的SCID小鼠檢測時并未完全消除這種特性。在以前的研究中，發(fā)現(xiàn)SCID小鼠在檢測神經(jīng)侵襲性時較正常小鼠易感106至10M咅(Pletnev，A.G.,和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.NatLAcad.Sci.USA，95,1746-1751。)。在SCID小鼠中，克隆656(LDs。為40PFU)與親代TP21病毒(LDs。為0.004PFU)相比神經(jīng)侵襲性降低104倍。但是，當(dāng)SCID小鼠IP接種102PFU(2.5LD5。)的克隆656時，小鼠的平均生存時間增加2倍。克隆656的減毒可能是結(jié)構(gòu)蛋白獨特變異的結(jié)果(在preM中MeU變成Val在E蛋白中是Asp鵬變成Ala)。要考慮在LGT神經(jīng)侵襲性降低作用中每個替代的作用。令人感興趣的是，另一個蜱傳黃病毒，Lo叩ingill病毒的減毒作用與E蛋白308位點(Asp變成Asn)或310(Ser變成Pro)的單一氨基酸變異有關(guān)(Jiang,W.R.,Lowe,A.,Higgs,S.,Reid,H.，和Gould,E.A.(1993)在神經(jīng)毒性降低的lo叩ingill病毒抗體抗性變異體中檢測到的單一氨基酸密碼子改變。J.Gen.Virol.，74，93卜935.)。另外，在E蛋白中變異定位或靠近308位點，它對蚊傳黃病毒毒性的影響也在黃熱病毒和日本腦炎病毒中觀察到(Schlesinger，J.J".，Chapman,S.，Nestorowicz，A.,Rice,C.R.,Ginocchio，T.E.,和Chambers,T.J.(1996)黃熱病毒在鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的復(fù)制:神經(jīng)適應(yīng)性和非神經(jīng)適應(yīng)型病毒的比較，以及神經(jīng)適應(yīng)型病毒株的部分序列分析。J.Gen.Virol.，77，1277-1285;Ni,H.，和Barrett,A.D.T.(1998)通過篩選其鼠腦膜受體制劑逃逸變異體來減毒日本腦炎病毒。病毒學(xué)(Virology)241，30-36.;McMinn,P.C.(1997)腦炎源性黃病毒毒性的分子基礎(chǔ)。J.Gen.Virol.,78，2711-2722.)。這些發(fā)現(xiàn)與觀察到的克隆656的可證實的減毒作用一起均支持以下假設(shè)，即這個位點對毒性具有很重要的作用。我們也嘗試通過基因工程改造克隆656的兩個變異體來得到毒性更低的LGT。將變異His柳變成Tyr從克隆636中轉(zhuǎn)移到克隆656的E蛋白序列中以代替其相應(yīng)序列，降低了獲得的嵌合體的感染性。嵌合體656/636的感染是用100%RNA轉(zhuǎn)染的猿細(xì)胞來開始進行的，但沒有發(fā)展成熟并釋放感染的病毒。從其他構(gòu)建物中得到的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在克隆649的NS2A基因中含有變異Pro29變成Ser，其余的序列來自克隆656，它在LLCMK2細(xì)胞中產(chǎn)生有活性的病毒。在Swiss小鼠中的一項研究顯示這嵌合變異體，類似于其親代656病毒，當(dāng)正常小鼠IP接種106PFIJ的劑量時，并不導(dǎo)致死亡或腦炎。而且，當(dāng)在SCID小鼠中檢測時兩種病毒無差異；延長接種間隔后兩者均引起致命性的腦炎。這表明當(dāng)克隆656的變異體和在克隆649中NS2A蛋白的變異結(jié)合在一個單一病毒中時，對SCID小鼠的祌經(jīng)侵襲性并沒有減少。最后，收獲的4個病毒在小鼠中所顯示的外周神經(jīng)毒性的范圍可能是因為通過獲得病毒基因組序列分析所鑒定出來的不同變異模式的緣故。兩種獲得病毒(649和689)與其親代TP21相比，顯示了對免疫活性成年Swiss小鼠的相對較低的神經(jīng)侵襲性，而剩余的兩個克隆(636和656)似乎僅在SCID小鼠中具有神經(jīng)侵襲性。656病毒保留了對SCID小鼠的神經(jīng)侵襲性，但就其親代TP21或E5株而言似乎在這些免疫缺陷小鼠中的毒性是降低的(Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)。減毒的E5株最初是從TP21中通過在雞胚細(xì)胞培養(yǎng)中多次傳代篩選出來的，可以作為一個潛在的活病毒疫苗侯選物以預(yù)防由TBEV復(fù)合體成員引起的疾病(Price,W.H.，Thind，I.S.，Teasdall,R.D.，和0，Leary，W.(1970)俄國春夏病毒(RSS)復(fù)合體與減毒LangatE5病毒接種人類志愿者。Bull.W.H.0.42,89-94.)。E5顯示了對l矣的神經(jīng)毒性降低，低于黃熱病毒17D疫苗株(Nathanson，N.,Thind,I.S.，0，Leary，W.,和Price,W.H.(1968)蟲媒病毒屬B組的猴神經(jīng)毒性的組織學(xué)研究。IV.Langat病毒一個減毒株(E5)的評價。Am.J.Epidemiol.88,103-112頁)?？寺?56感染性cDNA的獲得提供了一種基礎(chǔ)，以便進一步研究設(shè)計去掉對免疫缺陷小鼠的剩余的神經(jīng)侵襲性，象以前通過構(gòu)建Langat/登革熱嵌合病毒一樣所達(dá)到的效果(Pletnev,A.G.，和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746—1751。)。獲得Langat病毒的感染性全長cDNA允許我們通過引入位點特異性的減毒變異體來降低Langat病毒的毒性。這個結(jié)果使我們能構(gòu)建減毒的變異體，來在成人志愿者中評價減毒作用和免疫原性。這個成功可使我們開發(fā)滿意的減毒活病毒用于預(yù)防重要的蜱傳黃病毒疾病。II部分嵌合的Langat/登革熱病毒保護小鼠不受蜱傳腦炎的強毒性株的異源激發(fā)。Vero細(xì)胞傳代的LGT/DEN4嵌合體的特性。兩種活的嵌合病毒，含有preM和野生型LGTTP21株的E基因或其毒性更低的衍生物，LGTE5株，其剩余的序列來自DEN4，它們在用全長cDNA嵌合基因組的全長RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)染蚊子C6/36細(xì)胞后被回收；但是，在轉(zhuǎn)染猿細(xì)胞后不回收感染性病毒(Pletnev,A.G.,和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)。應(yīng)該注意的是前面的細(xì)胞被認(rèn)為不適合制備人疫苗。最初均從蚊子細(xì)胞中回收的TP21/DEN4和E5/DEN4嵌合體與其親代TP21或E5病毒以及親代DEN4相比在猿細(xì)胞中的病毒復(fù)制和空斑形成的效率明顯降低。但是，可能要讓嵌合病毒適應(yīng)在已鑒定的Vero細(xì)胞中有效生長(W.H.O.Seed，143頁；Novavax,公司，Rockville，MD)以便適合用于生產(chǎn)人的疫苗。這可以通過將TP21/DEN4或E5/DEN4病毒以1或5的多重感染度接種Vero細(xì)胞，并在37。C孵育10天后收獲形成的2至4.5毫米病毒空斑。這些空斑分離物然后被置于4個空斑中在Vero細(xì)胞中進行空斑傳代，成功的篩選到生長至更高滴度，并更有效產(chǎn)生空斑f^T病毒。通過在Vero細(xì)胞中第4個空斑傳代制備Vero細(xì)胞培養(yǎng)獲得的TP21/DEN4或E5/DEN4病毒的接種存儲液。然后將適應(yīng)Vero細(xì)胞的疫苗侯選物(表示為"vac")TP21/DEN4(vac)和E5/DEN"ac)互相比較，并與其親代病毒比較在小鼠中的神經(jīng)侵襲性，在猿和蚊子細(xì)胞中的空斑和最大產(chǎn)量。通過Vero細(xì)胞適應(yīng)的TP21/DEN4(vac)和E5/DEN4(vac)嵌合體獲得的滴度分別為Vero細(xì)胞4X106PFU/ml，蚊子C6/36細(xì)胞中3X106PFU/ml，表明已達(dá)到了產(chǎn)量。在Vero細(xì)胞中Vero細(xì)胞適應(yīng)的嵌合體增加的細(xì)胞病變效應(yīng)表明在病毒基因組中的宿主范圍的變異在這些病毒在猿細(xì)胞中適應(yīng)和增殖過程中可被篩選到。因此兩個嵌合體病毒基因組的部分序列通過從純化的病毒體中提取的RNA用RT-PCR分析來確定，以證實它們的嵌合結(jié)構(gòu)，并鑒定在Vero細(xì)胞適應(yīng)中具有重要作用的變異。引物對(寡聚239和寡聚442;見(Pletnev，A.G.,Bray,M.,Huggins，J.,和Lai,C.J.(1992)蜱傳腦炎/登革熱4型病毒的構(gòu)建和特性。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,10532-10536.;Pletnev,A.G.，Bray,M.,和Lai,C.J.(1993)嵌合蜱傳腦炎和登革熱4型病毒變異體對小鼠神經(jīng)毒性的影響。J.Virol.,67，4956-4963.))用來產(chǎn)生PCR產(chǎn)物以從核苷酸18至2832擴增DEN4基因組。確定了每個Vero細(xì)胞培養(yǎng)獲得的嵌合體基因組的5'非編碼區(qū)的核苷酸序列，結(jié)構(gòu)蛋白基因和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因，包括C/preM和E/NSl連接，并與已發(fā)表的相應(yīng)蚊子細(xì)胞培養(yǎng)獲得的嵌合病毒基因組序列進行比較(表A)(Pletnev，A.G.，和Men，R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)。僅鑒定到三個氨基酸差異，這些差異定位在TP21/DEN4(vac)嵌合體的preM和E蛋白序列中，這些嵌合體在蚊子C6/36細(xì)胞中收獲后在Vero細(xì)胞中傳代5次。在類似的比較中，在Vero細(xì)胞適應(yīng)的E5/DEN4(vac)嵌合體序列中僅有8個核苷酸差異，其中6個產(chǎn)生一個氨基酸替代，它們定位在包衣結(jié)構(gòu)蛋白(E)中。在第二個嵌合體中已經(jīng)證明在E上位點296(Lys變成Gln)和位點310(Thr變成Ala)上有相同的氨基酸替代。這些共有的變異在細(xì)胞定向改變中具有重要作用。E5/DEN(vac)基因核苷酸位點1437上的改變導(dǎo)致了在E蛋白的一個潛在糖基化位點上氨基酸He替代為Thrl51。從親代LGT病毒或其嵌合體病毒感染的Vero細(xì)胞溶解物中可免疫沉淀病毒E蛋白，指示了親代E5病毒及其嵌合E5/DEN4(vac)病毒的E蛋白在凝膠上遷移的差異。E5/DEN4嵌合體的E蛋白較E5病毒E蛋白的遷移稍快。這可能反映了在E蛋白三個潛在N連接的糖基化位點中損失了一個。相反，TP21及其嵌合體TP21/DEM(vac)的E糖蛋白在凝膠上的流動性沒有差異。小鼠的神經(jīng)侵襲性。