專利名稱：一種重組j亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽白血病病毒感染性克隆領(lǐng)域，具體涉及一種重組J亞群禽白血病病 毒感染性克隆質(zhì)粒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)屬于正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科、D逆轉(zhuǎn)錄病 毒屬(Fauquet et al，2005)。禽白血病(Avian leukosis, AL)是由ALV引起的禽類多種 腫瘤性疾病的總稱，該病在臨床上表現(xiàn)形式多樣，其中包括淋巴細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞性 白血病、成髓細(xì)胞性白血病、髓細(xì)胞性白血病等(Ewert, 1988 ；Coffin, 1992 ；Payne et al， 1997 ；Payne,1998 ；Fadly et al，2003)。20世紀(jì)80年代以前，ALV亞群的變異都很小，主要是六十年代鑒定出的5個(gè)亞 群(Levy，1992)。之后，美國、以色列、法國等國家的肉雞陸續(xù)發(fā)生J亞群禽白血病流行 (Payne，1991)，并迅速擴(kuò)散至世界各國，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為全世界家禽業(yè)所面臨 的一個(gè)主要問題。自從杜巖等(1999)在我國商品肉雞中首次發(fā)現(xiàn)J亞群禽白血病病毒 (subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)以來，各主要養(yǎng)雞地區(qū)均有J亞群禽白血病 病例出現(xiàn)，并且，ALV-J在中國的流行范圍及對(duì)宿主的危害有擴(kuò)大的趨勢(shì)(楊玉瑩，2003 ；Xu et al，2004 ；成子強(qiáng)等，2005 ；邱玉等，2007)。A、B、C、D等亞群禽白血病病毒主要引起雞的淋巴細(xì)胞性白血病(lymphocytic leukosis, LL)，而J亞群禽白血病病毒則主要引起25 55周齡肉雞的髓細(xì)胞性白血病 (myeloid leukosis，ML)，致死率可達(dá) 6% (Payne et al, 1998) ALV-J 原型株 HPRS-103 接種11日齡雞胚可使肉雞出殼后142 143天出現(xiàn)髓細(xì)胞瘤或腎瘤并造成死亡(Payne et al, 1992)。然而，后來從臨床和實(shí)驗(yàn)性的ALV-J病例中分離到的一些急性轉(zhuǎn)化型毒株可迅 速轉(zhuǎn)化骨髓細(xì)胞，其誘發(fā)肉用型雞ML死亡周齡提早到9周齡，且表現(xiàn)出很高的傳染性和發(fā) 病率(Arshad et al，1997)，可見，在ALV-J發(fā)現(xiàn)后的近20年內(nèi)，其致病性發(fā)生了重大的演 化。Chesters (2002)通過研究替換了 A和J亞群的囊膜蛋白的嵌合病毒的致瘤性 發(fā)現(xiàn)，病毒的囊膜蛋白是致瘤譜系的一個(gè)主要決定因素。一般認(rèn)為，骨髓細(xì)胞性白血病是 ALV-J作用于骨髓細(xì)胞系前體細(xì)胞的結(jié)果，因此，ALV-J也常被描述為骨髓細(xì)胞瘤型禽白血 病病毒，實(shí)際上，ALV-J同時(shí)也可引起其他類型的腫瘤，例如淋巴細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成紅 細(xì)胞性白血病等，這可能和病毒與不同品系或個(gè)體宿主細(xì)胞的相互作用以及發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞外整體因素有關(guān)，其中癌基因在特定時(shí)間、特定位點(diǎn)的表達(dá)是造成不同腫瘤發(fā)生的原因。 盡管如此，一直以來，臨床及國內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染引起的J亞群禽白血病病理變化都主要表現(xiàn)為 骨髓細(xì)胞瘤。辛朝安等(2006)首次在中國發(fā)現(xiàn)疑似ALV-J引起的蛋雞血管瘤病變型白血 病，此后各地不斷有ALV-J相關(guān)的蛋雞及肉種雞血管瘤病例出現(xiàn)，證明這一新病變型ALV-J 正在中國雞群中不斷蔓延感染。
