專(zhuān)利名稱(chēng)：腸道病毒71型cDNA感染性克隆、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA病毒拯救技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及腸道病毒71型cDNA感染性克隆、 其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸道病毒(Enterovirus) 71型(EV71)屬于小核糖核酸病毒科,腸道病毒屬?；蚪M為單股正鏈RNA。EV71主要感染5歲以下的兒童，通過(guò)糞-口途徑或飛沫進(jìn)行傳播，其感染主要弓I起手足口病(HFMD)，在臨床上與柯薩奇病毒A16感染所引起的手足口病難以區(qū)別。嚴(yán)重的EV71感染還能引起無(wú)菌性腦炎、腦膜腦炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹以及心肌炎和肺水腫等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，導(dǎo)致重癥甚至死亡病例的發(fā)生。EV71自1969 年首次由Schmidt等從加利福尼亞患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中分離出來(lái)后， 已在世界范圍內(nèi)引起十多次的爆發(fā)和流行。近年來(lái)，EV71的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢(shì)， 令人關(guān)注的是該地區(qū)的EV71感染引起越來(lái)越嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。2008年和2009年以EV71感染為主的手足口病在中國(guó)大陸多個(gè)省市流行，共導(dǎo)致479名兒童死亡。目前尚無(wú)治療EV71感染的特效藥物，主要通過(guò)對(duì)癥治療控制病情的發(fā)展。應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建RNA病毒的感染性克隆，比傳統(tǒng)的細(xì)胞傳代方法制備病毒的安全性高，并且可以避免病毒在傳代過(guò)程中引入的突變。此外通過(guò)基因工程的技術(shù)手段可以容易地實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒基因組的改造，如定點(diǎn)突變、重組、缺失和嵌合等，為闡明病毒的致病機(jī)制，研發(fā)新的抗病毒藥物及獲得新的疫苗候選株奠定重要的基礎(chǔ)。Racaniello VR和Baltimore D于1981年首次利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建了脊髓灰質(zhì)炎病毒的cDNA感染性克隆，提供了在DNA水平上研究RNA病毒的可能。2005年，Arita 等構(gòu)建了 EV71標(biāo)準(zhǔn)株BrCr的一系列變異體的感染性克隆，研究了在猴子模型中，決定溫度敏感性的突變位點(diǎn)對(duì)病毒神經(jīng)毒力的影響。近年來(lái)，中國(guó)大陸時(shí)有EV71的流行爆發(fā)，迫切需要構(gòu)建出能夠代表我國(guó)EV71流行株特點(diǎn)的感染性克隆，為研究EV71的致病機(jī)理和抗病毒藥物提供技術(shù)支持。缺乏我國(guó)EV71流行株的感染性克隆以及EV71的快速變異，使得利用傳代病毒進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)的結(jié)果可靠性差，成為影響抗EV71藥物研發(fā)的主要技術(shù)瓶頸。因此構(gòu)建我國(guó)EV71流行株的感染性克隆，將填補(bǔ)我國(guó)EV71標(biāo)準(zhǔn)株的空白，并為抗EV71病毒藥物的研發(fā)及EV71疫苗的研發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供腸道病毒71型流行株的cDNA感染性克隆、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其是通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)獲得的腸道病毒71型SZ98 pro株的cDNA感染性克隆。所述腸道病毒71 型SZ98 pro株是中國(guó)深圳98的實(shí)驗(yàn)室傳代株(SZ98 pro)。前述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所
3示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將第215位Ρι·ο替換為His，或?qū)⒌?62位Glu替換為Gly，均不會(huì)影響其功能。前述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。本發(fā)明還提供一種構(gòu)建上述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的方法，其是以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，通過(guò)RT-PCR得到全長(zhǎng)cDNA克隆。本發(fā)明還提供含有上述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的載體。優(yōu)選地，出發(fā)載體為 pBR322。本發(fā)明還提供含有上述載體的宿主細(xì)胞,其為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) SZ98 pro/pBR322/DH5 α，已于2011年12月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5659。