在一項以前的研究中，LGTTP21IP接種對免疫活性小鼠僅中度減毒(Pletnev,A.G.,和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。P潔.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)。相反，當(dāng)正常小鼠經(jīng)IP途徑接種時，LGTE5(TP21的一個卵傳代衍生物)，TP21/DEN4和E5/DEN4則完全被減毒。但是，親代LGT病毒IP接種后顯示對SCID小鼠具有非常高水平的毒性；TP21的IPLD50為4X10—3PFU,E5為6X10—2pFU(表5)(Pletnev,A.G.，和Men，R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)。很明顯，當(dāng)TP21或E5用來構(gòu)建一個活的LGT/DEN4嵌合體時，LGT株對SCID小鼠的這種高水平毒性可全部被消除。在一項以前的研究中，兩種在蚊子細(xì)胞中"獲得"和增殖的嵌合體的IPLD5。>107PFU(Pletnev,A.G.，和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒與蚊傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)。在本研究中，對適應(yīng)Vero細(xì)胞的嵌合體進行了一項類似的分析以確定在嵌合體適應(yīng)了已鑒定的Vero細(xì)胞后這種水平的SCID小鼠減毒作用是否仍然被保留，該Vero細(xì)胞被確定用來制備一種人的疫苗。三周齡的Swiss小鼠和免疫缺陷小鼠(SCID)(C.B.-17ICR/scid/scid;TaconicFarm,Germantown,NY)被用來評價毒性(表B)。以105PFU的劑量經(jīng)IP給藥，親代TP21在Swiss小鼠中可引起100%的死亡率，而LGTE5，TP21/DEN4(vac)嵌合體和E5/DEN4(vac)嵌合體當(dāng)以105或5X105PFU的劑量IP接種時不能引起致命的疾病。另外，當(dāng)SCID小鼠被IP接種時，兩種嵌合體病毒均可觀察到完全的減毒作用。盡管當(dāng)SCID小鼠以102PFUIP接種TP21或E5病毒時產(chǎn)生100%的死亡率，但當(dāng)SCID小鼠用LGT/DEN4嵌合體中任一種以5)U(TPFUIP接種時觀察^不到任何的死亡或疾病。這表明Vero細(xì)胞適應(yīng)的病毒，象其蚊子細(xì)胞生長的親代一樣，在這些條件下對小鼠是明顯減毒的。為了鑒定是否經(jīng)任何一個LGT/DEN4嵌合體IP接種后生存7周的SCID小鼠對親代TP21易感，存活的小鼠用102PFU的TP21經(jīng)IP接種。不出所料，所有這些小鼠在接種后IO和13天之間死亡。而且，我們不能在用任何一種高度減毒的嵌合體IP接種50天后通過PCR檢測病毒RNA或回收感染性病毒。因此，我們不能夠檢測到持續(xù)感染的證據(jù)。防御有毒性的TBEV的激發(fā)。涉及TBEV激發(fā)的研究在俄羅斯，莫斯科區(qū)，Chumakov's脊髓灰質(zhì)炎和病毒性腦炎學(xué)會的一個4級生物安全性實驗室或美國馬里蘭，F(xiàn)ortDetrick的美國軍隊感染性疾病醫(yī)學(xué)研究學(xué)會，根據(jù)實驗室動物護理和使用指南(國立衛(wèi)生院，1996)中所描述的歩驟進行。用600PFU劑量TP21/DEN4嵌合體免疫誘導(dǎo)的保護作用(表C)。在第一個試驗中，每組9或10只6周齡的先天性CBA小鼠(14-20g)IP接種600PFU的TP21/DEN4(vac)一次或兩次，接種的間隔時間為29天。免疫以及未免疫(對照)的小鼠在第26天或55天用320PFU(32LD5。)的高度神經(jīng)侵襲性TBEVAbsettarov株，一個歐洲亞型病毒，經(jīng)IP激發(fā)(Ecker，M.，Allison,S.L.，Meixner，T.，和Heinz，F(xiàn).X.(1999)。歐洲和亞洲蜱傳腦炎病毒的序列分析和基因特性。J.Gen.Virol.80，179-185.)。14-20gCBA小鼠這種株的IPLD幼估計為10PFU。用嵌合體疫苗的單一600PFU劑量免疫小鼠，僅有部分可抵御毒性TBEV株的32LD5。，而嵌合體600PFU劑量的兩次接種可獲得對TBEV異種激發(fā)的完全抵御作用。相反，所有對照的CBA小鼠當(dāng)用TBEV激發(fā)時，均發(fā)生了致命TBEV感染的臨床癥狀并死亡。在第二個試驗過程中，相似的方案用于在BALB/c小鼠中研究TP21/DEN4。每組5或10個4周齡的BALB/c雌性小鼠(10-14g)IP接種600PFU的TP21/DEN4(vac)一次或多次，接種的間隔時間從26至66天(表C)。在指定的時間小鼠用320LD5。的TBEVAbsettarov株經(jīng)IP激發(fā)，其對10-14gBALB/c小鼠的IPLDs。估計為1PFU。在這個試驗以及第一個試驗中，作為對照的未免疫小鼠與免疫小鼠的年齡相同，以消除與年齡有關(guān)的小鼠對TBEV的抵抗效應(yīng)。所有40個用TBEV激發(fā)的未免疫小鼠死亡并具有致命性TBEV感染的臨床癥狀。用單一劑量的TP21/DEN4(vac)嵌合體接種BALB/c小鼠與CBA小鼠相比有很弱的抵御TBEV的作用。但是當(dāng)接種兩個或三個劑量的TBEV嵌合疫苗株時保護效應(yīng)增加。當(dāng)疫苗侯選物在127天內(nèi)接種4次時，可達(dá)到對TBEV激發(fā)的完全抵抗。接種105PFU劑量的一個侯選LGT/DEN4疫苗誘導(dǎo)的保護效應(yīng)(表D)。3周齡遠(yuǎn)系繁殖的Swiss雌性小鼠(7-9g)通過IP途徑接種:(i)1()2PFU的LGTTP21病毒、LGTE5病毒或一個cDNA來源的LGTTP21病毒(稱為656)，或(ii)l(fPFU的TP21/DEN4(vac)、E5/DEN4(vac)或DEN4。當(dāng)侯選疫苗給藥兩次時，第二次接種在間隔22天后進行。在第二次免疫后18天，所有小鼠被放血檢測血清—L(5TTP2i病毒的中和抗體水平，6天后小鼠用100LDso的TBEV的Sofjin高毒性株，遠(yuǎn)東亞型，經(jīng)IP進行激發(fā)(Clarke,D.H.(1964)。在B組蜱傳復(fù)合體病毒中抗原性關(guān)系的進一歩研究。Bull.WorldHealthOrgan.31,45-56)。對于8周齡小鼠Sofjin株的50%致死劑量以前確定為0.5PFU(Schmaljohn，C.,Vandeerzanden，L.，Bray，M.，Custer,D.，Meyer,B.，Li，D.，Rossi,C.,Fuller,D.,Fuller,J.，Haynes,J.，和Huggins，J.(1997)。表達(dá)俄國春夏腦炎病毒和中歐腦炎病毒preM和E基因的裸露DNA疫苗可保護小鼠免受同種和異種激發(fā)。J.Virol.71，9563-9569.)。以前在小鼠中的研究表明，由免疫作用誘導(dǎo)的蜱傳黃病毒血清中和抗體的水平與對同一病毒或本組其他密切相關(guān)成員激發(fā)的抵抗力之間有緊密的聯(lián)系(Monath，T.P.，和Heinz，F(xiàn).X.(1996)。黃病毒。見"菲爾茲病毒學(xué)"。(B.N.Fields,D.M.Knipe和P.M.Howley，主編)，第三版，961-1035頁。Lippincott-Raven發(fā)行商，費城/紐約；Price,W.H.，和Thind，I.S.(1973)用減毒的LangatE5病毒免疫小鼠抗俄國春夏病毒復(fù)合體，免疫猴抗Powassan病毒。Am.J.Trop.Med.Hyg.22，100-108.;SchmalJohn,C.，Vanderzanden，L.，Bray，M.，Custer,D.，Meyer,B.，Li，D.，Rossi，C.，F(xiàn)uller,D.,Fuller,J.,Haynes,J.，和Huggins，J.(1997)。表達(dá)俄國春夏腦炎病毒和中歐腦炎病毒PreM和E基因的裸露DNA疫苗保護小鼠免受同種和異種激發(fā)。J.Virol.71，9563-9569.)。這些早期的研究建立了在TBEV和LGT之間所存在的一種密切的抗原性關(guān)系上。而且，這些黃病毒的結(jié)構(gòu)蛋白preM和E的序列具有85-88y。的同源性(Mandl,C.W.，lacono-Connors,L.,Wallner,G.，Holzmann，H.，Kunz,C.,和Heinz，F(xiàn).X.(1991)。低毒性蜱傳黃病毒類LangatTP21和Yela核苷酸ev的結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的序列。病毒學(xué)(Virology)185，891--895.)。因此，我們觀察到可檢測到的LGTTP21病毒的中和抗體水平與對TBEV的保護免疫性顯示有線性關(guān)系時一點也不驚訝。在這個試驗中，小鼠的LGT病毒特異性免疫反應(yīng)，可通過確定由嵌合疫苗侯選物或其親代LGT病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清LGTTP21中和抗體的滴度來測定。單個的血清樣品使用TP21病毒(表D)通過50%斑點減少中和試驗來分析(Okuno,Y.，F(xiàn)ukunaga,T.，Tadano,M.,Okamoto,Y.，0hnishi,T.，和Takagi，M.(1985)。在微量滴定系統(tǒng)中日本腦炎病毒的快速斑點減少中和試驗。Arch.Virol.86，129-135。；Ishmine,T.，Tadano，M.，F(xiàn)ukunaga，T.，和0kuno，Y.，(1987)。一個檢測登革熱病毒的改良的感染性測定和中和試驗的微量方法。BikenJournal30，39-44.)。用102PFU的TP21、TP21(656)或E5病毒接種1次，或用105PFU的TP21/DEN4(vac)嵌合體接種2次的小鼠產(chǎn)生高水平的抗LGTTP21的中和抗體。相反，用10SPFU的DEN4腹腔接種的小鼠不能產(chǎn)生TP21中和抗體。而且，當(dāng)蚊子細(xì)胞培養(yǎng)來源的嵌合體病毒被用來免疫遠(yuǎn)系繁殖的Swiss小鼠時，用嵌合體病毒免疫一次或用E5/DEN4(vac)嵌合體免疫兩次的小鼠可產(chǎn)生較以前觀察到的要低的中等水平的TP21血清中和抗21體((Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998)Langat蜱傳黃病毒彌傳黃病毒登革熱4型聚合毒性降低。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,1746-1751。)。以前用低劑量的E5或TP21接種的小鼠完全可以抵御隨后的TBEV激發(fā)，而以前用DEN4接種的小鼠和未免疫小鼠則完全不能抵御。這表明這種保護作用是因為一種廣泛的LGT免疫反應(yīng)。即使是很低劑量的活LGT病毒(包括cDNA來源的TP21病毒)在預(yù)防由抗原性相關(guān)的TBEV引起的疾病中也是高度有效的。