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ALV-J的強(qiáng)致病性、高變異性及滅活病毒誘導(dǎo)中和抗體的能力低下嚴(yán)重阻礙了 ALV-J疫苗的研制。E亞群禽白血病病毒(ALV-E)是在雞體內(nèi)極普遍存在的低致病性或無致 病性的內(nèi)源性白血病病毒，研究表明不同亞群ALV的致病力不同的主要原因在于其非編碼 區(qū)LTR =ALV-J LTR起到一種強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的作用，其通過整合在宿主的原癌基因位點(diǎn) 附近促發(fā)原癌基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；此外，ALV的病毒蛋白如囊膜糖蛋白等對(duì) ALV的致病性也有一定的影響。而ALV-E的LTR啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的作用很弱，這是ALV-E 低或無致病力的主要原因，但雞基因組中ALV-E基因大都存在缺陷，不能自發(fā)產(chǎn)生有感染 性的病毒粒子，給ALV-E感染性克隆帶來很大困難。Yang等(2007)發(fā)現(xiàn)LTR可以激活細(xì)胞 的端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性以開啟或增強(qiáng)腫瘤的發(fā)展。此外，腫瘤的產(chǎn)生也可能和ALV-J與其 受體NHEl的相互作用有關(guān)，NHEl受各種的胞內(nèi)或胞外信號(hào)調(diào)控，可提升細(xì)胞分裂和增殖并 且減少細(xì)胞粘著、增加細(xì)胞移行，這些也是腫瘤發(fā)生和侵襲所必需的，因此，ALV-J感染可能 激活NHEl，影響其下游信號(hào)途徑，導(dǎo)致被感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種重組J亞群禽白血病病 毒克隆質(zhì)粒。本發(fā)明另一目的在于提供上述重組J亞群禽白血病病毒克隆質(zhì)粒的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述重組J亞群禽白血病病毒克隆質(zhì)粒的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒，該感染性病毒克隆質(zhì)粒所包含J 亞群禽白血病病毒前病毒全長基因兩端的長末端重復(fù)序列(LTR)被替換為E亞群禽白血病 病毒的LTR，該感染性病毒克隆的基因序列如SEQ ID N0:1所示。本發(fā)明重組J亞群禽白血病病毒感染性病毒克隆的制備方法，是將J亞群禽白血 病前病毒基因兩端的長末端重復(fù)序列替換為E亞群禽白血病前病毒兩端的長末端重復(fù)序 列，得到重組J亞群禽白血病病毒基因序列，并以此構(gòu)建了重組J亞群禽白血病病毒感染性 克隆質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后得到重組J亞群禽白血病病毒；所述J亞群禽白血病病毒前病 毒基因序列如SEQ ID NO :15所示，所述E亞群禽白血病病毒前病毒兩端的長末端重復(fù)序列 如 SEQ ID NO 16 17 所示。本發(fā)明是參考GenBank公開的序列，以及前期獲取的國內(nèi)J亞群禽白血病病毒株 及E亞群禽白血病病毒株的基因組序列，運(yùn)用DNAStar軟件包中MapDraw功能分析保守酶 切位點(diǎn)分布信息，結(jié)合載體PGEM-T Easy和pGEM-7zf(+)的酶切位點(diǎn)情況進(jìn)行比較分析后， 將J亞群禽白血病病毒前病毒基因組分為3個(gè)長2. (Γ3. 5kb的片段，利用Primer Premier 5. 0專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，確保引物擴(kuò)增出的3個(gè)片段間有約200bp的重疊區(qū)域，同 時(shí)還設(shè)計(jì)了針對(duì)E亞群禽白血病病毒的基因組兩端長末端重復(fù)序列的引物，將所設(shè)計(jì)引物 按照PAGE級(jí)別合成。本發(fā)明利用擴(kuò)增得到的J亞群禽白血病病毒前病毒基因組目的片段 中的酶切位點(diǎn)BstEII、MluI、KpnI、EcoRI及E亞群禽白血病病毒前病毒基因組目的片段中 的 MluI、pGEM-T Easy 中的 Sail、pGEM-7zf(+)中的 HindIII、KpnI、EcoRI、Xba I，對(duì)上述 各質(zhì)粒進(jìn)行一系列的酶切連接，最終獲得含有上述重組J亞群禽白血病病毒前病毒全長基 因組的感染性克隆質(zhì)粒。
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本發(fā)明重組J亞群禽白血病病毒克隆質(zhì)粒的具體制備方法如下(1)設(shè)計(jì)引物，引物序列按照先上游引物后下游引物的形式，如SEQ IDN0:2 7所 示，以感染J亞群禽白血病病毒的雞胚成纖維細(xì)胞DNA為模板，擴(kuò)增J亞群禽白血病病毒前 病毒DNA片段按照從左至右的方向如SEQ ID NO :8 10所示，分別單獨(dú)克隆入載體pGEM_T Easy中，得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒A、B和C ；(2)設(shè)計(jì)引物，引物序列按照先上游引物后下游引物的形式，如SEQ ID NO : Γ 4 所示，以攜帶E亞群禽白血病病毒的雞組織DNA為模板擴(kuò)增E亞群禽白血病病毒前病毒DNA 兩端的長末端重復(fù)序列所在片段并分別單獨(dú)克隆入載體PGEM-T Easy中，得到相應(yīng)的重組 質(zhì)粒D和E ；(3)將經(jīng)酶切的A與D、C與E分別連接，得到重組片段F和G ；(4)酶切后的載體pGEM_7zf(+)與G連接，得到的片段再經(jīng)酶切后與F連接，得到 重組質(zhì)粒M ；(5)重組質(zhì)粒M經(jīng)酶切，與B連接，得到重組J亞群禽白血病病毒克隆質(zhì)粒。