本發(fā)明還提供制備腸道病毒71型SZ98 pro株的拯救病毒的方法，首先對(duì)腸道病毒71型SZ98 pro株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)用于構(gòu)建cDNA克隆的引物和酶切位點(diǎn)，通過(guò)引物在基因組cDNA的5’端引入T7啟動(dòng)子，在其3’端引入polyA尾，然后以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到全長(zhǎng)cDNA克隆，酶切線(xiàn)性化后利用T7聚合酶系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，用體外轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，獲得拯救病毒。本發(fā)明進(jìn)一步提供上述腸道病毒71型cDNA感染性克隆在制備抗EV71病毒藥物及疫苗中的應(yīng)用，并通過(guò)對(duì)感染性克隆進(jìn)行基因工程改造，以更好地闡明病毒的致病機(jī)制， 研究抗病毒的策略。本發(fā)明構(gòu)建的我國(guó)EV71流行株的感染性克隆，填補(bǔ)了我國(guó)EV71標(biāo)準(zhǔn)株的空白，為抗EV71病毒藥物的研發(fā)及EV71疫苗的研發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)感染性克隆的基因工程改造，可以更好地闡明病毒的致病機(jī)制，研究抗病毒的策略。


圖I為SZ98與SZ98 pro序列對(duì)比結(jié)果。圖2為通過(guò)比對(duì)24株EV71的結(jié)構(gòu)蛋白VPl的基因序列繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。圖3為用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄得到的EV71病毒基因組的RNA到vero細(xì)胞24h后， 觀察到的CPE結(jié)果。圖4為接種SZ98 pro株拯救病毒的vero細(xì)胞經(jīng)裂解后,離心所得上清的western blotting.結(jié)果。圖5為用SZ98 pro株拯救病毒接種vero細(xì)胞后的病毒增殖曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例I腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組測(cè)序與序列分析根據(jù)EV71基因組的保守序列設(shè)計(jì)了 9對(duì)通用引物對(duì)腸道病毒71型中國(guó)深圳98的實(shí)驗(yàn)室傳代株，即SZ98 pro株進(jìn)行基因組測(cè)序。使用DNAStar軟件對(duì)SZ98株與其實(shí)驗(yàn)室傳代株的基因組序列包括5’ -NTR區(qū)、3’ -NTR區(qū)和蛋白編碼區(qū)的序列以及由其編碼的蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析和比對(duì)，SZ98與SZ98 pro序列對(duì)比結(jié)果如圖I所示。從GenBank提取 EV71其他株的基因組序列進(jìn)彳丁對(duì)比。SZ98株與其實(shí)驗(yàn)室傳代株的基因組序列一致為96%, 其中5’-UTR區(qū)的一致性為98%，3’-UTR區(qū)的一致性為93 %。兩者編碼的多聚蛋白氨基酸序列的一致性為97%。通過(guò)比對(duì)24株EV71的結(jié)構(gòu)蛋白VPl的基因序列，應(yīng)用MeGa3. I軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。實(shí)施例2腸道病毒71型SZ98 pro株的全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建根據(jù)測(cè)序結(jié)果和選擇的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)了 2對(duì)引物，5’端上游引物Sal-T7_EV71+ 引入T7啟動(dòng)子序列及Sal I酶切位點(diǎn)，3’端下游引物Hind-End-引入37個(gè)Poly(T)及 HindIII酶切位點(diǎn)。由Sangon公司合成。用Trizol提取病毒基因組RNA。用長(zhǎng)片段逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV Reverse Transcriptase (貨號(hào)M1705,購(gòu)自 Promega 公司)以病毒基因組 RNA 為模板，以3’端下游引物Hind-End-為反轉(zhuǎn)錄引物，42°C反應(yīng)2h反轉(zhuǎn)錄全長(zhǎng)cDNA，然后用 DNA聚合酶PrimeSTAR(貨號(hào)DR010S，購(gòu)自TaKaRa公司)分兩段進(jìn)行基因組全長(zhǎng)擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖電泳檢測(cè)。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，雙酶切依次連入PBR322 載體，用Sal I和HindIII酶切鑒定是否插入了目的片段，并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行全長(zhǎng)的基因組測(cè)序，排除克隆構(gòu)建過(guò)程中突變的引入。