小鼠在用嵌合病毒免疫后，也對隨后用TBEV遠(yuǎn)東亞型株的致命激發(fā)產(chǎn)生了抵抗力。TP21/DEN4(vac)似乎較E5/DEN4(vac)更有免疫原性，因為用雙劑量前者接種的小鼠可完全抵御TBEV的激發(fā)。相反，僅有67%的用雙劑量E5/DEN4(vac)嵌合體接種的小鼠在TBEV的致命性激發(fā)中存活。明顯地，親代LGT病毒較其DEN4嵌合體有更多的免疫原性和保護性。但是，當(dāng)TP21/DEN4(vac)嵌合體以雙劑量給藥方案使用時，可能獲得更高的安全性和相等的保護效應(yīng)。與LGT和TBEV的密切抗原相關(guān)性一致，我們用嵌合病毒疫苗侯選物在小鼠中的研究顯示了LGT和TBEV歐洲亞型(Absettarov株)或TBEV遠(yuǎn)東亞型(Sofjin株)之間的高度交叉保護效應(yīng)。因此，嵌合體的LGTpreM和E蛋白代表了有效保護性抗原，能夠誘導(dǎo)對高毒性TBEV異種激發(fā)的明顯抵抗力。該結(jié)果支持了侯選疫苗株在作為一個模型系統(tǒng)的小鼠中的安全性、免疫原性和保護效應(yīng)。III部分減毒的Langat蜱傳黃病毒(E5株)的感染性cDNA克隆和由其構(gòu)建的3'缺失變異體顯示了在免疫缺陷小鼠中的神經(jīng)侵襲性降低。全長E5cDNA克隆的構(gòu)建和從用全長RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中回收病毒。以前我們成功地構(gòu)建了穩(wěn)定的LGTTP21全長cDNA克隆，可在體外由其轉(zhuǎn)錄感染性RNA。這些全長cDNA克隆中的一個，質(zhì)粒pTP21-636，通過用E5株的相應(yīng)序列替代幾乎整個TP21基因組而被用于產(chǎn)生E5基因組的全長cDNA。野生型LGT病毒(TP21株)基因組及其毒性更低的衍生物、E5株的完全核苷酸序列，以前從RT-PCR(GenBank登記號AF253419和AF2533420)產(chǎn)生的cDNA片段中確定。TP21和E5基因組在長度上均為10,943個核苷酸(nt)，并含有一個130個核苷酸的5'非編碼區(qū)(NCR)和一個568個核苷酸的3'NCR，它們是完全保守的。在TP21和E5株基因組中的12個差異位于核苷酸位點1325和9288之間。這個區(qū)域與克隆的全長TP21基因組的感染性cDNA中的側(cè)向保守序列(核苷酸133至1324和核苷酸9289至9737)—起均是用E5的相應(yīng)序列進行替代的目標(biāo)(圖1A)。E5基因組的一個幾乎全長cDNA片段(大約10.5kb)采用來自病毒RNA的一個RT產(chǎn)物通過高精度長PCR來制備，該病毒RNA是從一個低滴度E5病毒儲存液(l.2X104PFU/ml)中提取的。在生長周期的早期收獲的低滴度病毒被用來制備作為PCR模板的cDNA，以便使如以前所觀察到的、在感染晚期積累的、具有大量3'缺失或基因組重排的變異體的存在減少。TPM和E5的5'132核苷酸和3，1205，核苷酸的保守使得^^們可以將E5基因組的PCR產(chǎn)物，跨度為核苷酸133至9737，克隆進pTP21-636載體中替代相應(yīng)的TP21序列。6個穩(wěn)定的全長E5cDNA克隆通過限制性酶消化類型進行鑒定。這些質(zhì)粒(pE5)的部分序列被分析，并發(fā)現(xiàn)含有區(qū)分E5與其TP21親代的E5特異序列。在產(chǎn)生最終轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之前，質(zhì)粒DNA模板采用EcoRV線性化，其剪切位點存在于LGTE5序列3'末端的下游三個核苷酸處。用SP6聚合酶從6個不同質(zhì)粒產(chǎn)生的全長脂A通過轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)或猿Vero細(xì)胞來檢測感染性。僅一個E5cDNA克隆(pE5-651)對兩個細(xì)胞系都是有感染性的，而其他的克隆均沒有活力。病毒感染的證據(jù)采用LGT特異的HMAF通過IFA進行檢測。在第5天所有轉(zhuǎn)染的Vero細(xì)胞和20-30%的CEF轉(zhuǎn)染細(xì)胞均是陽性的。獲得的E5克隆的儲存制品通過將病毒在用于獲得的細(xì)胞系中傳代一次或12次，并收集感染培養(yǎng)物的上清培養(yǎng)基而制備。在Vero或CEF細(xì)胞中傳代1次或12次后，分析病毒與其生物學(xué)來源的E5親代的序列差異。E5-651病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中構(gòu)建、回收和傳代過程中的遺傳變異性。從Vero或CEF細(xì)胞cDNA中獲得的E5-651病毒基因組的完整序列通過對直接來自病毒RNA的重疊RT-PCRcDNA片段的分析，并與其親代E5病毒的共有序列及產(chǎn)生感染RNA轉(zhuǎn)錄物的pE5-651質(zhì)粒(表I)中插入的病毒核苷酸序列進行比較而確定。獲得的E5-651克隆在12位點內(nèi)含有E5共有序列，在此野生型親代不同于其E5衍生物。對質(zhì)粒DNA的分析顯示了在核苷酸序列中有8個不同于E5共有序列，其中3個產(chǎn)生了包衣結(jié)構(gòu)蛋白E(GluM9—Gly和Glu291—Gly)和非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B(Ala,83—Val)的氨基酸取代。第一代Vero細(xì)胞生長克隆E5-651的序列與質(zhì)粒cDNA序列沒有不同，而12代以后，在Vero細(xì)胞中鑒定出NS2B和NS3內(nèi)分別有(i)Ser^和Asn間及(ii)Gli^3和Lys間的波動變異。獲得和傳代的E5-651—旦在CEF細(xì)胞中在E的2個核苷酸位點上不同于質(zhì)粒DNA序列，就引起了在E的1151個核苷酸位點上C禾BU之間及在E的1415核苷酸位點上Glu^和Arg之間的波動變異改變之一。當(dāng)CEF細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的病毒又在CEF細(xì)胞中傳代了ll次時，從彷徨變異混合物中僅選出了U(核苷酸1151)或A(核苷酸1415)。此外，鑒定了4個其他的取代，其中兩個產(chǎn)生了編碼改變(表I)。相反，在Vero細(xì)胞中E5-651病毒的12代以后，基因組序列中只有2個位點4254(G/A)和5744(C/A)改變了。由于CEF細(xì)胞中E5-651基因組的改變頻度高于在Vero細(xì)胞中所觀察到的頻度，Vero細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的E5-651病毒因其在應(yīng)用于小鼠神經(jīng)侵襲性分析中顯著高的穩(wěn)定性而被選擇。在評價小鼠中病毒毒力前，E5-651病毒接受空斑對空斑純化以使自發(fā)突變的累積最小化，這些突變可能在Vero細(xì)胞內(nèi)的病毒增殖過程中發(fā)生。E5克隆在細(xì)胞培養(yǎng)中的空斑效力和純化。從Vero細(xì)胞中回收并在這些細(xì)胞中傳代一次的獲得E5—651病毒的空斑表現(xiàn)型用猿LLCM^和Vwo細(xì)^f檢頓lJ。獲4辱Vero細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的E5_651病毒于感染后7天在LLCMK2細(xì)胞上形成了1.5mm直徑的小清晰透明空斑(表II)。相反，此病毒在Vero細(xì)胞上形成小的(<0.lmm)模糊空斑。比較起來，在Vero細(xì)胞中生長的親代E5病毒在Vero和LLCMK2細(xì)胞上均形成大的空斑(5.0—5.2mm)。在CEF細(xì)胞中獲得和生長的克隆E5-651同Vero細(xì)胞來源的病毒一樣，在兩種猿細(xì)胞培養(yǎng)中存在同樣的空斑大小和形態(tài)。E5—651的單個1.5mm空斑從LLCMK2細(xì)胞中收獲，該細(xì)胞是用Vero細(xì)胞培養(yǎng)來源的病毒感染的，并在LLCMK2細(xì)胞內(nèi)接受3個另外的空斑對空斑傳代。在Vero細(xì)胞中進一步增殖后，制備空斑純化的E5—651病毒分離物的留種儲備。在LLCMK2細(xì)胞中空斑對空斑篩選和在Vero細(xì)胞培養(yǎng)中增殖后，E5—651病毒在Vero細(xì)胞和LLCMK2細(xì)胞中空斑表現(xiàn)型的差異沒有改變。此外，空斑純化的分離物在序列上同其獲得的E5—651病毒沒有不同。小鼠中cDNA來源的E5病毒的評價。以前，野生型株TP21顯示對3周大的Swiss小鼠是有毒性的，其腹腔內(nèi)LD5。為5X103PFU(Pletnev,A.G.,和Men，R.(1998).通過與蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95,1746-1751.)。相反，TP21的減毒E5株衍生物只有在病毒接種量高達(dá)107_108PFU時在成年小鼠中存在神經(jīng)侵襲性。在較早的研究中，對于探測Langat病毒株的外周神經(jīng)毒性，SCID小鼠顯示比正常小鼠至少敏感106_108倍。因此，5只一組的3周大SCID小鼠被腹腔接種E5-651的十進制稀釋液或1PFU親代E5株，后者的LDs。以前被確定為0.06PFU(Pletnev，A.G.，和Men，R.(1998).通過與蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,1746-1751.)。105PFU的嵌合TP21/DEN4(vac)也在SCID小鼠內(nèi)作為陰性對照被腹腔注射評價，因為以前的研究表明，它缺少神經(jīng)侵襲性(IPLD5。〉107FPU)的任何證據(jù)(Pletnev,A.G.，和Men,R.(1998).通過與蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，1746-1751.)。親代E5病毒在腹腔接種1PFU后9至13天內(nèi)引起100%死亡率，而105PFU嵌合病毒在7周時間內(nèi)沒有引起致死性疾病。然而，在腹腔接種100PFUE5-651后，5只小鼠中的2只在28或33天時死亡。在隨后的試驗中，5只一組的SCID小鼠腹腔接種十進制稀釋的E5-651克隆，其LD5。被測定為20.4PFU(在重復(fù)試驗中為21.0PFU)。因此，E5-651克隆的神經(jīng)侵襲性較TP21株小5.1X10M咅，并較其直接親代E5病毒的毒性小3.4X102倍，TP21株對SCID小鼠的估計LDs。為0.004PFU，E5病毒對SCID小鼠的估計LD5。為0.06PFU(Plet譜，A.G.,和Men，R.(1998).通過與蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，1746—1751.)。3'-NCR缺失變異體的構(gòu)建和病毒回收。為了增強E5-651克隆對SCID小鼠毒性的減毒水平，在其cDNA基因組中導(dǎo)入了數(shù)種關(guān)鍵性的變異。