上述制備方法中，載體pGEM-T Easy可以被具有Sail、MluI單酶切位點(diǎn)，但不含 BstEII、Xba I、EcoRI、HindIII、KpnI 的克隆載體替代。載體pGEM_7zf(+)可以被如下單酶切位點(diǎn)排序分布(正反方向不限)的克隆載 體HindIII、KpnI、EcoRI、Xba I。上述制備方法中，所述A中插入片段上的BstEII與SalI單酶切位點(diǎn)之間間隔 353bp ；C中插入片段上的KpnI與載體上的MluI單酶切位點(diǎn)之間間隔574bp ；D中插入片段 上的BstEII與SalI單酶切位點(diǎn)之間間隔304bp ；E中插入片段上的MluI與載體上的MluI 酶切位點(diǎn)之間間隔51bp。上述制備方法中，步驟(3)中所述C與E的酶切連接方法是C和E分別經(jīng)MluI酶 切后，回收片段，將兩個(gè)片段連接起來，再經(jīng)KpnI、HindIII酶切，得到重組片段G;步驟(4) 中，載體的酶切位點(diǎn)是KpnI和Hindlll，與G連接后的片段的酶切位點(diǎn)是Xba I和EcoRI ； 步驟(5)中所述重組質(zhì)粒M的酶切位點(diǎn)是KpnI和EcoRI。上述制備方法中，所述連接是用T4DNA連接酶連接。上述制備方法中，質(zhì)粒的大量擴(kuò)增是通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，該大 腸桿菌可以是任意一種本領(lǐng)域技術(shù)人員所常用的大腸桿菌，如DH5ci、Τ0Ρ10或JM109細(xì)胞。本發(fā)明重組J亞群禽白血病病毒克隆質(zhì)?？梢杂糜谥苽銳亞群禽白血病病毒疫 苗，還可以為禽白血病病毒的研究提供理論和實(shí)踐依據(jù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)本發(fā)明利用反向遺傳操作技術(shù)將J亞群禽白血病病毒的LTR替換為E亞群禽 白血病病毒的LTR，并成功得到重組病毒克隆質(zhì)粒，為J亞群禽白血病病毒疫苗的研制、J亞 群禽白血病病毒的致病機(jī)理、基因結(jié)構(gòu)以及功能的關(guān)系、病毒的復(fù)制、遺傳變異規(guī)律提供了 借鑒；(2)本發(fā)明利用J亞群禽白血病病毒及E亞群禽白血病病毒前病毒基因組中保 守的酶切位點(diǎn)以及特定克隆載體上的特定酶切位點(diǎn)，加強(qiáng)了本發(fā)明方法的通用性和可重復(fù) 性。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建1. ALV-J與ALV-E前病毒目的基因片段的獲得1. IALV-J與ALV-E前病毒目的基因片段的擴(kuò)增引物參考ALV-J及ALV-E的全基因序列分別設(shè)計(jì)5對(duì)引物對(duì)ALV-J與ALV-E前病毒目 的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在部分引物5’端引入必要的酶切位點(diǎn)，5對(duì)引物序列如SEQ ID NO :2 7、11 14所示。1. 2ALV-J目的基因片段的PCR擴(kuò)增以已感染ALV-J的CEF細(xì)胞DNA為模板，用PrimeSTARTM HS DNA聚合酶(TaKaRa) 及以下3對(duì)引物進(jìn)行ALV-J前病毒DNA目的片段的擴(kuò)增第一對(duì)引物對(duì)的PCR 反應(yīng)條件為98°C 3min ；98°C 15s，55°C 10s，72°C 3min，進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min后置4°C保存。第二對(duì)引物對(duì)的Touch down PCR 反應(yīng)條件為98°C 3min ；98°C 15s，64°C (每個(gè) 循環(huán)降 1°C )10s，72°C 3min 進(jìn)行 9 個(gè)循環(huán)；98°C 15s，55°C 10s，72°C 3min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)； 72°C延伸8min后置4°C保存。第三對(duì)引物對(duì)的PCR反應(yīng)條件為98 V 3min ；98 V 15s，69 V (每個(gè)循環(huán)降 rc )10s,72°C 3min 進(jìn)行 18 個(gè)循環(huán)；98°C 15s，51°C 10s，72°C 3min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延 伸Smin后置4°C保存。1. 