腸道病毒71型SZ98 pro株的全長(zhǎng)cDNA克隆， 其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，由其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。用構(gòu)建好的含有腸道病毒71型SZ98 pro株全長(zhǎng)cDNA克隆的pBR322載體轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5 α，得到 SZ98pro/pBR322/DH5 α，保藏號(hào) CGMCC No.5659。實(shí)施例3體外轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)待vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)生長(zhǎng)為單層，用PBS清洗細(xì)胞面3次。 用O. 25%的胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓時(shí)終止消化，將胰酶吸出，立即加入含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打瓶底，使細(xì)胞完全脫離瓶底并分散為單細(xì)胞懸液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為2 X IO5個(gè)/ml，六孔板每孔接種2ml，置37 °C，5 % CO2孵箱培養(yǎng)。24h后(細(xì)胞豐度為80% )用于RNA轉(zhuǎn)染。體外轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞轉(zhuǎn)染用HindIII對(duì)病毒cDNA克隆的3’端進(jìn)行酶切，得到線(xiàn)性化的DNA模板,酹-氯仿抽提純化后用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MEGA script High Yield Transcription Kit (貨號(hào)AM1334,購(gòu)自 Ambion 公司)在體外轉(zhuǎn)錄出 RNA,用 Trizol 進(jìn)行提取和純化。vero細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，接種六孔板24h后，換成不含血清的DMEM培養(yǎng)基，用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔轉(zhuǎn)染2 μ g RNA。轉(zhuǎn)染后每天觀察細(xì)胞，可見(jiàn)典型的CPE，部分細(xì)胞圓縮、脫落(圖3，A為病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)，B 為細(xì)胞對(duì)照)。待CPE達(dá)75%以上或觀察5d后，收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液進(jìn)行鑒定與傳代。實(shí)施例4RT-PCR鑒定拯救病毒的特異序列應(yīng)用通用引物2F(1094) (5，-GCAGTGGATAAACCAACGC-3’)和 2R(2116) (5’-ATAGGCTATGAGCATCTTGC-3’)擴(kuò)增病毒基因組第1094位至2116位核苷酸，通過(guò)測(cè)序分
析對(duì)病毒進(jìn)行鑒定。實(shí)施例5免疫印跡(Western blotting)檢測(cè)當(dāng)六孔板中vero細(xì)胞的CPE達(dá)到50%時(shí)，用Iml預(yù)冷的PBS收集細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液RIPA(購(gòu)自Promega公司)，冰浴半小時(shí)裂解細(xì)胞，離心收集上清液，即為細(xì)胞與病毒的總蛋白樣品。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，抗體孵育及ECL顯色。其中一抗為抗EV71鼠單克隆抗體(貨號(hào)ab36367,購(gòu)自abeam公司)，二抗為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(貨號(hào)SC2031，購(gòu)自Santa Cruz公司)。免疫印跡結(jié)果(圖4)顯示有EV71的特異結(jié)構(gòu)蛋白VPl和VP2兩條帶。條帶位置與EV71標(biāo)準(zhǔn)株BrCr-TR和BrCr-TS —致。實(shí)施例6微量滴定法測(cè)定病毒的滴度(TCID5tl)將vero細(xì)胞接種至96孔板，按IX IO4個(gè)/孔進(jìn)行接種。2d后細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層。 取待滴定的EV71病毒液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)碔CT1 10Λ傾掉96孔板中的生長(zhǎng)液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗2遍。每個(gè)稀釋度設(shè)4孔，每孔加100 μ I病毒稀釋液。另設(shè)病毒對(duì)照，每孔加病毒原液100 μ I ;細(xì)胞對(duì)照，每孔加DMEM培養(yǎng)基100 μ I。置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞的CPE變化并記錄結(jié)果，一般需要觀察5 7天。按Reed-Muench 法或Karber法計(jì)算結(jié)果得，收獲的SZ98 pro株拯救病毒液的滴度為7. 51gTCID5(l。