關(guān)于減毒的活黃病毒疫苗的形成，任何導(dǎo)入侯選疫苗病毒的減毒變異應(yīng)當(dāng)在基因上是穩(wěn)定的，且不能引起免疫原性和防護效力的顯著減小。近期涉及數(shù)種黃病毒的研究提示，3,-NCR缺失滿足了這些要求(Men,R.,Bray,M.,Clark,D.,Chanock,R.M.,和Lai,C.-J.(19%).在RNA基因組3'非編碼區(qū)含有缺失的登革熱4型病毒變異體分析在細(xì)胞培養(yǎng)中的生長限制和在恒河猴內(nèi)病毒血癥類型和免疫原性的改變.J.Virol.70,3930-3937.;Mandl,C.W.,Holzmann，H.，Meixner,T.，Rauscher,S.，Stadler，P.F.,Allison,S.L.，和Heinz，F(xiàn).X.(1998).在蜱傳腦炎病毒3，非編碼區(qū)的自發(fā)和設(shè)計的缺失黃病毒高度減毒變異體的構(gòu)建。J.Virol.72，2132-2140.)。蜱傳黃病毒RNA基因組的3'-NCR的長度在393至800核苷酸間變化，其中只有最后大約340個核苷酸(核心成分)比開放閱讀框架的終止密碼子和核心成分間的區(qū)域更保守(Dobrikova,E.Yu.,和Pletnev,A.G.(1995).蜱傳腦炎病毒基因組的全長DNA拷貝。第一部分.非編碼5'-和3'-區(qū)的分析.BioorganicChemistry21,528-534.;Mandl，C.W.,Holzmann,H.,Meixner,T.,Rauscher,S.,Stadler,P.F.,Allison,S.L.,和Heinz,F.X.(1998).在蜱傳腦炎病毒3'非編碼區(qū)的自發(fā)和設(shè)計的缺失黃病毒高度減毒變異體的構(gòu)建。J.Virol.72,2132-2140.)。近期的TBEV研究提供了證據(jù)，即如果缺失從病毒多蛋白的終止密碼子延伸到核心成分的開始部分，3'-NCR區(qū)的缺失能夠減少毒性而不喪失生存能力(Mandl，C.W.,Holzmann,H.，Meixner,T.,Rauscher,S.，Stadler,P.F.,Allison,S.L.,和Heinz,F.X.(1998).在蜱傳腦炎病毒3，非編碼區(qū)的自發(fā)和設(shè)計的缺失黃病毒高度減毒變異體的構(gòu)建。J.Virol.72,2132-2140.)。我們導(dǎo)入的缺失開始于長開放閱讀框架TAA-終止密碼子后的第五個核苷酸，并延伸至圖1中指示的目的核苷酸(B和C)。所有變異體結(jié)構(gòu)含有額外的3或5個核苷酸，在缺失位點產(chǎn)生了一個AfIII限制性酶剪接位點(圖4C)。最終的變異體質(zhì)粒pE5-3'-320、pE5-3，-374、pE5-3，-449和pE5-3，-471分別含有320、374、449或471個核苷酸長度的缺失。Vero細(xì)胞用上面描述的3'-NCR缺失變異體全長cDNA制備的全長基因組RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染。只有E5-3'-320變異體RNAs產(chǎn)生了可存活的病毒。這些結(jié)果與對TBEV3，-NCR缺失變異體的觀察一致(Mandl,C.W.，Holzmann,H.,Meixner,T.,Rauscher,S.,Stadler,P.F.，Allison,S.L.,和Heinz，F(xiàn).X.(1998)在蜱傳腦炎病毒3'非編碼區(qū)的自發(fā)和設(shè)計的缺失黃病毒高度減毒變異體的構(gòu)建。J.Virol.72,2132-2140.)。缺失延伸進TBEV3，末端或LGT基因組的核心成分則消除了病毒的生存能力。與生存能力不矛盾的TBEV最長缺失保留了3'末端的最后222核苷酸。獲得的E5-3'-320病毒的3'-NCR保留了其基因組的最后244核苷酸。獲得的3'-NCR缺失變異體的特征。獲得的E5-3'-320在猿細(xì)胞上的空斑形態(tài)上與E5-651克隆不同。3'-NCR缺失變異體不能在Vero細(xì)胞上形成可視的空斑，病毒在該細(xì)胞基質(zhì)中被回收(表II)。變異體在LLCMK2上形成空斑，但它們非常小，小于0.2mm。收獲這些獨立的空斑，然后在LLCMK2細(xì)胞系內(nèi)接受空斑對空斑的傳代。最終，E5-3，-320病毒的留種儲備懸液通過Vero細(xì)胞內(nèi)另外擴增制備。確定E5-3'-320變異體的完全基因組序列，并與E5-651克隆的序列比較。測到的唯一差異是E5-3，-320變異體的3'-NCR缺失。親代E5、重組體E5-651和其3'-NCR缺失變異體的復(fù)制效力用接種了0.01多重感染(MOI)的LLCMKz或Vero細(xì)胞檢測(圖5)。在Vero細(xì)胞中，E5-3，-320的生長小于其E5-651親代或E5親代本身104倍。缺失變異體在LLCMK2細(xì)胞內(nèi)也生長不佳，但僅限于9至50倍(圖5和表n)。3'-NCR缺失變異體在SCID小鼠中的神經(jīng)侵襲性。E5-651和其E5-3，-320缺失變異體的神經(jīng)侵襲性在5只一組的SCID小鼠中評價，小鼠腹腔接種了病毒的十進制稀釋液。重組體3'-NCR缺失變異體對SCID小鼠的毒性小于其直接E5-651親代。估計的E5-3'-320腹腔注射的LDs。為479PFU,相比較E5-651為20.4PFU?？傮w上，同其野生型前體LGTTP21病毒相比，克隆的E5-651和E5-3，-320病毒的神經(jīng)侵襲性分別小5,100倍和119,750倍。從瀕死的、腹腔接種了E5或其重組體衍生物的SCID小鼠大腦中回收的病毒的特征。同接種了其生物學(xué)導(dǎo)出的E5親代的小鼠相比，腹腔接種了E5-651或E5-3，-320的小鼠的死亡延遲了2倍(Pletnev,A.G.,和Men,R.(1998).通過與蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,1746-1751.)。此延遲與重組體病毒的減毒增強一致，如SCID小鼠中通過腹腔注射LD5。所測定的。為了解釋觀察到的腦炎發(fā)生的顯著延遲，我們進行了大腦提取物全基因組的測序并與腹腔接種的病毒的序列比較(表III)。大腦提取物以E、NS1、NS2B、NS3、NS4B或NS5中大多數(shù)3個密碼的改變不同于用于引起感染的病毒。3個大腦提取物保留了3個密碼改變，而其余的2個病毒只在一個氨基酸位點上不同于接種的病毒。兩個來自腹腔接種了4.9LD5?；?9LDs。重組體E5-651的SCID小鼠的大腦提取物，具有2個密碼改變，一個在核苷酸1571[G—A(Ala加一Thr)或G—G/A(Ala加一Ala/Thr)]，另一個在核苷酸5794[G—U(Glu鵬—Asp)或G—G/U(GluM9—Glu/Asp)]。所有其它7個密碼改變是獨特的，即在其它提取物中不具有。最初，為了闡明此狀況，一個小鼠E5-651大腦提取物在Vero細(xì)胞中傳代一次，該提取物在E上含有獨特的氨基酸取代(Hisl3。一Tyr)(表III),然后在5個SCID小鼠中通過腹腔接種1或10PFU測試。所有接種的小鼠在14天觀察期間內(nèi)死亡。此外，將在E上含有獨特的氨基酸取代(Gly149—Glu)(表in)并在Vero細(xì)胞中傳代一次的小鼠E5-3'-320病毒大腦提取物，用1,000或100PFU腹腔接種SCID小鼠時，分別致死100。％或80%。這些發(fā)現(xiàn)提示，重組體E5-651和E5-3'-320的神經(jīng)侵襲性提取物中觀察到的自發(fā)性變異，是這些變異體在免疫缺陷小鼠中神經(jīng)侵襲性增加的原因。親代E5和其重組體E5-651或E5-3，-320病毒的免疫原性和協(xié)護效力。用十進制稀釋的親代E5或其cDNA來源的E5-651或E5_3，-320病毒(表IV)腹腔接種3周大的遠(yuǎn)系繁殖Swiss雌性小鼠(7—9g)。接種后22天，免疫和非免疫的(對照)小鼠被放血以測量抗LGTTP21的中和抗體的血清滴度。所有免疫的小鼠均血清轉(zhuǎn)化。用10PFU親代病毒或其任一重組體腹腔免疫的小鼠產(chǎn)生了中等高滴度的抗LGTTP21中和抗體。然而，用10或100倍以上的病毒免疫增加了獲得的TP21中和抗體的滴度。親代E5或其任一重組體衍生物在Swiss小鼠內(nèi)引起的最高血清抗體滴度間沒有顯著的差異。在免疫后第23天，小鼠用2，000LDso的野生型LGTTP21株IP激發(fā)。用10PFUE5、或E5-651、或E5-3，-320腹腔免疫的小鼠對致死性TP21的激發(fā)受到完全的防護，而對照小鼠沒有一個幸免于激發(fā)。值得注意的是，具有在細(xì)胞培養(yǎng)中受限生長并對SCID小鼠的神經(jīng)侵襲性顯著降低的更減毒的變異體(E5-3'-320)能夠在有免疫能力的小鼠中以同樣低的免疫劑量引起完全防護的免疫性。這些數(shù)據(jù)提供了一個假設(shè)基礎(chǔ)，即E53'缺失變異體被考慮為假設(shè)作為獨立疫苗的一個候選疫苗株?？蛇x擇地，此變異體可為進一步改變以產(chǎn)生活的病毒疫苗提供一個基礎(chǔ)，以用于防止由抗原性相關(guān)的蜱傳黃病毒引起的疾病。實施例在外周神經(jīng)毒性上不同于其親代的Langat蜱傳黃病毒感染性cDNA克隆。3個不同的方法被用于構(gòu)建全長LGTTP21的cDNA克隆。這些方法使用下面的分子生物學(xué)技術(shù)。細(xì)胞和病毒制備。猿Vero、LLCMK2和B服細(xì)胞從AmericanTypeCultureCollection購買。細(xì)胞在含有1%谷氨酰胺、10%胎牛血清、50ug/ml慶大霉素、0.25ug/ml兩性霉素B的MEM中，在37。C和5%0)2條件下生長。Langat(LGT)野生型株TP21、其進一步減毒的E5變異體和其TP21/DEN4和E5/DEN4嵌合體的病毒儲備液按前面的描述在Vero細(xì)胞中制備(Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998).通過與蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,1746-1751.)丄GT野生型株TP21株可從RockefellerFoundationCollection獲得。(GordonSmith,C.E.(1956)—個來自馬來亞硬蜱的類似俄國春夏腦炎病毒的病毒.Nature(London)178，581-582.)。LGTE5來自美國傳染病軍事醫(yī)學(xué)研究所(Thind，I.S.,和Price,W.H.(1966a)Langat病毒的一個雞胚胎減毒株(TP21E5).I.病毒對小鼠和猴的毒性.Am.J.Epidemiol.,84,193-213.)。在150cm2組織培養(yǎng)瓶中的Vero細(xì)胞被以0.01的多重感染用TP21或E5病毒感染。在37'C吸附1小時后，病毒接種物被移走并加入新鮮培養(yǎng)基。在病毒感染后的第1、2或5天收獲單個瓶中的內(nèi)容物，用Vero細(xì)胞上的空斑試驗測定病毒的滴度，在感染后7天，用中性紅染色以顯示空斑。