3ALV-E目的基因片段的PCR擴(kuò)增 以感染ALV-E的SPF雞組織DNA為模板，利用PrimeSTARTM HS DNA聚合酶 (TaKaRa)及以下2對(duì)引物擴(kuò)增ALV-E前病毒DNA目的片段兩對(duì)引物的PCR反應(yīng)條件為98°C 3min ；98°C 15s，68°C (每個(gè)循環(huán)降1°C ) 10s， 72°C 3min 進(jìn)行 15 個(gè)循環(huán)；98°C 15s，53°C 10s，72°C lmin，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 8min 后置4°C保存。1. 4各目的基因片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建各PCR產(chǎn)物分別利用TIANGEN 超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化后，利 用ExTaqTM DNA聚合酶(TaKaRa)進(jìn)行加A尾以便進(jìn)行T-A克隆，加A尾反應(yīng)條件為 72°C45min。之后通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。參照普洛麥格公司(Promega) pGEM -T EASY載體的使用說明書進(jìn)行目的片段與載體的連接。IOyL連接體系中 包括以下各組分2XRapid Ligation Buffer 5 μ L, pGEM -T Easy Vector (50ng/ UL)0. 5yL,目的DNA 3. 5 μ L，T4DNA連接酶1 μ L。各組分混勻后，16°C連接2h，轉(zhuǎn)化DH5 α 感受態(tài)宿主菌，通過菌液PCR將初步鑒定為陽性的克隆用自動(dòng)序列測(cè)序儀測(cè)序。將測(cè)序結(jié) 果通過基因分析軟件包DNASTAR中的EditSeq與SeqMan程序進(jìn)行序列比對(duì)和拼接。鑒定 為按正確方向插入上述產(chǎn)物片段的陽性質(zhì)粒分別命名為Α、B、C、D和Ε，其中A與D分別以 插入片段上的BstEII與SalI單酶切位點(diǎn)之間間隔353bp和304bp為正確插入陽性質(zhì)粒；C 以插入片段上的KpnI與載體上的MluI單酶切位點(diǎn)之間間隔574bp為正確插入陽性質(zhì)粒；E 以分別位于插入片段與載體上的兩個(gè)MluI酶切位點(diǎn)之間間隔51bp為正確插入陽性質(zhì)粒。
2感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建2. 1重組F片段的構(gòu)建A經(jīng)BstEII與SalI雙酶切，回收約5. 3kb的載體片段，命名為rCHNA ；D經(jīng)BstEII 與SalI雙酶切，回收約300bp的載體片段，命名為rE5LTR。rCHNA與rELTR利用T4DNA連 接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，將陽性克隆菌液用自動(dòng)序列測(cè)序儀測(cè)序鑒定， 得到的陽性重組質(zhì)粒，先后經(jīng)Xba I與EcoRI酶切，回收約2. 5kb的片段，命名為F。2. 2重組G片段的構(gòu)建C經(jīng)MluI酶切回收約2. 6kb的載體片段，命名為rCHNC ；E經(jīng)MluI酶切回收約 3. 3kb的載體片段，命名為rE3LTR。rCHNC與rE3LTR利用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，最終得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，插入目的片段上的的KpnI與 HindIII單酶切位點(diǎn)間隔2353bp為正確插入陽性質(zhì)粒，陽性質(zhì)粒先后經(jīng)KpnI與HindIII 雙酶切，回收約2. 4kb的片段，命名為G。2. 3L克隆的構(gòu)建pGEM-7zf (+)先后經(jīng)KpnI與HindIII雙酶切，回收約3. Okb的載體片段與G利用 T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序鑒定最終得到的陽性重組質(zhì)粒 先后經(jīng)Xba I與EcoRI酶切，回收約5. 3kb的片段與F利用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序鑒定最終得到的陽性重組質(zhì)粒命名為Μ。M經(jīng)KpnI與EcoRI 雙酶切，回收約7. Skb的片段；B經(jīng)KpnI與EcoRI雙酶切，回收約2. 7kb的片段，兩個(gè)片段 利用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測(cè)序鑒定最終得到的陽性重組 質(zhì)粒命名為L。本實(shí)施例所涉及的雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化等步驟，均采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作。