實(shí)施例7繪制病毒增殖曲線(xiàn)待六孔板vero長(zhǎng)至單層，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞面2次，SZ98 pro 株拯救病毒按Μ. O. I = I接種細(xì)胞，37°C吸附30min，吸棄病毒接種液。然后六孔板每孔補(bǔ)加2ml含2% FBS的維持液，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在接種病毒后的0h、2h、4h、8h、 12h、24h、36h、48h和72h分別收集病毒培養(yǎng)上清和病毒感染的細(xì)胞至EP管中。將病毒液在常溫和_80°C反復(fù)凍融3次，使病毒顆粒充分釋放出來(lái)。4°C 3000rpm離心15min，去除細(xì)胞碎片，上清即為收獲的病毒液。用微量滴定法測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲的病毒液的滴度，繪制病毒的增殖曲線(xiàn)(圖5)。實(shí)施例8利用感染性克隆獲得的拯救病毒篩選抗病毒藥物Vero細(xì)胞接種96孔板2d后長(zhǎng)至單層，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞面2 次。拯救病毒液用含2% FBS的維持液稀釋至100 μ 1，病毒稀釋液中病毒量為100TCID5Q。 將發(fā)酵液或待測(cè)化合物用維持液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行抗EV71活性測(cè)定。每個(gè)樣品設(shè)有藥效孔和毒性孔。藥效孔加入loo μ I病毒稀釋液和loo μ I藥物稀釋液；毒性孔加 Λ 100 μ I藥物稀釋液和100 μ I維持液。另外設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔(加入200 μ I維持液)和病毒對(duì)照孔(加入100 μ I病毒稀釋液和100 μ I維持液)。置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察記錄細(xì)胞的病變效應(yīng)(CPE)，分析藥物抗EV71的活性。培養(yǎng)3d后，細(xì)胞對(duì)照孔無(wú)CPE出現(xiàn)，病毒對(duì)照孔達(dá)100% CPE,以CPE低于50%且無(wú)藥物毒性的化合物為初篩陽(yáng)性結(jié)果，通過(guò)后續(xù)的復(fù)篩進(jìn)一步確定其抗EV71的活性。以利巴韋林和干擾素作為陽(yáng)性藥物對(duì)照，結(jié)果表明濃度為10μ g/ml的利巴韋林和10μ g/ml的干擾素對(duì)拯救病毒增殖的抑制率均達(dá)75%以上。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒71型CDNA感染性克隆，其是通過(guò)反向遺傳操作獲得的腸道病毒71型 SZ98 pro株的cDNA感染性克隆。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的方法，其是以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，通過(guò)RT-PCR得到全長(zhǎng)cDNA克隆。
5.含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，出發(fā)載體為PBR322。
7.含有權(quán)利要求6所述載體的宿主細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其為SZ98pro/pBR322/DH5a，保藏號(hào)CGMCC No.5659。
9.制備腸道病毒71型SZ98pro株的拯救病毒的方法，其特征在于，首先對(duì)腸道病毒 71型SZ98 pro株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)用于構(gòu)建cDNA克隆的引物和酶切位點(diǎn)，通過(guò)引物在基因組cDNA的5’端引入T7啟動(dòng)子，在其3’端引入polyA尾，然后以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到全長(zhǎng)cDNA克隆，酶切線(xiàn)性化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，用體外轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞，獲得拯救病毒。
10.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述腸道病毒71型cDNA感染性克隆在制備抗EV71病毒藥物及疫苗中的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明提供了一種腸道病毒71型cDNA感染性克隆、其構(gòu)建方法及應(yīng)用，其是通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建的我國(guó)EV71流行株的感染性克隆，填補(bǔ)了我國(guó)EV71標(biāo)準(zhǔn)株的空白，為抗EV71病毒藥物的研發(fā)及EV71疫苗的研發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)感染性克隆的基因工程改造，可以更好地闡明病毒的致病機(jī)制，研究抗病毒的策略。
文檔編號(hào)C07K14/085GK102604969SQ20121002890
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者岑山, 張永欣, 金奇 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所