這3個病毒的儲備液，TP21為3.8XIO:'、2.2X106和2.4X109PFU/ml，E5為1.2XlO1、4X1'06和2K109剛/rnl。逆轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的病毒被8%聚乙二醇8000(USBiochemicalCorp.,Cleveland,0H)沉淀，在0.4MNaCl中4'C過夜并用離心收集。采用TRI試劑(MolecularResearchCenter,Inc.,Cincinnati,OH)從病毒體中提取總RNA。用SuperscriptIIPreamplification系統(tǒng)(LifeTechnologies,Rockville,MD)進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)，(i)一個寡核苷酸(oligo)(1445)5，-GCCTGCGGAGGGTACCGATATCAGCGGGTGTTTTTCCGAGACACG(SEQIDNO3)與LGT序列在其3'末端，即核苷酸(核苷酸)10,921-10,943，互補并在緊隨LGT3，末端序列之后含有EcoRV和Kpnl位點，或(ii)一個oligo(1087)5，-CTATGGCCAGGTGGAAAGCCGC(SEQIDNO4)在核苷酸7256-7277與LGT序列互補。后一個oligo用來促進基因組5'末端的轉(zhuǎn)錄。在逆轉(zhuǎn)錄之前，5—10gRNA與100ng引物在7(TC孵育5分鐘，然后在冰上冷卻。終容積為1001的RT反應(yīng)混合物含有此熱變性的RNA加S叩erScriptII試劑盒(LifeTechnologies,Rockville,MD)的成分，和200U逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)混合物在42'C孵育2小時，然后冷凍并用作模板以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生雙鏈DNA，在大腸桿菌中構(gòu)建和克隆TP21cDNA，或用于RT-PCR產(chǎn)生的病毒基因組的序列分析。PCR。用于產(chǎn)生雙鏈cDNA的標(biāo)準(zhǔn)PCR混合物在100L總反應(yīng)容積內(nèi)含有每個引物對O.5M、質(zhì)粒DNA200ng或RT產(chǎn)物5-10L作為模板、dNTPs400M、IX緩沖液和TakaraLATaqDNA聚合酶5U(TakaraLAPCR試劑盒，PanVeraCo.，Madison,Wl)。反應(yīng)混合物預(yù)熱至94°C2分鐘，然后進行30次循環(huán)，每個循環(huán)為98°C20秒和68°C15分鐘。病毒基因組的序列分析。(i)TP21基因組、(ii)其更減毒的衍生物株E5的基因組和(iii)從cDNA回收的TP21病毒的完全序列，通過對直接來自病毒RNA的4個重疊RT-PCRcDNA片段進行序列分析而確定。如上所述，oligo1445或1087被用作引物以通過逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA。采用合適的引物和TakaraLAPCR試劑盒進行PCR以擴增4個重疊基因組片段A(核苷酸1到4192)、B(核苷酸3491到7277)、C(核苷酸6131到9669)和D(核苷酸8857到10,943)。PCR引物和序列分析的設(shè)計采用以前公布的LGTTP21株序列(GenBank登記號M86650和M73835)(Mandl，C.W.，lacono—Connors，L.，Wallner，G.,Holzmann，H.，Kunz，C.，和Heinz.F.X.(1991)低毒性蜱傳黃病毒類LangatTP21和Yela核苷酸ev的結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因的序列.Virology185,891-895.;lacono-Connors,L.和Schmaljohn，C.S.(1992)Langat病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的編碼基因的克隆和序列分析及與其他黃病毒的比較分析.Virology188,875-880.;Pletnev，A.G.，和Men，R.(1998).通過與蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,1746-1751.)。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中純化并用Qiagen凝膠提取試劑盒(Valencia,CA)分離。RT-PCR片殺泡序列舟"BigDye冬止循環(huán)測序制備反應(yīng)(BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction(PEAppliedBiosystems/ABIPrism,FosterCity,CA)和一個Model310基因分析儀測定。為測定病毒基因組的3'和5'末端序列，用煙草酸性焦磷酸酶(EpicentreTechnol.Co.，Madison,WI)處理來自獲得的病毒或親代TP21或E5病毒的RNA，以剪接掉帽狀結(jié)構(gòu)。然后，采用T4RNA連接酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)連接病毒RNA的5，和3，末端。Oligo979(與LGT序列在1149-1167核苷酸處互補)被用于通過RT產(chǎn)生第一鏈c麗A。含有基因組5'-和3'-末端連接的雙鏈cDNA片段通過PCR擴增，采用的引物對，oligo916是含LGT序列核苷酸10,349-10,382的正向引物，oligo907是與955-983核苷酸互補的反向引物。然后，最終的長度為1578個核苷酸的PCR產(chǎn)物被測序。實施例1方法1:來自高滴度病毒制劑的TP21基因組的亞克隆片段此方法采用前面在大腸桿菌中克隆的4個重疊cDNA片段(圖1，A部分)，以確定LGTTP21基因組的完整核苷酸序列(Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998).通過與蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,1746-1751.)。這些質(zhì)?？寺?，即p5(LGT核苷酸1至983)、p44(核苷酸930至4828)、p66(核苷酸4539至6571)和p76(核苷酸6525至10，943)，來自由1.8X109PFU/ml的高滴度病毒懸液制備的LGTcDNA文庫。DNA片段p5通過PCR擴增，采用正向引物(oligo1444)5，-GAAGGTGGTCTTTG1)包括Notl位點和緊接基因組5'末端1_22核苷酸上游的SP6啟動子，而反向引物(oligo907)5，-GGGTGCATCTCGACGCGTAGGCCGGTACC(SEQIDNO2)與LGT核苷酸955-983互補并含有Kpnl剪接位點。PCR產(chǎn)物被Notl和Kpnl消化并與相似消化的p44連接。得到的大亞基因組克隆(p49)代表TP21基因組的從5'末端至核苷酸4828，并在4801位點包含一個獨特的Apal剪接位點，被完整地測序。在p76質(zhì)粒構(gòu)建過程中，EcoRV和Kpnl剪接位點在緊接基因組3'末端的下游被摻入TP21cDNA。來自p66和p76的LGTcDNA片段通過利用載體的一個獨特的Nsil限制性位點(LGT基因組的6551位點)和一個Pvul位點連接起來以形成一個較大的cDNA克隆。得到的含基因組3'半段(從核苷酸4539到基因組的3'末端加EcoRV和KpnI位點)的克隆p77被測序，然后用于裝配最后的質(zhì)粒構(gòu)建物中。通過連接被Notl和Apal消化的質(zhì)粒p77和p49的Notl-ApaI-片段完成全長TP21c腿的構(gòu)建。10個穩(wěn)定的單個全長cDNA克隆在用連接混合物轉(zhuǎn)染大腸桿菌株BD1528后被鑒定。質(zhì)粒篩選表明，當(dāng)用EcoRI、PstI和SalI檢測時，這些穩(wěn)定的克隆具有所需的限制性模式。此外，用命名為p76(核苷酸6525至10,943)質(zhì)粒c'洲A連接到廣個長柳PCRcDNA片段制備了一組獨立的全長cDNA，長PCRcDNA片段包括5'末端核苷酸(核苷酸1至6571)并與p76重疊(圖l，A部分)。用此方法通過連接產(chǎn)生的最長cDNA克隆被在大腸桿菌中克隆?；厥諆蓚€穩(wěn)定的全長cDM克隆。在RNA轉(zhuǎn)錄前，將為近似基因組長度選擇的12個pFL-TP21質(zhì)粒的每一個用EcoRV消化，并在苯一氯仿提取蛋白后用乙醇沉淀。實施例2方法2:病毒基因組的長RT-PCRcDNA本方法應(yīng)用長RT-PCR單獨嘗試產(chǎn)生病毒基因組長度的cDNAs。兩種不同的病毒懸液被用作病毒cDNAs的來源；一個在第二天收獲的懸液滴度較低(3.8X10:'PFU/ml)，而另一個在第五天獲取的懸液滴度較高(2.4X109PFU/ml)。PCR混合物含有引物(oligo1444和1445)、101RT產(chǎn)物作為模板和TakaraLAPCR(PanVeraCo.,Madison,WI)試劑盒成分，包括5UDNA聚合酶。PCR產(chǎn)物大約llkb長，通過在瓊脂糖凝膠中電泳與低分子量DNA分開，并用一個Qiagen凝膠提取試劑盒(Venlo,TheNetherlands)從凝膠中分離。在用作RNA轉(zhuǎn)錄模板前，PCR產(chǎn)物用EcoRV消化并通過苯一氯仿提取而純化。這些cDNAs的RNA轉(zhuǎn)錄物(大約1g)然后被轉(zhuǎn)染進Vero細(xì)胞培養(yǎng)，再通過免疫熒光監(jiān)測以證明感染。實施例3方法3:從兩個來自低滴度病毒的重疊PCR片段構(gòu)建全長cDNA克隆本方法應(yīng)用兩個包括TP21完整序列的重疊cDNA片段(圖l，C部分)。這些片段來自低濃度的病毒懸液(3.8X103PFU/ml)。對于LGT基因組的5'半段，采用包括Notl位點、SP6啟動子和LGT序列1_22核苷酸的正向引物(oligo1444)及與LGT核苷酸6637-6657互補的反向引物(oligo1023)5，-CCCAGGGTTGCAAGCCCCAGG(SEQIDNO5),產(chǎn)生一個PCR產(chǎn)物。應(yīng)用PCR產(chǎn)生LGT基因組的3'半段，采用與LGT核苷酸4451-4471互補的正向引物(oligo971)5'-TTGCACCTGACTGAACTGGAG(SEQIDNO6)，以及oligo1445作為反向引物。起初，通過采用p2A(Xhol)載體(Bray,M.，和Lai，C.-J.(1991)通過取代結(jié)構(gòu)蛋白基因構(gòu)建代表性的嵌合病毒.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,10342-10346)的Notl和Kpnl剪接位點，以及存在于兩個RT-PCR片段中的獨特Apal位點，將這兩個PCR片段連接起來而構(gòu)建全長cDNA基因組(圖1)。