實(shí)施例2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與病毒收獲1.轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒及細(xì)胞的準(zhǔn)備參照OMEGA去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說明書，具體如下用1.5mL離心管收集 3-5mL 菌液，8000r/min 離心 3min。棄去上清液,加入 250 μ L SolutionI 液(含 RNase Α)， 渦旋振蕩使菌體重懸混勻；然后加入250yL Solution II液，輕柔顛倒混勻6次；若此時(shí)溶 液已比較澄清，則立即加入350 μ L Solution III液，若仍比較混濁，可作用2 5min后加入 350 μ L Solution III液，顛倒混勻6次。12000r/min離心15min。將上清液轉(zhuǎn)移到離心柱 中，10000r/min離心30s，棄去收集管中的濾液。加入500 μ L HB Buffer于柱中，IOOOOr/ min離心30s，棄收集管中的濾液。加入700 μ L DNA Washing Buffer洗滌，10000r/min離 心30s，棄收集管中的濾液，重復(fù)此步驟一次后，將離心柱空離心lmin。取下離心柱置于滅 菌的1. 5mL EP離心管中，加入適量的TE Buffer，室溫靜止5min，10000r/min離心lmin，洗 脫可疑重組質(zhì)粒DNA，直接測(cè)序或-20°C備用。在轉(zhuǎn)染前1天按常規(guī)方法制作DF-I細(xì)胞或雞胚成纖維細(xì)胞CEF，控制每孔的細(xì)胞 數(shù)量，使得細(xì)胞培養(yǎng)板中各孔中的細(xì)胞在第2天轉(zhuǎn)染時(shí)可長滿約90%。2.轉(zhuǎn)染參考invitrogen 公司Lipfectamine 2000說明書的方法，按照6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 的規(guī)格，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔對(duì)應(yīng)4 μ g的感染性克隆質(zhì)粒L和10 μ L的Lipfectamine 2000， 將其分別與250 μ L的Opti-MEM IMedium輕輕混合；室溫孵育5min后，繼續(xù)將兩混合液輕輕混合在一起，室溫孵育20min后加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中使混合液完全覆蓋細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染的 細(xì)胞置于37°C的CO2培養(yǎng)箱中孵育。3.病毒的收獲轉(zhuǎn)染24h后，棄上清，加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)生長，待細(xì) 胞活力恢復(fù)后用含1 %胎牛血清的DMEM作為維持液，轉(zhuǎn)染后第6天將細(xì)胞凍融一次即得到 含有致弱的J亞群禽白血病病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物，分裝置于-70°C冰箱中保存?zhèn)溆?。本?shí)施例所涉及的細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染等步驟，均采用本領(lǐng)域的常規(guī)操作。一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒及其制備方法和應(yīng)用序列表SEQUENCE LISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120> 一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒及其制備方法和應(yīng)用<130><160>17<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>10506<212>DNA<213>人工序列<400>1gggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcctctagatgtagtcaaatagagccagaggca60
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2權(quán)利要求
一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒，其特征在于所述病毒感染性克隆質(zhì)粒的基因序列如SEQ ID NO1所示。
2.權(quán)利要求1所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒的制備方法，其特征在于 所述制備方法如下(1)設(shè)計(jì)引物，引物序列如SEQID NO :2 7所示，以感染J亞群禽白血病病毒的雞胚成 纖維細(xì)胞DNA為模板，擴(kuò)增J亞群禽白血病病毒前病毒DNA片段如SEQ ID NO :8 10所示， 分別單獨(dú)克隆入載體中，得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒A、B和C ；(2)設(shè)計(jì)引物，引物序列如SEQID NO :1廣14所示，以攜帶E亞群禽白血病病毒的雞組 織DNA為模板擴(kuò)增E亞群禽白血病病毒前病毒DNA兩端的長末端重復(fù)序列所在片段并分別 單獨(dú)克隆入載體中，得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒D和E ；(3)將經(jīng)酶切的A與D、C與E分別連接，得到重組片段F和G；(4)酶切后的載體與G連接，得到的片段再經(jīng)酶切后與F連接，得到重組質(zhì)粒M；(5)重組質(zhì)粒M經(jīng)酶切，與B連接，得到重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒的制備方法，其特征 在于所述A中插入片段上的BstEII與SalI單酶切位點(diǎn)之間間隔353bp ；C中插入片段上的 KpnI與載體上的MluI單酶切位點(diǎn)之間間隔574bp ；D中插入片段上的BstEII與SalI單酶 切位點(diǎn)之間間隔304bp ；E中插入片段上的MluI與載體上的MluI酶切位點(diǎn)之間間隔51bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒的制備方法，其特征 在于步驟(3)中所述A與D的酶切連接方法是A和D分別經(jīng)BstEII與SalI雙酶切，回收 片段，將兩個(gè)片段連接起來，再經(jīng)Xba I>EcoRI酶切，得到重組片段F。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒的制備方法，其特征 在于步驟(3)中所述C與E的酶切連接方法是C和E分別經(jīng)MluI酶切后，回收片段，將兩 個(gè)片段連接起來，再經(jīng)KpnI、HindIII酶切，得到重組片段G ；步驟(4)中，載體的酶切位點(diǎn) 是KpnI和Hindlll，與G連接后的片段的酶切位點(diǎn)是Xba I和EcoRI ；步驟(5)中所述重組 質(zhì)粒M的酶切位點(diǎn)是KpnI和EcoRI。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒的制備方法，其特 征在于步驟(1)和(2)中所述載體為具有Sail、MluI單酶切位點(diǎn)，但不含BstEII、Xba I、 EcoRI、HindIII、KpnI 的克隆載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒的制備方法，其特 征在于步驟(4)中所述載體為具有如下單酶切位點(diǎn)排序分布的克隆載體HindIII、KpnI、 EcoRI、Xba I。
8.根據(jù)權(quán)利要求3 7中任意一條權(quán)利要求所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì) 粒的制備方法，其特征在于所述連接是用T4DNA連接酶連接。
9.權(quán)利要求1所述重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒的應(yīng)用，其特征在于所述 重組J亞群禽白血病病毒作為一種帶人工標(biāo)記的J亞群禽白血病病毒弱毒，用于研究禽白 血病病毒的復(fù)制、致弱、免疫保護(hù)機(jī)制以及J亞群禽白血病病毒弱毒活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明是將J亞群禽白血病病毒前病毒基因兩端的長末端重復(fù)序列替換為E亞群禽白血病病毒前病毒基因兩端的長末端重復(fù)序列，將其插入載體中，以此構(gòu)建了重組J亞群禽白血病病毒感染性克隆質(zhì)粒，得到序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明重組J亞群禽白血病病毒克隆質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染得到的重組病毒株的復(fù)制能力和致病性明顯弱于自然的J亞群禽白血病病毒，但可表達(dá)J亞群禽白血病病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，具備J亞群禽白血病病毒的抗原性，可被J亞群禽白血病病毒特異性單克隆抗體JE9所識(shí)別。本發(fā)明病毒克隆質(zhì)粒為制備J亞群禽白血病病毒弱毒性活疫苗提供了材料和方法借鑒。
文檔編號(hào)A61P31/14GK101899465SQ200910213800
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者廖明, 張賀楠, 曹偉勝, 賴漢漳, 辛朝安 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)