然而，這個制備全長cDNA的方法失敗了，因為克隆在大腸桿菌中不穩(wěn)定。后來，用一個兩步克隆方法將兩個長片段組合成一個穩(wěn)定的全長cDNA。在第一步中，代表基因組3，半段(核苷酸4451至10，943)的PCR產(chǎn)物用質(zhì)粒p51作為載體被克隆進大腸桿菌。通過將TP21cDNA的一個小BamHI-Pstl-片段插入p5，-2載體的獨特BglII和Pstl位點(Notl、Xhol、HindIII)而形成質(zhì)粒p51，該插入小片段采用適當(dāng)?shù)囊锿ㄟ^PCR獲得(Cahour,A.，Pletnev，A.,Vazeille-Falcoz，M.，Rosen,L.,和Lai，C.-J.(1995)在R欣基因組3;非編碼區(qū).g含缺失的生長限制的登革熱病毒.Virology207，68-76.)。此外，質(zhì)粒p51含有Notl剪接位點、SP6啟動子和登革熱4型病毒基因組的最初88核苷酸。它被用作載體，因為其具有獨特的ApaI剪接位點。PCR產(chǎn)物(LGT核苷酸4451-10,943)用Apal和KpnI消化，然后與一個來自p5'-2A(XhoI)的Kpnl-BamHI-片段一起克隆進p51載體的Apal-BaniHI-消化的區(qū)域。在用連接混合物轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，一個含LGT核苷酸4539至基因組3，末端的克隆(p624-3)根據(jù)其限制性模式被選擇。在第二歩中，代表基因組5'半段(核苷酸1至6657)的PCR產(chǎn)物被用Notl和Apal消化，然后克隆進p624-3，產(chǎn)生了pTP21的全長cDNA克隆。28個獨立的全長LGTTP21cDNA克隆在大腸桿菌株BD1528中傳播時是穩(wěn)定的。但就限制性酶消化模式而言，在穩(wěn)定的全長LGTcDNA中觀察到了一些多態(tài)性。核實了作為感染性RNA轉(zhuǎn)錄物模板的4個質(zhì)粒的病毒序列。這4個質(zhì)粒被命名為pTP21-636、pTP21-649、pTP21-656和pTP21-689，相應(yīng)的數(shù)字被用來指定獲得的病毒。實施例4病毒的RNA轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染和回收含全長TP21cDNA的28個穩(wěn)定pTP21質(zhì)粒的每一個用EcoRV線性化，用酚一氯仿提取并用乙醇沉淀，全長TP21cDNA通過方法3制成(圖1)。對于體外RNA合成，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物在1001容積中含5g線性化的DNA;1mM加帽類似物m7G(5，)ppp(5')G(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA);ATP、CTP和UTP各0.5raM;10mMDTT;1X聚合酶緩沖液；100URNA酶抑制劑；50USP6RNA聚合酶(Promega，Madison，WI)。反應(yīng)混合物在37。C孵育1小時，然后用3URQ1DNA酶(Promega，Madison,WI)37°C消化DNA模板10分鐘。如通過瓊脂糖凝膠電泳分析測定，典型的RNA產(chǎn)量大約為10g。如以前描述的，全長LGT構(gòu)建物的RNA轉(zhuǎn)錄物在有轉(zhuǎn)染試劑LipofectAmine(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)或D0TAP(RocheMolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)存在的情況下，被用于轉(zhuǎn)染近融合的猿Vero或LLCMK2細(xì)胞單層(Pletnev，A.G.,Bray，M.，禾卩Lai，C.-J.(1993)嵌合的蜱傳腦炎和登革熱4型病毒變異對小鼠神經(jīng)毒性的影響.J.Virol.，67，4956-4963.)。在第5天，以及又在第10、15和20天，分離細(xì)胞并傳代。在這些時間的每一次用IFA檢測玻片室中的細(xì)胞，采用LGT特異的鼠抗血清或LGT特異的HMAF檢測LGT蛋白的存在。當(dāng)80—100%的細(xì)胞呈現(xiàn)IFA陽性時，將感染的T-75燒瓶中的內(nèi)容物收集并冷凍，然后用于定性cDNA來源的LGT病毒。這些重組的LGT病毒在猿Vero細(xì)胞中被擴增2次，隨后分離和逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA以進行cDNA擴增和序列分析。用于空斑檢測、細(xì)胞培養(yǎng)中的復(fù)制分析和病毒特異性蛋白放免沉淀的方法以前有描述(Pletnev，A.G.，Bray，M.，Huggins，J.,和Lai，C.-J.(1992)蜱傳腦炎/登革熱4型病毒的構(gòu)建和特性.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89，10532-10536.;Pletnev，A.G.,Bray，M.，和Lai，C.-J.(1993)嵌合的蜱傳腦炎和登革^i4型病毒變異對小鼠神經(jīng)毒性的影響.J.Virol.，67，4956-4963.)。實施例5在小鼠中評價cDNA-來源的病毒親代和克隆的TP21病毒的外周神經(jīng)毒性("神經(jīng)侵襲性")在3周大的遠(yuǎn)系繁殖Swiss小鼠中評價，5只一組的小鼠通過腹腔途徑接種101或10fiPFU的病毒并觀察致死或非致死腦炎28天。使用明顯更敏感的、應(yīng)用免疫缺陷(SCID)小鼠檢測LGT病毒神經(jīng)侵襲性的方法，以分析此重要的毒性表現(xiàn)型(Pletnev，A.G.，和Men,R.(1998).通過用蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95,1746-1751.)。在此試驗中，5只一組的雌性3周大C.B.-17lcr/scid/scid小鼠(TaconicFarm,Germantown，NY)被腹腔接種(i)102PFU親代TP21、或E5、或來自cDNA的TP21，或(ii)105PFU嵌合的TP21/DEN4或E5/DEN4病毒，或(iii)獲得的重組體病毒從1至102PFU的十進制稀釋液。觀察這些小鼠的死亡率7周。減毒的Langat蜱傳黃病毒(E5株)的傳染性cDNA克隆和由其構(gòu)建的3'缺失的變異體，在免疫缺陷的小鼠中表現(xiàn)神經(jīng)侵襲性下降。細(xì)胞和病毒制備。檢定的Vero細(xì)胞(W.H.0,Seed,143代)從Novavax公司(Rockville,MD)獲得。原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)由LindaWyatt博士(NIAID,NIH，Bethesda,MD)友情提供。猿LLCMK2細(xì)胞購自AmericanTypeCultureCollection細(xì)胞在含有1%谷氨酰胺、10%胎牛血清、50ug/ml慶大霉素、0.25ug/ml兩性霉素B的MEM中，37'C和5%0)2條件下生長。LGT野生型株TP21和其進一步減毒的E5變異體的病毒儲備液按前面所述在Vero細(xì)胞中制備。逆轉(zhuǎn)錄和PCR。這些步驟按前面的描述進行。病毒基因組的序列分析。通過對直接來自病毒RNA的4個重疊RT-PCRcDNA片段的序列分析測定(i)E5、(ii)從cDNA回收的E5禾B(iii)從感染后第14或第28天的瀕死小鼠腦中分離的E5或其衍生物的基因組完整序列。oligo1445被用作引物通過上面描述的逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA。采用合適的引物和TakaraLAPCR試劑盒進行PCR以擴增4個重疊基因組片段:A(核苷酸1到4192)、B(核苷酸3491到7277)、C(核苷酸6131到9669)和D(核苷酸8857到10,943)。PCR引物和序列分析采用以前公布的LGT序列(GenBank登記號AF253419和AF253420)設(shè)計。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中純化并用Qiagen凝膠提取試劑盒分離。RT-PCR片段的序列用BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReaction(PEAppliedBiosystems/ABIPrism,FosterCity，CA)禾口一個Model310GeneticAnalyzer實施例6方法I:LGTE5全長cDNA的構(gòu)建(圖4A).E5基因組的一個長RT-PCRcDNA片段和含有LGTTP21的全長感染性cDNA的質(zhì)粒pTP21—636被用于此目的。質(zhì)粒pTP21—636被用Sfil和Agel消化，其位點在此載體中是獨特的。通過高精度PCR產(chǎn)生了E5基因組的幾乎全長cDNA(大約10.5kb)(圖4A),采用含LGT序列最初23核苷酸的正向引物1484和與LGT3'末端的核苷酸10,439-10，460互補的反向引物1107。此RT-PCR片段來自低滴度(1.2Xl(TPFU/ml)的E5病毒懸液。PCR產(chǎn)物(LGTE5核苷酸1-10，460)用SfiI和AgeI消化，然后克隆進pTP21—636載體(核苷酸數(shù)字表示識別位點序列的第一個堿基和相應(yīng)的LGT基因組的全長序列)的SfiI(133)—Agel(9737)部分，它含有一個Notl剪接位點、一個SP6啟動子以及在E5中完全保留的LGTTP21基因組的最初133核苷酸和核苷酸9737-10，943。還有EcoRV和Kpnl剪接位點緊接基因組3，末端的下游插入LGTcDNA(圖4)。通過限制性酶分析和TP21與E5基因組不同基因組區(qū)域的序列分析，鑒定得到的含LGTE5的pE5克隆。6個獨立的全長E5cDNA克隆(質(zhì)粒pE5)當(dāng)在大腸桿菌中傳播時在質(zhì)粒載體中是穩(wěn)定的。測定這6個質(zhì)粒之一的完整病毒序列；此質(zhì)粒被命名為pE5—651，對應(yīng)的數(shù)字被用于命名獲得的病毒。實施例7方法II:在全長LGTE5cDNA中導(dǎo)入缺失(圖4B和4C).為在E5基因組的3'NCR中導(dǎo)入缺失，PCR產(chǎn)生的3'末端Agel位點(核苷酸9737)和Kpnl位點間的亞片段被克隆進p624-3載體，該載體含有這些獨特的剪接位點。獨特的AflII位點(核苷酸10,379)在TAA-終止密碼子的下游被導(dǎo)入E5-651基因組的3'NCR(圖4B和4C)。第一個PCR擴增的片段的產(chǎn)生采用pE5—651質(zhì)粒作為模板，正向引物(oligo1013)含有LGT基因組的9603-9623核苷酸，反向引物(oligo1638)為5，-TTGGACTCCTTGCTTMGGCTTTAAAATATTGAGCTCTC(SEQIDNO7)(AflII位點序列是黑體的，終止反密碼子是下劃線的)。此PCR片段用Agel和Aflll消化。4個長度為320、374、449或471核苷酸的AflII位點下游缺失通過PCR引入，采用的反向引物(oligo1445)含有與LGT3'末端最后23核苷酸互補的序列以及EcoRV和Kpnl位點，正向引物(oligo1640、1641、1642或1643)含有耙缺失序列和側(cè)向Aflll位點。這些誘變引物的序列如下對于10,379-10,700核苷酸間的320個核苷酸缺失，oligo1640，5，-ACTGGGCGTTATCTTAAGGCCCCAGGGGGGAAACCCCTG(SEQIDNO8);對于10,379-10,754核苷酸間的374個核苷酸缺失，oligo1641，5，-GGATATTTCCTCCTTMGATACCAAATGTCCCCTCGTCA(SEQIDNO9);對于10,379-10,829核苷酸間的449個核苷酸缺失，oligo1642，5'-CCCCTCGTCAGACTTAAGGGGGGGCGGTTCTTGTTCTCC(SEQINNO10);對于10,379-10，851核苷酸間的471個核苷酸缺失，oligo1643，5，-ACGGACGTGCGCCTTAAGAAACTTTGTGAGACCCCTTGC(SEQINNO11)。PCR片段用Aflll和Kpnl消化，然后與一個來自如上描述的第一個PCR的Agel-AfIII-片段一起克隆進p624-3載體的Agel-Kpnl-消化的區(qū)域。在用連接混合物轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，在基因組的3'NCR中含有靶缺失的克隆(p624-3，-320、p624-3'-374、p624-3，-449和p624-3，-471)被用序列分析鑒定。通過己被Notl和Agel消化的質(zhì)粒p624-3'-320、p624-3，-374、p624-3'-449或p624-3，-471與pE5—651的Notl—Agel片段的連接，完成具有基因組3'NCR缺失的全長E5cDNA克隆的構(gòu)建。穩(wěn)定的單個全長E5cDNA克隆(pE5-3，-320、pE5-3'-374、pE5-3，-449和pE5-3'-471)，在基因組的3，NCR含有320、374、449或471核苷酸長度的缺失，通過序列分析而鑒定。實施例8RNA轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染和病毒的回收含全長LGTcDNA(圖4)的每個穩(wěn)定的pE5質(zhì)粒用EcoRV線性化，用酚一氯仿提取并用乙醇沉淀。為體外RNA合成，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物在1001容積中含有5g線性化的DNA;1mM帽類似物m7G(5')ppp(5，)G(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA);ATP、CTP禾tlUTP各0.5mM;10mMDTT;IX聚合酶緩沖液；100URNA酶抑制劑;50USP6RNA聚合酶(Promega,Madison,WI)。反應(yīng)混合物在37'C孵育1小時，然后用3URQ1DNA酶(Promega,Madison,WI)37'C消化DNA模板10分鐘。如通過瓊脂糖凝膠電泳分析所測定的，典型的RNA產(chǎn)量大約為10g。全長LGT構(gòu)建物的RNA轉(zhuǎn)錄物在有轉(zhuǎn)染試劑LipofectAmine(GibcoBRL,Gaithersburg，MD)存在的情況下，被用于轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞或猿Vero細(xì)胞的近融合單層。在第5天，以及又在第10、15和20天，分離細(xì)胞并傳代。在這些時間用IFA檢測在玻片室中培養(yǎng)的細(xì)胞，采用LGT特異的鼠抗血清或LGT特異的HMAF檢測LGT蛋白的存在。當(dāng)80—100。/。的細(xì)胞呈現(xiàn)IFA陽性時，將感染的T-75燒瓶中的內(nèi)容物收集并冷凍，然后用于定性cDNA來源的LGT病毒。這些重組的LGT病毒僅在猿Vero細(xì)胞或CEF細(xì)胞中被擴增1次，隨后分離和反轉(zhuǎn)錄病毒RNA以進行cDNA擴增和序列分析。用相似的方式，Vero細(xì)胞來源的或CEF細(xì)胞來源的克隆E5一651的序列測定于相應(yīng)細(xì)胞系中額外傳代11次之后，或在LLCMK2細(xì)胞上空斑對空斑純化及Vero細(xì)胞上放大一圏之后進行。用于空斑試驗和細(xì)胞培養(yǎng)中復(fù)制分析的方法以前有描述(Pletnev，A.G.,Bray,M.,Huggins，J.,和Lai,C.-J.(1992)嵌合的蜱傳腦炎和登革熱4型病毒變異對小鼠神經(jīng)毒性的影響.J.Virol.,67,4956-4963.)。此外，免疫染色斑點形成試驗(Ishimine,T.，Tadano,M.,Fuk麗da,T.，和Okuno,Y.(1987)一個檢測登革熱病毒的改良的感染性測定和中和試驗的微量方法。BikenJ.30,39-44)和空斑試驗一起被用于測定病毒濃度，因為重組體病毒不在Vero細(xì)胞上產(chǎn)生明顯的空斑。在MEM中連續(xù)10倍稀釋的病毒懸液在6孔或24孔組織培養(yǎng)板的重復(fù)孔內(nèi)孵育(0.2ml)，MEM含有2X熱滅活的胎牛血清(FBS)，細(xì)胞培養(yǎng)板含有Vero或LLCMK2細(xì)胞單層。在37'C吸附1小時后，移出接種物，用瓊脂覆'蓋6孔板中的細(xì)胞，并在7天后用中性紅染色以顯示空斑。24孔板中的細(xì)胞被用含有2%FBS、50ug/ml慶大霉素、0.25ug/ml兩性霉素B和1%黃蓍膠(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)的MEM覆蓋并在37'C和5%(:02下孵育4天。移出培養(yǎng)基，用甲醇固定細(xì)胞單層30分鐘并用PBS淋洗2次?？變?nèi)的細(xì)胞接著用1:1000稀釋的LGT特異性鼠抗體和過氧化物酶標(biāo)記的聚合物處理，聚合物與抗鼠免疫球蛋白(DakoCo.，Carpinteria,CA)連接，在PBS中1:10稀釋。用0.01%H202和0.04%3,3，-二氨基聯(lián)苯胺(SigmaChemicalCo.,St.Louis,M0)PBS溶液形成了感染細(xì)胞的抗體結(jié)合斑點，并被計數(shù)，病毒濃度表達(dá)為斑點形成單位每毫升(FFUM)。實施例9在小鼠中評價cDNA來源的病毒在一個以前的研究中觀察到，免疫缺陷(SCID)小鼠在探測神經(jīng)侵襲性上較遠(yuǎn)系繁殖的Swiss小鼠敏感107至108倍(Pletnev,A.G.,和Men,R.(1998).通過用蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,1746-1751.)。為此，SCID小鼠被用來檢測LGTcDNA來源的病毒E5和其3'-NCR缺失變異體的神經(jīng)侵襲性。在此試驗中，5只一組的雌性3周大C,B.-17lcr/scid/scid小鼠(TaconicFarm,Germantown,NY)被腹腔接種cDNA來源的E5(克隆651)和其3'-NCR缺失變異體的十進制稀釋液。觀察這些小鼠的死亡率7周。獲取具有進展性腦炎表現(xiàn)的瀕死小鼠的血液、肝和腦，用MEM制備10%組織懸液，冷凍并以后用于病毒分離和序列分析。這些組織懸液中病毒的濃度通過采用單層Vero或LLCMK2細(xì)胞進行空斑試驗或斑點形成試驗而測定。如上所述，100L10%的組織懸液被用于分離RNA、反轉(zhuǎn)錄、通過PCR進行cDNA擴增以及回收病毒的測序。此外，鼠腦分離的E5-651或E5-3，-320病毒在Vero細(xì)胞中擴增并在5只一組的3周大SCID小鼠中評價，這些小鼠接種了十進制稀釋的病毒。親代E5和重組體E5-651或E5-3，-320病毒的免疫原性在腹腔接種了10、102、1(^或l(yPFU的3周大雌性Swiss小鼠中評價。在接種后22天，小鼠被放血以評價抗體反應(yīng)，次日用2,000IPLD5。的TP21病毒腹腔激發(fā)并再觀察4周。為測定LGT病毒中和抗體的滴度，10倍稀釋的血清被56。C加熱滅活30分鐘。血清的2倍連續(xù)稀釋液(從1:10血清稀釋液開始)與等容積大約含100FFU的TP21病毒懸液混合?；旌衔镌?7'C孵育30分鐘，0.1ml重復(fù)加入LLCMK2細(xì)胞的24孔板內(nèi)。在37'C吸附1小時后，移出接種物，用含有2%FBS、50ug/ml慶大霉素、0.25yg/ml兩性霉素B和1X黃蓍膠(SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0)的MEM覆蓋細(xì)胞，并用上面描述的斑點形成試驗滴定感染性病毒?？贵w滴度即是，同采自非免疫小鼠的血清相比，減少斑點形成50%的最高抗體稀釋度。實施例10從使用適量Langat病毒的受試者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)已經(jīng)確定，類人靈長類，而非其它動物，可容易地通過外周途徑用黃病毒感染(Simmons,等人，Phipp.J.Sci.44:1-247,1931和Rosen,Am.J.Trop.Med.Hyg.7:406-4101958)。猴的感染提供了人類黃病毒感染的最接近的試驗系統(tǒng)。恒河猴對黃病毒感染的反應(yīng)與人類相似，即有4至6天的病毒血癥，盡管低級靈長類不形成臨床黃病毒癥狀。在猴中研究黃病毒的目的是(1)評價各種候選疫苗的免疫原性；(2)評價候選肝黃病毒疫苗的感染性和毒性(減毒表現(xiàn)型)，如測量病毒血癥的持續(xù)時間和表述為PFU/ml的峰值病毒濃度；和(3)評價上面提到的疫苗對黃病毒激發(fā)的防護效力。(1)接種每個恒河猴用總量2Xl(f至2Xl(rPFU的病毒接種，病毒稀釋在Eagle's最小必需培養(yǎng)基/0.25%人血清白蛋白中。通常，給麻醉的動物2次皮下用藥。(2)血液采集在病毒接種后，每天取血液樣本3.0ml兩周，在第3周、第4周、第6周和第8周采血5.0ml。(3)黃病毒激發(fā)在認(rèn)為病毒激發(fā)適于評價防護效果的地方，猴子用非減毒的病毒以0.5ml容積中102至105PFU/劑的劑量在上臂區(qū)接種。(4)實驗室檢測血清樣本被用于測定(a)通過直接病毒空斑試驗測定病毒血癥時間；(b)通過放免沉淀和ELISA測定黃病毒特異性抗體的滴度；和(c)通過空斑減少中和試驗測定中和抗體的滴度，所有試驗是疫苗開發(fā)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所熟知的。由于為了清晰表達(dá)和理解，本發(fā)明已經(jīng)被相當(dāng)詳細(xì)地進行了描述，一個本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解，可以做各種形式和細(xì)節(jié)的改變而不脫離本發(fā)明的真正范圍。上面提到的所有插圖、表格和列表，以及專利、申請和發(fā)表物均在此合并為參考文獻。和E5ZJ司基因組序列的不同，通過對最初在大腸桿菌中克隆的病毒基因組片段的序列分析而確定，或在RT-PCR引出后直接檢測。NT位置~~AA改變克隆的片段'5RT-PCR片段25感染性克TP21E5TP21E5隆3)"在大腸桿菌中克隆的LGT基因組的cDNA片段的序列分析在以前有描述(Pletnev和Men,1998)。)病毒基因組的共有序列，通過對RT-PCR片段進行序列分析而確定，RT-PCR片段來自兩個在滴度上相差102—3倍的病毒分離制劑(見實施例)。優(yōu)勢堿基顯示在每個基因組共有序列的指定核苷酸位置。如重復(fù)測定所示，較小量的另一個堿基偶爾地在某個位置被測到，例如在個核苷酸1437。引起編碼改變差異的LGTTP21和E5株之間共有序列核苷酸的不同以粗體字母顯示。TP21和E5株的核苷酸和氨基酸編號是一致的，因為這些病^貝-有相同數(shù)量的核苷酸和氨基酸。'"獲得的636、649、656和689病毒基因組的序列通過分析由RT-PCR獲得的cDNA片段而確定。'在TP21和E5氨基酸共有序列不同的位3！，4個獲得的cDNALGT克隆序列被下劃線。注意——表示TP21和E5之間在指定的位置上，用克隆的基因組片段和/或RT-PCR基因組片段測定時，編ii馬的不同。一一表示用這兩種序列分析方法測定時，同樣的編碼差異。5,NCR3561C371Thr犯>Pro461Leu110>HepreM514957Val160>XjaE1325Phe119>Val13271342143715671823Gly2S5>Ser1968Phe333>Ser2135Asn389>AspNS1300SValI84>Met3403NS2A3635Pro41>Ala36373964NS3楊2Asn，2>Scr5340Phe，::8>Tyr53745546Phe317>LeuNS5SS7S892SSei^22>Thr92S83'NCR10516-171060110635106SS-910761-2-10838-9,ccAcCGACGCblcGCUACJ-IACGCG"lrlcr一UG一GIACUGCUccAcCGACGCGAACUACGAUGCGGAUCGGAACUGCUcc入cCGACGCUCGCUACAACGCGAUCUUCGACUGCU、r、rj,、rGGuCGCAUUUAACUACGAUGCAGAUCUGG,CUCAG_)-I一I一IIIIr，r,)'5cGGuG,ACGUUCGCAGUAGCCGGAUCUUGGA--CAG37表2.(^從質(zhì)粒(:I)NA'l'獲fU感染性L(;T'IT2I的過程屮發(fā)生的序列變異。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表3.在成年Swiss小^屮，親代l.(;T株和cl)NA來源的l-GTTf121病毒克隆的沖經(jīng)侵襲性。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>、鼠死r:的數(shù)II/i式驗的小IH數(shù)11(%死i':率)。"i只股腔接種'rm的小鼠存活但癱瘓了5天,然后恢復(fù)。表A.當(dāng)蚊細(xì)胞中回收的TP21/DEN4和E5/DEN4嵌合體適應(yīng)在猿細(xì)胞中有效生長時獲得的變異。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>a從蚊C6/36細(xì)胞中的cDNA回收的病毒，然后在猿Kra細(xì)胞中傳代5次。bDEN-l基因組的核苷酸數(shù)字。e導(dǎo)致喪失潛在的糖化位點表b,川ji疫n:'川的生KT(《'〃'細(xì)胞的1.(;T/m':N'i欣合休的祌經(jīng)侵襲性。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>。來自Pletnev和Men1998(Pl由ev,A.G.,和Men,R.(1998).通過用蚊傳4型登革熱黃病毒的欣合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,17:16-1751.)的數(shù)據(jù)，為比較而引用。b5只存活的小鼠在第50天川PRJ的TP21病報脂腔激發(fā)。所有逸些小鼠在激發(fā)后10至13天死亡。5只依然存活者的腦、肝和血50天時彼d并池過l'l:接k'T-l)CK分析檢測病賴丄貼l組，通過rero細(xì)胞培養(yǎng)的接種檢測活病毒,在接種后7天通過免疫熒光訃衍病"iH/i:船。表C.川收劑MLangatTl)21細(xì)4(vac)欣合體股腔(IP)免疫近親緊敏的小鼠防護了其后用高毒性TBEV株Absettarov的腹腔激發(fā)。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表II.在雞卵屮^代、和隨后從全K;cl)NA屮回收以及從K::r非編碼區(qū)刪除320核苷酸過程中,Langat病毒(LGT)神經(jīng)侵襲性的承襲和減賴。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>"在感染后第7天的空斑大"數(shù)據(jù)取自生Kllll線分析(顯示于圖[T)，其屮M0I為0.01,且感染細(xì)胞培養(yǎng)基中的病毒滴度通過第5天的免疫染色斑點形成試驗(見實施例)測定。"數(shù)據(jù)來自Pletnev,A.(;.，和R.(1998).通過與蚊傳4型登革熱黃病毒的嵌合減毒Langat蜱傳黃病毒。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95,17-16-1751.<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>免疫后22天采糶的小鼠血清屮的屮和抗體采川TP21病毒通過50%焦點減少試驗測定死亡小鼠的數(shù)目/受試小鼠的數(shù)序列表<110>美國國有健康與人類服務(wù)部〈120>蜱傳黃病毒的全長感染性cDNA克隆<130>NIH157.001C1<140〉US60/181,490〈141〉2000—02—10<160>11〈170>FastSEQforWindowsVersion4.0〈210><211><212>175瞧<213>引物<400>1gaaggtggtctttgcggccgcatcatacacatacgatttaggtgacactatagagatttt60cttgcgcgtgcatgc75<210〉2<211>29〈212>腿〈213>引物<400〉2gggtgcatctcgacgcgtaggccggtacc29<210>3<211>45〈212>DNA<213>引物〈400>3gcctgcggagggtaccgatatcagcgggtgtttttccgagacacg45<210〉4<211>22<212>DNA<213>引物<400>4ctatggccaggtggaaagccgc22<210>5<211>20<212〉腿<213>引物<400>5cccagggttgcaagccccag20<210>6<211〉21<212>腿<213〉引物<400>6ttgcacctgactgaactggag21<210>7<211>39<212>DNA<213>引物<400〉7ttggactccttgcttaaggctttaaaatattgagctctc39〈210〉8<211>39<212〉瞧<213>引物<400>8actgggcgttatcttaaggccccaggggggaaacccctg<210>9<211>39<212>艦<213>引物<400>9ggatatttcctccttaagataccaaatgtcccctcgtca<210〉10<211>39<212>腿<213>引物<400>10cccctcgtcagacttaagggggggcggttcttgttctcc<210>11<211>39<212>腿<213〉引物<■>11acggacgtgcgccttaagaaactttgtgagaccccttgc權(quán)利要求1.一種Langat蜱傳黃病毒株TP21的全長感染性cDNA克隆。2.—種Langat蜱傳黃病毒株E5的全長感染性cDNA克隆。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆，其進一歩包括來自如表2中所限定的TP21-636的變異體。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆，其進一步包括來自如表2中所限定的TP21-649的變異體。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆，其進一步包括來自如表2中所限定的TP21-656的變異體。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克隆，其進一步包括來自如表2中所限定的TP21-689的變異體。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克隆，其進一步包括來自如表I中所限定的E5-651的變異體。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克隆，其進一步包括來自E5-3'-320的變異體，所述克隆具有Langat株E5的從核苷酸10，379延伸至10,700的缺失。9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的克隆，其進一步包括至少一種毒性減小的變異體，或者是自發(fā)形成的，或者是基因工程產(chǎn)生的。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的克隆，其被整合進載體中。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的克隆，其中所述的載體是質(zhì)粒。12.用權(quán)利要求1或2所述的克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞。13.從權(quán)利要求1或2所述的全長cDNA克隆轉(zhuǎn)錄的全長感染性RNA。14.用權(quán)利要求13所述的RNA感染的真核宿主細(xì)胞。15.從權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的病毒。16.—種單位劑量的免疫原性組合物，其包括權(quán)利耍求15所述的病毒。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的單位劑量，用作藥劑。18.—種單位劑量的疫苗，其包括權(quán)利要求15所述的病毒。19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的單位劑量的免疫原性組合物，用作藥劑。全文摘要Langat蜱傳黃病毒的一個全長感染性cDNA克隆。文檔編號C12N5/02GK101519657SQ200810131870公開日2009年9月2日申請日期2001年2月9日優(yōu)先權(quán)日2000年2月10日發(fā)明者A·普列特尼奧夫,R·沙諾克申請人:美國國有健康與人類服務(wù)部